Name: microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00
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Ringraziamo la signora Seshmalini Srinivasan, il signor Stephen Butler e la signora Pamela Spellman per l'assistenza sperimentale e la signora Dana Youssef per la revisione del manoscritto. Il sostegno finanziario da parte di USAMRDC è riconosciuto con gratitudine. La Fondazione di Ginevra ha contribuito a questo lavoro ed è stata sostenuta da fondi della Direzione III dell'Area di Ricerca di Medicina Militare e Operativa tramite l'Ufficio di Ricerca dell'Esercito degli Stati Uniti.
Disconoscimento:
Il materiale è stato esaminato dal Walter Reed Army Institute of Research. Non vi sono obiezioni alla sua presentazione e/o pubblicazione. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono opinioni private dell'autore e non devono essere interpretate come ufficiali o come riflettenti le vere opinioni del Dipartimento dell'Esercito o del Dipartimento della Difesa. La ricerca è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato per l'uso degli animali in una struttura accreditata AAALAC in conformità con l'Animal Welfare Act e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicazione NRC, edizione 2011.

La manipolazione degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Centro dell'esercito americano per la ricerca sulla salute ambientale ora Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) ed eseguiti in una struttura accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Labora...

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+rat+brain+for+RNA+or+protein+extraction+from+specific+brain+region.">Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).</li><li>Rajmohan, V., Mohandas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limbic+system.">The limbic system.</a> Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).</li></ol>

Il cervello dei mammiferi è un organo complesso composto da una serie di cellule morfologicamente distinte e funzionalmente uniche con diverse firme molecolari e regioni multiple che svolgono funzioni specializzate e discrete. La procedura di dissezione qui riportata può avere più obiettivi a seconda delle esigenze del laboratorio. Nel nostro laboratorio abbiamo valutato la trascrizione in più regioni del cervello raccolte da topi esposti a PTSD come lo stress16 . Vorremmo studiare ulteriormen...

