Name: microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00
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Nous remercions Mme Seshmalini Srinivasan, M. Stephen Butler et Mme Pamela Spellman pour leur aide expérimentale et Mme Dana Youssef pour l’édition du manuscrit. Le soutien financier de l’USAMRDC est vivement apprécié. La Fondation genevoise a contribué à ce travail et a été soutenue par des fonds de la Direction III du domaine de recherche en médecine militaire et opérationnelle via le US Army Research Office.
Démenti:
Le matériel a été examiné par le Walter Reed Army Institute of Research. Il n’y a pas d’objection à sa présentation et/ou à sa publication. Les opinions ou affirmations contenues dans le présent document sont les opinions privées de l’auteur et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant de véritables opinions du Département de l’Armée ou du Département de la Défense. La recherche a été menée dans le cadre d’un protocole d’utilisation des animaux approuvé dans une installation accréditée par l’AAALAC, conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences avec des animaux, et adhère aux principes énoncés dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publication du CNRC, édition 2011.

Les procédures de manipulation et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément aux directives européennes, nationales et institutionnelles en matière de soins aux animaux. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre de recherche sur la santé environnementale de l’armée américaine, maintenant Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) et réalisées dans un établissement accrédité par l’Association ...

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+rat+brain+for+RNA+or+protein+extraction+from+specific+brain+region.">Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).</li><li>Rajmohan, V., Mohandas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbic+system.">The limbic system.</a> Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).</li></ol>

Le cerveau des mammifères est un organe complexe composé d’un ensemble de cellules morphologiquement distinctes et fonctionnellement uniques avec diverses signatures moléculaires et de multiples régions qui remplissent des fonctions spécialisées et discrètes. La procédure de dissection décrite ici peut avoir plusieurs objectifs en fonction des exigences du laboratoire. Dans notre laboratoire, nous avons évalué la transcription dans plusieurs régions du cerveau recueillies chez des souris exposées au SSPT c...

