Name: microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00
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Agradecemos à Sra. Seshmalini Srinivasan, ao Sr. Stephen Butler e à Sra. Pamela Spellman por assistência experimental e à Sra. Dana Youssef por editar o manuscrito. O apoio ao financiamento da USAMRDC é reconhecido com gratidão. A Fundação Genebra contribuiu para este trabalho e foi apoiada por fundos da Área de Pesquisa de Medicina Militar e Operacional III através do Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA.
Disclaimer:
O material foi revisado pelo Instituto de Pesquisa do Exército Walter Reed. Não há objeção à sua apresentação e/ou publicação. As opiniões ou afirmações aqui contidas são as opiniões privadas do autor, e não devem ser interpretadas como oficiais, ou como refletir verdadeiras visões do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa. A pesquisa foi conduzida sob um protocolo aprovado de uso de animais em uma instalação credenciada pela AAALAC em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e outros estatutos e regulamentos federais relativos a animais e experimentos envolvendo animais e adere aos princípios indicados no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Edição NRC Publication, edição de 2011.

O manejo animal e os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais para o cuidado animal. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro de Pesquisa em Saúde Ambiental do Exército dos EUA, agora Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) e realizados em uma instalação credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (...

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O cérebro mamífero é um órgão complexo composto por uma matriz de células morfologicamente distintas e funcionalmente únicas com diversas assinaturas moleculares e múltiplas regiões que realizam funções especializadas e discretas. O procedimento de dissecção aqui relatado pode ter múltiplas metas dependendo dos requisitos do laboratório. Em nosso laboratório avaliamos a transcrição em várias regiões cerebrais coletadas de camundongos expostos ao TEPT como o estresse16 . Gostar?...

O cérebro, juntamente com a medula espinhal e a retina, compreendem o sistema nervoso central que executa comportamentos complexos, controlados por tipos de células especializadas, precisamente posicionadas e interagindo em todo o corpo1. O cérebro é um órgão complexo com bilhões de neurônios interconectados e glia com circuitos precisos realizando inúmeras funções. É uma estrutura bilateral com dois lobos distintos e diversos componentes celulares2. A medula espinhal conecta o cérebro ao mundo exterior e é protegida por ossos, meninges e fluido cefalorraquidiano e encaminha mensagens de e para o cérebro 2,3,4. A superfície do cérebro, o córtex cerebral, é desigual e tem dobras distintas, chamadas gyri, e sulcos, chamados sulci, que separam o cérebro em centros funcionais5. O córtex é suave em mamíferos com um cérebro pequeno 6,7. É importante caracterizar e estudar a arquitetura do cérebro humano para entender os transtornos relacionados às diferentes regiões cerebrais, bem como seus circuitos funcionais. A pesquisa em neurociências se expandiu nos últimos anos e uma variedade de métodos experimentais estão sendo usados para estudar a estrutura e a função do cérebro. Desenvolvimentos nos campos da biologia molecular e de nível de sistemas iniciaram uma nova era de exploração da complexa relação entre estruturas cerebrais e o funcionamento das moléculas. Além disso, biologia molecular, genética e epigenética estão se expandindo rapidamente, permitindo-nos avançar nosso conhecimento dos mecanismos subjacentes envolvidos na forma como os sistemas funcionam. Essas análises podem ser realizadas de forma muito mais localizada, para ajudar na investigação e desenvolvimento de terapias mais eficazes.
O cérebro mamífero é estruturalmente definido em regiões discretas claramente identificáveis; no entanto, as complexidades funcionais e moleculares dessas estruturas discretas ainda não são claramente compreendidas. A natureza multidimensional e multicamadas do tecido cerebral torna essa paisagem difícil de estudar no nível funcional. Além disso, o fato de que múltiplas funções são executadas pela mesma estrutura e vice-versa complica ainda mais a compreensão do cérebro8. É vital que a abordagem experimental executada para a caracterização estrutural e funcional das regiões cerebrais utilize metodologias precisas de pesquisa para obter consistência na amostragem para correlacionar arquitetura neuroanatomical com função. A complexidade do cérebro foi recentemente explicada usando sequenciamento de células únicas 9,10, como o giro temporal do cérebro humano que é composto por 75 tipos de células distintas11. Comparando esses dados com os de uma região análoga do cérebro do camundongo, o estudo não só revela semelhanças em sua arquitetura e tipos celulares, mas também apresenta as diferenças. Para desvendar os mecanismos complexos, é importante, portanto, estudar diversas regiões do cérebro com plena precisão. Estruturas conservadas e função entre um cérebro humano e rato permitem o uso de um rato como substituto preliminar para elucidar a função cerebral humana e os resultados comportamentais.
Com o avanço das abordagens de biologia de sistemas, a obtenção de informações de regiões cerebrais discretas em roedores tornou-se um procedimento fundamental na pesquisa em neurociência. Embora alguns protocolos como a microdisseção de captura a laser12 possam ser caros, os protocolos mecânicos são baratos e realizados usando ferramentas comumente disponíveis13,14. Usamos várias regiões cerebrais para ensaios transcriômicos15 e desenvolvemos um procedimento prático e rápido para dissecar regiões cerebrais de camundongos de interesse de forma passo a passo em pouco tempo. Uma vez dissecadas, essas amostras podem ser armazenadas imediatamente em condições frias para preservar os ácidos nucleicos e proteínas desses tecidos. Nossa abordagem pode ser realizada mais rapidamente, levando a alta eficiência e permitindo menos chances de deterioração tecidual. Isso, em última análise, aumenta as chances de gerar experimentos reprodutíveis de alta qualidade usando tecidos cerebrais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td>5.5&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deaver scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6763</td>
			<td>5.5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6703</td>
			<td>4.75&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td>4.75&#34; straight sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved Sharp/Sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula, radius and tapered flat ends</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>stainless steel mirror finish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 6.5&#34;</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6846</td>
			<td>curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth 2mm tip width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeur (optional)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8321 many styles to choose</td>
			<td>Lempert Rongeur 6.5&#34; 2X8mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super fine forceps Inox</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-4955</td>
			<td>tip size 0.025 X 0.005 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A magnification visor</td>
			<td>Penn Tool Col</td>
			<td>40-178-6</td>
			<td>2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection cold plate</td>
			<td>Cellpath.com</td>
			<td>JRI-0100-00A</td>
			<td>Iceberg cold plate &#38; base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps, full curve extra delicate</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5138</td>
			<td>0.5 mm Tip 4&#8221; (10 cm) long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light operating scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-6753</td>
			<td>5&#34; curved sharp/sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9843 (repeated above)</td>
			<td>Scalpel Handle #3 Solid 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>and blades (especially #11)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-9801-11 (repeated above)</td>
			<td>Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>MS-SQRD9-4</td>
			<td>Double Ended Spatula Square AND Round End</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-8160 (repeated above)</td>
			<td>4.5&#8221; 1X2 teeth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions

O cérebro é o centro de comando do sistema nervoso mamífero e um órgão com enorme complexidade estrutural. Protegido dentro do crânio, o cérebro consiste em uma cobertura externa de matéria cinzenta sobre os hemisférios conhecidos como córtex cerebral. Abaixo dessa camada residem muitas outras estruturas especializadas que são essenciais para múltiplos fenômenos importantes para a existência. A aquisição de amostras de regiões cerebrais brutas específicas requer passos de dissecção rápidos e precisos. Entende-se que, no nível microscópico, existem muitas sub-regiões e provavelmente cruzam as fronteiras regionais arbitrárias que impomos para efeitos desta dissecção.
Modelos de camundongos são usados rotineiramente para estudar funções e doenças cerebrais humanas. Alterações nos padrões de expressão genética podem estar confinadas a áreas cerebrais específicas visando um fenótipo específico, dependendo do estado doente. Assim, é de grande importância estudar a regulação da transcrição no que diz respeito à sua organização estrutural bem definida. Uma compreensão completa do cérebro requer estudar regiões cerebrais distintas, definir conexões e identificar diferenças fundamentais nas atividades de cada uma dessas regiões cerebrais. Uma compreensão mais abrangente de cada uma dessas regiões distintas pode abrir caminho para novos e aprimorados tratamentos no campo da neurociência. Aqui, discutimos uma metodologia passo a passo para dissecar o cérebro do rato em dezesseis regiões distintas. Neste procedimento, focamos na remoção e dissecção cerebral do camundongo C57Bl/6J (6-8 semanas) em múltiplas regiões usando marcos neuroanatomáticos para identificar e amostrar regiões cerebrais discretas e relevantes do funcionamento e comportamentalmente relevantes. Este trabalho ajudará a estabelecer uma base forte no campo da neurociência, levando a abordagens mais focadas na compreensão mais profunda da função cerebral.

Nossa compreensão da complexa estrutura e função cerebral está evoluindo rapidamente e melhorando. O cérebro contém várias regiões distintas e construir um mapa molecular pode nos ajudar a entender melhor como o cérebro funciona. Neste artigo de método, discutimos a dissecação do cérebro do camundongo em múltiplas regiões distintas (Tabela 1). Neste protocolo, as estruturas são identificadas com base nos marcos críticos e são alcançadas mantendo o tecido úmido com solução salina, ma...