Il cervello, insieme al midollo spinale e alla retina, comprende il sistema nervoso centrale che esegue comportamenti complessi, controllati da tipi di cellule specializzate, posizionate con precisione e interagenti in tutto il corpo1. Il cervello è un organo complesso con miliardi di neuroni interconnessi e glia con circuiti precisi che svolgono numerose funzioni. È una struttura bilaterale con due lobi distinti e diversi componenti cellulari2. Il midollo spinale collega il cervello al mondo esterno ed è protetto da ossa, meningi e liquido cerebrospinale e indirizza i messaggi da e verso il cervello 2,3,4. La superficie del cervello, la corteccia cerebrale, è irregolare e presenta pieghe distinte, chiamate gyri, e solchi, chiamati solchi, che separano il cervello in centri funzionali5. La corteccia è liscia nei mammiferi con un piccolo cervello 6,7. È importante caratterizzare e studiare l'architettura del cervello umano al fine di comprendere i disturbi legati alle diverse regioni del cervello, nonché i suoi circuiti funzionali. La ricerca neuroscientifica si è espansa negli ultimi anni e una varietà di metodi sperimentali vengono utilizzati per studiare la struttura e la funzione del cervello. Gli sviluppi nel campo della biologia molecolare e a livello di sistema hanno inaugurato una nuova era di esplorazione della complessa relazione tra le strutture cerebrali e il funzionamento delle molecole. Inoltre, la biologia molecolare, la genetica e l'epigenetica si stanno rapidamente espandendo, permettendoci di far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi sottostanti coinvolti nel funzionamento dei sistemi. Queste analisi possono essere effettuate su una base molto più localizzata, per aiutare a indirizzare la ricerca e lo sviluppo di terapie più efficaci.
Il cervello dei mammiferi è strutturalmente definito in regioni discrete chiaramente identificabili; Tuttavia, le complessità funzionali e molecolari di queste strutture discrete non sono ancora chiaramente comprese. La natura multidimensionale e multistrato del tessuto cerebrale rende questo paesaggio difficile da studiare a livello funzionale. Inoltre, il fatto che più funzioni siano eseguite dalla stessa struttura e viceversa complica ulteriormente la comprensione del cervello8. È fondamentale che l'approccio sperimentale eseguito per la caratterizzazione strutturale e funzionale delle regioni cerebrali utilizzi precise metodologie di ricerca per ottenere coerenza nel campionamento per correlare l'architettura neuroanatomica con la funzione. La complessità del cervello è stata recentemente spiegata utilizzando il sequenziamento a singola cellula 9,10 come il giro temporale del cervello umano che è composto da 75 tipi di cellule distinte 11. Confrontando questi dati con quelli provenienti da una regione analoga del cervello del topo, lo studio non solo rivela somiglianze nella loro architettura e nei tipi di cellule, ma presenta anche le differenze. Per svelare i complessi meccanismi, è quindi importante studiare diverse regioni del cervello con la massima precisione. Le strutture e le funzioni conservate tra un cervello umano e quello di topo consentono l'uso di un topo come surrogato preliminare per chiarire la funzione cerebrale umana e i risultati comportamentali.
Con il progresso degli approcci di biologia dei sistemi, ottenere informazioni da regioni cerebrali discrete nei roditori è diventata una procedura chiave nella ricerca neuroscientifica. Mentre alcuni protocolli come la microdissezione a cattura laser12 possono essere costosi, i protocolli meccanici sono economici ed eseguiti utilizzando strumenti comunemente disponibili13,14. Abbiamo utilizzato più regioni cerebrali per i saggi trascrittomici15 e abbiamo sviluppato una procedura pratica e rapida per sezionare le regioni cerebrali di topo di interesse in modo passo-passo in breve tempo. Una volta sezionati, questi campioni possono essere conservati immediatamente in condizioni fredde per preservare gli acidi nucleici e le proteine di questi tessuti. Il nostro approccio può essere eseguito più velocemente portando ad un'elevata efficienza e consentendo meno possibilità di deterioramento dei tessuti. Questo in definitiva, aumenta le possibilità di generare esperimenti di alta qualità e riproducibili utilizzando tessuti cerebrali.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td>5.5&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6763</td>
			<td>5.5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6703</td>
			<td>4.75&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td>4.75&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved Sharp/Sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula, radius and tapered flat ends</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stainless steel mirror finish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 6.5&#34;</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6846</td>
			<td>curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth 2mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur (optional)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8321 many styles to choose</td>
			<td>Lempert Rongeur 6.5&#34; 2X8mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super fine forceps Inox</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-4955</td>
			<td>tip size 0.025 X 0.005 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A magnification visor</td>
			<td>Penn Tool Col</td>
			<td>40-178-6</td>
			<td>2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection cold plate</td>
			<td>Cellpath.com</td>
			<td>JRI-0100-00A</td>
			<td>Iceberg cold plate &#38; base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps, full curve extra delicate</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5138</td>
			<td>0.5 mm Tip 4&#8221; (10 cm) long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843 (repeated above)</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades (especially #11)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11 (repeated above)</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>MS-SQRD9-4</td>
			<td>Double Ended Spatula Square AND Round End</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160 (repeated above)</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions

Il cervello è il centro di comando per il sistema nervoso dei mammiferi e un organo con un'enorme complessità strutturale. Protetto all'interno del cranio, il cervello è costituito da un rivestimento esterno di materia grigia sopra gli emisferi noto come corteccia cerebrale. Sotto questo strato risiedono molte altre strutture specializzate che sono essenziali per molteplici fenomeni importanti per l'esistenza. L'acquisizione di campioni di specifiche regioni cerebrali lorde richiede passaggi di dissezione rapidi e precisi. Resta inteso che a livello microscopico, esistono molte sottoregioni e probabilmente attraversano i confini regionali arbitrari che imponiamo ai fini di questa dissezione.
I modelli murini sono abitualmente utilizzati per studiare le funzioni e le malattie del cervello umano. I cambiamenti nei modelli di espressione genica possono essere limitati a specifiche aree cerebrali mirate a un particolare fenotipo a seconda dello stato patologico. Pertanto, è di grande importanza studiare la regolazione della trascrizione rispetto alla sua organizzazione strutturale ben definita. Una comprensione completa del cervello richiede lo studio di regioni cerebrali distinte, la definizione di connessioni e l'identificazione delle differenze chiave nelle attività di ciascuna di queste regioni cerebrali. Una comprensione più completa di ciascuna di queste regioni distinte può aprire la strada a trattamenti nuovi e migliori nel campo delle neuroscienze. Qui, discutiamo una metodologia passo-passo per sezionare il cervello del topo in sedici regioni distinte. In questa procedura, ci siamo concentrati sulla rimozione cerebrale del topo maschio C57Bl / 6J (6-8 settimane) e sulla dissezione in più regioni utilizzando punti di riferimento neuroanatomici per identificare e campionare regioni cerebrali discrete funzionalmente rilevanti e comportamentali. Questo lavoro contribuirà a gettare solide basi nel campo delle neuroscienze, portando ad approcci più mirati nella comprensione più profonda della funzione cerebrale.