Le cerveau, ainsi que la moelle épinière et la rétine, constituent le système nerveux central qui exécute des comportements complexes, contrôlés par des types de cellules spécialisées, positionnées avec précision et en interaction dans tout le corps1. Le cerveau est un organe complexe avec des milliards de neurones interconnectés et de glies avec des circuits précis remplissant de nombreuses fonctions. C’est une structure bilatérale avec deux lobes distincts et divers composants cellulaires2. La moelle épinière relie le cerveau au monde extérieur et est protégée par les os, les méninges et le liquide céphalorachidien et achemine les messages vers et depuis le cerveau 2,3,4. La surface du cerveau, le cortex cérébral, est inégale et possède des plis distincts, appelés gyri, et des rainures, appelées sulci, qui séparent le cerveau en centres fonctionnels5. Le cortex est lisse chez les mammifères avec un petit cerveau 6,7. Il est important de caractériser et d’étudier l’architecture du cerveau humain afin de comprendre les troubles liés aux différentes régions du cerveau, ainsi que ses circuits fonctionnels. La recherche en neurosciences s’est développée ces dernières années et diverses méthodes expérimentales sont utilisées pour étudier la structure et la fonction du cerveau. Les développements dans les domaines de la biologie moléculaire et systémique ont inauguré une nouvelle ère d’exploration de la relation complexe entre les structures cérébrales et le fonctionnement des molécules. De plus, la biologie moléculaire, la génétique et l’épigénétique se développent rapidement, ce qui nous permet de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans le fonctionnement des systèmes. Ces analyses peuvent être effectuées sur une base beaucoup plus localisée, pour aider à cibler l’investigation et le développement de thérapies plus efficaces.
Le cerveau des mammifères est structurellement défini en régions discrètes clairement identifiables; Cependant, les complexités fonctionnelles et moléculaires de ces structures discrètes ne sont pas encore clairement comprises. La nature multidimensionnelle et multicouche du tissu cérébral rend ce paysage difficile à étudier au niveau fonctionnel. De plus, le fait que plusieurs fonctions soient assurées par la même structure et vice versa complique encore la compréhension du cerveau8. Il est essentiel que l’approche expérimentale exécutée pour la caractérisation structurelle et fonctionnelle des régions cérébrales utilise des méthodologies de recherche précises pour parvenir à une cohérence dans l’échantillonnage pour corréler l’architecture neuroanatomique avec la fonction. La complexité du cerveau a été récemment expliquée en utilisant le séquençage unicellulaire 9,10 tel que le gyrus temporal du cerveau humain qui est composé de 75 types cellulaires distincts 11. En comparant ces données à celles d’une région analogue du cerveau de la souris, l’étude révèle non seulement des similitudes dans leur architecture et leurs types de cellules, mais présente également les différences. Pour démêler les mécanismes complexes, il est donc important d’étudier diverses régions du cerveau avec une précision totale. Les structures et la fonction conservées entre un cerveau humain et un cerveau de souris permettent l’utilisation d’une souris comme substitut préliminaire pour élucider la fonction cérébrale humaine et les résultats comportementaux.
Avec l’avancement des approches de biologie des systèmes, l’obtention d’informations à partir de régions cérébrales discrètes chez les rongeurs est devenue une procédure clé dans la recherche en neurosciences. Alors que certains protocoles tels que la microdissection par capture laser12 peuvent être coûteux, les protocoles mécaniques sont peu coûteux et réalisés à l’aide d’outils couramment disponibles13,14. Nous avons utilisé plusieurs régions du cerveau pour des tests transcriptomiques15 et avons développé une procédure pratique et rapide pour disséquer les régions cérébrales d’intérêt de souris étape par étape en peu de temps. Une fois disséqués, ces échantillons peuvent être stockés immédiatement dans des conditions froides pour préserver les acides nucléiques et les protéines de ces tissus. Notre approche peut être réalisée plus rapidement, ce qui conduit à une efficacité élevée et permet moins de risques de détérioration des tissus. En fin de compte, cela augmente les chances de générer des expériences reproductibles de haute qualité utilisant des tissus cérébraux.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td>5.5&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6763</td>
			<td>5.5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6703</td>
			<td>4.75&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td>4.75&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved Sharp/Sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula, radius and tapered flat ends</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stainless steel mirror finish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 6.5&#34;</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6846</td>
			<td>curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth 2mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur (optional)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8321 many styles to choose</td>
			<td>Lempert Rongeur 6.5&#34; 2X8mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super fine forceps Inox</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-4955</td>
			<td>tip size 0.025 X 0.005 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A magnification visor</td>
			<td>Penn Tool Col</td>
			<td>40-178-6</td>
			<td>2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection cold plate</td>
			<td>Cellpath.com</td>
			<td>JRI-0100-00A</td>
			<td>Iceberg cold plate &#38; base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps, full curve extra delicate</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5138</td>
			<td>0.5 mm Tip 4&#8221; (10 cm) long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843 (repeated above)</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades (especially #11)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11 (repeated above)</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>MS-SQRD9-4</td>
			<td>Double Ended Spatula Square AND Round End</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160 (repeated above)</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions

Le cerveau est le centre de commande du système nerveux des mammifères et un organe doté d’une énorme complexité structurelle. Protégé à l’intérieur du crâne, le cerveau est constitué d’une enveloppe externe de matière grise sur les hémisphères connue sous le nom de cortex cérébral. Sous cette couche résident de nombreuses autres structures spécialisées qui sont essentielles pour de multiples phénomènes importants pour l’existence. L’acquisition d’échantillons de régions cérébrales macroscopiques spécifiques nécessite des étapes de dissection rapides et précises. Il est entendu qu’au niveau microscopique, de nombreuses sous-régions existent et traversent probablement les frontières régionales arbitraires que nous imposons aux fins de cette dissection.
Les modèles murins sont couramment utilisés pour étudier les fonctions cérébrales humaines et les maladies. Les changements dans les schémas d’expression génique peuvent être limités à des zones spécifiques du cerveau ciblant un phénotype particulier en fonction de l’état malade. Ainsi, il est d’une grande importance d’étudier la régulation de la transcription par rapport à son organisation structurelle bien définie. Une compréhension complète du cerveau nécessite d’étudier des régions cérébrales distinctes, de définir des connexions et d’identifier les différences clés dans les activités de chacune de ces régions du cerveau. Une compréhension plus complète de chacune de ces régions distinctes pourrait ouvrir la voie à des traitements nouveaux et améliorés dans le domaine des neurosciences. Ici, nous discutons d’une méthodologie étape par étape pour disséquer le cerveau de la souris en seize régions distinctes. Dans cette procédure, nous nous sommes concentrés sur l’ablation et la dissection cérébrale de souris mâles C57Bl / 6J (6-8 semaines) dans plusieurs régions en utilisant des repères neuroanatomiques pour identifier et échantillonner des régions cérébrales discrètes fonctionnellement pertinentes et comportementales. Ce travail aidera à établir une base solide dans le domaine des neurosciences, menant à des approches plus ciblées dans la compréhension plus profonde de la fonction cérébrale.