La nostra comprensione della complessa struttura e funzione del cervello si sta rapidamente evolvendo e migliorando. Il cervello contiene più regioni distinte e la costruzione di una mappa molecolare può aiutarci a capire meglio come funziona il cervello. In questo documento metodologico, abbiamo discusso la dissezione del cervello del topo in più regioni distinte (Tabella 1). In questo protocollo, le strutture sono identificate in base ai punti di riferimento critici e si ottiene mantenendo il tessut...

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Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

Presentiamo un protocollo pratico, passo-passo, rapido per la rimozione del cervello del topo e la dissezione di regioni discrete dal tessuto cerebrale fresco. Ottenere regioni cerebrali per l'analisi molecolare è diventato routine in molti laboratori di neuroscienze. Queste regioni cerebrali vengono immediatamente congelate per ottenere dati trascrittomici di alta qualità per l'analisi a livello di sistema.

Microdissezione del cervello di topo in regioni funzionalmente e anatomicamente diverse

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Lo studio di regioni cerebrali distinte è un trampolino di lancio verso la comprensione della complessità molecolare e strutturale del cervello. Questo protocollo descrive una dissezione sistematica del cervello del topo per isolare regioni cerebrali distinte. Nella prospettiva dell'anatomia del cervello, è un approccio top-down che può essere facilmente riprodotto.I vantaggi di questo protocollo sono duplici. In primo luogo, questo approccio offre l'opportunità di comprendere le basi molecolari di regioni cerebrali piccole ma critiche. In secondo luogo, l'intero processo di dissezione è sufficientemente breve da garantire la conservazione dell'integrità molecolare, un prerequisito fondamentale per i test dorsali e molecolari.Questa procedura comporta pratica e manipolazione delicata. La tempistica è molto cruciale qui per mantenere i punti di riferimento strutturali e può essere raggiunta con una formazione e una pratica adeguate. A dimostrare la procedura di rimozione del cervello del topo sarà Seid Muhie, un chimico ricercatore e bioinformatico del nostro laboratorio.A dimostrare ulteriormente la procedura di dissezione del cervello del topo sarà James Meyerhoff, un neuroscienziato del nostro laboratorio. Per iniziare, pulire e rimuovere la pelle per una buona presa. Bloccare la mascella della testa decapitata con un emostato e utilizzare una garza per riflettere il cuoio capelluto rostralmente.Inserire le sottili forbici curve nel forame magno per separare le meningi aderenti. Quindi inserire le forbici all'apertura della base del cranio dove passa il midollo spinale con la lama rivolta verticalmente, ma parallela e premendo contro la superficie interna dell'osso della piastra basale, ruotando la lama di 45 gradi sul lato sinistro e poi sul lato destro. Rimuovere l'osso occipitale nell'osso intraparietale per esporre il cervelletto.Far avanzare le forbici rostralmente lungo la sutura sagittale media fino al bregma, e tagliarla sollevandola verso l'alto per evitare la lacerazione delle cortecce cerebrali. Mentre le ossa parietali vengono sollevate, identificare e tagliare gli attaccamenti meningei rimanenti. Fai due tagli paralleli nel piano sagittale e rimuovi i frammenti dell'osso frontale, evitando di lacerare la superficie del cervello.Mentre si tagliano gli attacchi meningei e i nervi cranici, invertire il cranio per consentire alla gravità di aiutare nella rimozione del cervello in una piccola tazza pre-riempita con soluzione salina. Mantenere intatta la bulla uditiva affinché l'anatomia ipofisaria sia identificabile. Fai un taglio parasamentotale estremamente piccolo su entrambi i lati nella cresta della tenda membrosa che tiene l'ipofisi al suo posto e solleva il lobo posteriore dell'ipofisi con una pinza ultra fine.Fai un taglio sagittale tra i margini laterali del lobo anteriore dell'ipofisi nel nervo trigemino più vicino, quindi solleva il lobo anteriore dell'ipofisi. Dirigere la fonte di luce bianca sul tessuto. Posizionare il cervello su un blocco di acciaio inossidabile pre-raffreddato e mantenere il blocco freddo circondandolo con ghiaccio in una soluzione salina ghiacciata.Inumidire periodicamente il tessuto con soluzione salina ghiacciata per preservare le strutture. Posiziona il cervello in modo tale che le cortecce cerebrali siano rivolte verso l'alto. Usando una piccola pinza curva, rimuovere il cervelletto.Usando l'approccio dorsale, far scivolare le lame chiuse di una piccola pinza curva sotto il corpo calloso e allargarla delicatamente per ritrarre la neocorteccia bilateralmente per preservare i punti di riferimento della linea mediana criticamente salienti. Eventuale lato verso l'alto, sarebbero visibili strutture come chiasma ottico, ipotalamo, bulbi olfattivi, midollo allungato, ceppo ipofisario e ponte pontino. Prova a separare gli emisferi.Capovolgere il sito ventrale del cervello verso l'alto e fare un taglio sagittale medio a partire dal dorso tra i bulbi olfattivi negli emisferi cerebrali. Rimuovere il midollo e quindi separare delicatamente i due emisferi. Quindi, effettuare un taglio coronale sul margine interno degli stagni per ottenere il cervello posteriore e separare il midollo sul margine posteriore degli stagni.Capovolgere il tessuto cerebrale per un'attenta separazione dei due emisferi cerebrali. Rimuovere il bulbo olfattivo in questa fase. Fai un taglio coronale un millimetro anteriormente al genu del corpo calloso e rimuovi i bulbi olfattivi accessori, seguiti dalla separazione della corteccia prefrontale mediale e laterale.Parzialmente tagliato orizzontalmente o coronalmente attraverso la porzione trasversale della commissura anteriore dalla linea mediana sotto il corno anteriore del ventricolo laterale per liberare il nucleo del setto dorsalmente e lo striato ventrale ventralmente. Rimuovere la piccola quantità di corteccia dalla superficie laterale per rimuovere la soccombenza del nucleo e il tubercolo olfattivo. Separare la porzione rostrale del corpo striato dalla corteccia sovrastante tramite un bisturi curvo tagliato appena fuori dalla capsula esterna.Identificare i nuclei del setto o del setto e isolarli da questa sezione. Fai un taglio curvo per separare l'ipotalamo in questo passaggio. Questo sarà fatto usando un taglio coronale parziale posteriore ai corpi mammillari che si estende solo lateralmente fino al solco ipotalamico.Quindi liberare la sezione trasversale dell'ipotalamo con un taglio parasagittale lungo la lunghezza del solco ipotalamico. Estromettere il ventricolo laterale per rivelare ulteriori connessioni intralimbiche nei restanti componenti del sistema limbico. Nella parte interna della corteccia interna, si osserva una struttura simile a un ventaglio dopo l'apertura del ventricolo.Utilizzare la struttura a ventaglio nella corteccia entorinale per definire i margini ai fini della dissezione, quindi identificare e rimuovere l'amigdala, la corteccia entorinale, la corteccia cingolata posteriore e l'ippocampo. Confermare l'identificazione del talamo mediante la visualizzazione della stria midollare sulla sua superficie dorsale che si estende nel piano corticale rostrale della linea mediana. Separare completamente il talamo dal mesencefalo con un taglio coronale.Questo protocollo può essere utilizzato per la rimozione immediata del cervello dal cranio, seguita dalla dissezione. I tessuti sezionati possono essere conservati e lavorati in seguito a seconda delle esigenze dello studio. L'RNA estratto da più tessuti sezionati può essere analizzato per l'espressione genica.I risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando cervelli raccolti che sono stati conservati a meno 80 gradi Celsius per diversi mesi prima dell'estrazione dell'RNA. Regioni cerebrali distinte insieme a dati di peso sono stati raccolti nell'ambito del modello di stress sociale esposto all'aggressore dello studio di PTSD. Le concentrazioni di RNA e le letture spettrofotometriche sono mostrate qui.Quando si segue questo protocollo, assicurarsi che i tessuti siano sempre raffreddati mantenendo il cervello su un blocco di acciaio ghiacciato e bagnando periodicamente il tessuto con soluzione salina ghiacciata. Una volta che i tessuti vengono raccolti e immediatamente congelati, possono essere utilizzati per saggi come trascrittomica, metabolomica e proteomica in un secondo momento.

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Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

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