Notre compréhension de la structure et de la fonction complexes du cerveau évolue et s’améliore rapidement. Le cerveau contient plusieurs régions distinctes et la construction d’une carte moléculaire peut nous aider à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau. Dans cet article de méthode, nous avons discuté de la dissection du cerveau de la souris en plusieurs régions distinctes (tableau 1). Dans ce protocole, les structures sont identifiées en fonction des repères critiques et sont ob...

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Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

Nous présentons un protocole pratique, étape par étape, rapide pour l’ablation du cerveau de souris et la dissection de régions discrètes à partir de tissus cérébraux frais. L’obtention de régions cérébrales pour l’analyse moléculaire est devenue une routine dans de nombreux laboratoires de neurosciences. Ces régions du cerveau sont immédiatement congelées pour obtenir des données transcriptomiques de haute qualité pour l’analyse au niveau du système.

Microdissection du cerveau de souris en régions fonctionnellement et anatomiquement différentes

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

L’étude de régions cérébrales distinctes est un tremplin vers la compréhension de la complexité moléculaire et structurelle du cerveau. Ce protocole décrit une dissection systématique du cerveau de souris pour isoler des régions cérébrales distinctes. Du point de vue de l’anatomie du cerveau, il s’agit d’une approche descendante qui peut être facilement reproduite.Les avantages de ce protocole sont doubles. Tout d’abord, cette approche offre l’occasion de comprendre les fondements moléculaires de petites régions cérébrales critiques. Deuxièmement, l’ensemble de ce processus de dissection est suffisamment court pour assurer la préservation de l’intégrité moléculaire, une condition préalable essentielle aux essais rétrospectifs et moléculaires.Cette procédure implique de la pratique et une manipulation délicate. Le timing est très crucial ici pour maintenir les repères structurels, et peut être réalisé avec une formation et une pratique appropriées. Seid Muhie, chimiste de recherche et bioinformaticien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure d’ablation du cerveau de souris.James Meyerhoff, un neuroscientifique de notre laboratoire, fera une démonstration plus poussée de la procédure de dissection cérébrale de souris. Pour commencer, nettoyez et retirez la peau pour une bonne prise en main. Serrez le maxillaire de la tête décapitée avec un hémostatique et utilisez une gaze pour refléter le cuir chevelu de manière rostrale.Insérez les fins ciseaux incurvés dans le foramen magnum pour séparer les méninges adhérentes. Insérez ensuite les ciseaux à l’ouverture de la base du crâne où passe la moelle épinière avec la lame pointant verticalement, mais parallèlement et appuyant contre la surface interne de l’os de la plaque basale, en tournant la lame de 45 degrés vers le côté gauche, puis vers le côté droit. Enlevez l’os occipital dans l’os intrapariétal pour exposer le cervelet.Avancez les ciseaux rostralement le long de la suture sagittale moyenne jusqu’au bregma, et coupez-le en le soulevant vers le haut pour éviter la lacération du cortex cérébral. Au fur et à mesure que les os pariétaux sont soulevés, identifiez et coupez les attaches méningées restantes. Faites deux coupes parallèles dans le plan sagittal et retirez les fragments de l’os frontal, en évitant de lacéré la surface du cerveau.Tout en coupant les attaches méningées et les nerfs crâniens, inverser le crâne pour permettre à la gravité d’aider à l’élimination du cerveau dans une petite tasse préremplie de solution saline. Gardez la bulle auditive intacte pour que l’anatomie hypophysaire soit identifiable. Faites une coupe parasaggitale extrêmement petite des deux côtés dans la crête de la tente membraneuse qui maintient l’hypophyse à sa place, et soulevez le lobe postérieur de l’hypophyse avec une pince ultra fine.Faites une coupe sagittale entre les marges latérales du lobe antérieur de l’hypophyse dans le nerf trijumeau le plus proche, puis soulevez le lobe antérieur de l’hypophyse. Dirigez la source de lumière blanche sur le tissu. Placez le cerveau sur un bloc en acier inoxydable pré-refroidi et gardez le bloc froid en l’entourant de glace dans une solution saline glacée.Humidifiez périodiquement le tissu avec une solution saline glacée pour préserver les structures. Positionnez le cerveau de telle sorte que les cortex cérébraux soient orientés vers le haut. À l’aide de petites pinces incurvées, retirez le cervelet.En utilisant l’approche dorsale, glissez les lames fermées d’une petite pince incurvée sous le corps calleux et écartez-le doucement pour rétracter le néocortex bilatéralement afin de préserver les repères médians critiques. Éventuellement, des structures telles que le chiasme optique, l’hypothalamus, les bulbes olfactifs, le bulbe rachidien, l’hypophyse et le pont pontin seraient visibles. Essayez de séparer les hémisphères.Retournez le site ventral cérébral vers le haut et faites une coupe sagittale moyenne à partir du dos entre les bulbes olfactifs dans les hémisphères cérébraux. Retirez la moelle, puis séparez doucement les deux hémisphères. Ensuite, faites une coupe coronale à la marge intérieure des étangs pour obtenir le cerveau postérieur et séparer la moelle à la marge postérieure des étangs.Retournez le tissu cérébral pour une séparation minutieuse des deux hémisphères cérébraux. Retirez le bulbe olfactif à cette étape. Faire une coupe coronale d’un millimètre antérieur au genre du corps calleux, et retirer les bulbes olfactifs accessoires, puis séparer le cortex préfrontal médial et latéral.Couper partiellement horizontalement ou coronalement à travers la partie transversale de la commissure antérieure à partir de la ligne médiane sous la corne antérieure du ventricule latéral pour libérer le noyau septal dorsalement et le striatum ventral ventralement. Retirez la petite quantité du cortex de la surface latérale pour enlever le succombe du noyau et le tubercule olfactif. Séparez la partie rostrale du corps striatum du cortex sus-jacent via un scalpel incurvé coupé juste à l’extérieur de la capsule externe.Identifiez les noyaux septaux ou septum et isolez-les de cette section. Faites une coupe incurvée pour séparer l’hypothalamus à cette étape. Cela se fera en utilisant une coupe coronale partielle postérieure aux corps mamillaires ne s’étendant que latéralement jusqu’au sillon hypothalamique.Libérez ensuite la section transversale de l’hypothalamus avec une coupe parasagittale le long du sillon hypothalamique. Inversez le ventricule latéral pour révéler des connexions intralimbiques supplémentaires dans les composants restants du système limbique. Sur la partie interne du cortex interne, une structure en éventail est observée après l’ouverture du ventricule.Utilisez la structure en éventail dans le cortex entorhinal pour définir les marges aux fins de la dissection, puis identifiez et supprimez l’amygdale, le cortex entorhinal, le cortex cingulaire postérieur et l’hippocampe. Confirmer l’identification du thalamus par visualisation de la strie médullaire sur sa surface dorsale s’étendant dans le plan cortical rostral médian. Séparez complètement le thalamus du mésencéphale par une coupe coronale.Ce protocole peut être utilisé pour l’ablation immédiate du cerveau du crâne, suivie d’une dissection. Les tissus disséqués peuvent être conservés et traités ultérieurement en fonction des exigences de l’étude. L’ARN extrait de plusieurs tissus disséqués peut être dosé pour l’expression génique.Les résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant des cerveaux récoltés qui ont été stockés à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs mois avant l’extraction de l’ARN. Des régions cérébrales distinctes ainsi que des données sur le poids ont été recueillies dans le cadre du modèle de stress social exposé à l’agresseur du SSPT. Les concentrations d’ARN et les lectures spectrophotométriques sont indiquées ici.Lorsque vous suivez ce protocole, assurez-vous que les tissus sont refroidis en tout temps en gardant le cerveau sur un bloc d’acier glacé et en aspergeant périodiquement le tissu avec une solution saline glacée. Une fois que les tissus sont collectés et immédiatement congelés, ils peuvent être utilisés pour des tests tels que la transcriptomique, la métabolomique et la protéomique à un moment ultérieur.

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Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

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Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

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