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Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Estudar regiões cerebrais distintas é um trampolim para compreender a complexidade molecular e estrutural do cérebro. Este protocolo descreve uma dissecção sistemática do cérebro do rato para isolar regiões cerebrais distintas. Na perspectiva da anatomia cerebral, é uma abordagem de cima para baixo que pode ser facilmente reproduzida.As vantagens deste protocolo são duplas. Em primeiro lugar, essa abordagem oferece uma oportunidade de entender os fundamentos moleculares de pequenas, mas críticas regiões cerebrais. Em segundo lugar, todo este processo de dissecção é suficientemente curto para garantir a preservação da integridade molecular, um pré-requisito crítico de ensaios de volta e molecular.Este procedimento envolve prática e manuseio delicado. O momento é muito crucial aqui para manter os marcos estruturais, e pode ser alcançado com treinamento e prática adequados. Demonstrando o procedimento de remoção do cérebro do rato estará Seid Muhie, um químico de pesquisa e bioinformático do nosso laboratório.Demonstrando ainda mais o procedimento de dissecção cerebral do rato estará James Meyerhoff, um neurocientista do nosso laboratório. Para começar, limpe e remova a pele para uma boa aderência. Aperte a maxila da cabeça decapitada com um hemosta e use uma gaze para refletir o couro cabeludo rostrally.Insira a tesoura curva fina no forame magnum para separar as meninges adesórias. Em seguida, insira a tesoura na abertura da base do crânio onde a medula espinhal passa com a lâmina apontando verticalmente, mas paralelamente e pressionando contra a superfície interna do osso da placa basal, girando a lâmina 45 graus para o lado esquerdo e, em seguida, para o lado direito. Remova o osso occipital no osso intraparietal para expor o cerebelo.Avance a tesoura rostrally ao longo da sutura sagital média até o bregma, e corte-a levantando para cima para evitar a laceração de cortices cerebrais. À medida que os ossos parietal são levantados, identifique e corte os anexos meningeais restantes. Faça dois cortes paralelos no plano sagital e remova os fragmentos do osso frontal, evitando dilacerar a superfície cerebral.Ao cortar os acessórios meningeais e os nervos cranianos, inverta o crânio para permitir que a gravidade ajude na remoção do cérebro em um pequeno copo pré-preenchido com solução salina. Mantenha a bulla auditiva intacta para que a anatomia pituitária seja identificável. Faça um corte parasaggital extremamente pequeno em ambos os lados no cume da tenda membrana que está segurando a pituitária em seu lugar, e levante o lóbulo posterior da pituitária com fórceps ultra finos.Faça um corte sagital entre as margens laterais do lobo anterior da pituitária no nervo trigêmeo mais próximo, em seguida, levante o lobo anterior da pituitária. Direcione a fonte de luz branca sobre o tecido. Coloque o cérebro em um bloco de aço inoxidável pré-resfriado e mantenha o bloco frio ao circundá-lo com gelo em uma solução salina gelada.Umedeça periodicamente o tecido com solução salina gelada para preservar as estruturas. Posicione o cérebro de tal forma que os cortices cerebrais estão voltados para cima. Usando pequenas fórceps curvas, remova o cerebelo.Usando a abordagem dorsal, deslize as lâminas fechadas de um pequeno fórceps curvo sob o caloso corpus, e espalhe-o suavemente para retrair o neocórtex bilateralmente para preservar os marcos de linha média criticamente salientes. Eventual lado para cima, estruturas como quiasmo óptico, hipotálamo, lâmpadas olfativas, medulla oblongata, estoque pituitário e ponte pontina seriam visíveis. Tente separar os hemisférios.Vire o site ventral cerebral para cima e faça um corte sagital médio começando do dorso entre as lâmpadas olfativas nos hemisférios cerebrais. Remova a medula e, em seguida, separe suavemente os dois hemisférios. Em seguida, faça um corte coronal na margem interna das lagoas para obter o cérebro traseiro e separar a medula na margem posterior das lagoas.Vire o tecido cerebral para uma separação cuidadosa dos dois hemisférios cerebrais. Remova a lâmpada olfativa nesta etapa. Faça um corte coronal um milímetro anterior ao genu do calosum corpus, e remova as lâmpadas olfativas do acessório, seguidas pela separação do córtex pré-frontal medial e lateral.Corte parcialmente horizontal ou coronally através da porção transversal da comissura anterior da linha média sob o chifre anterior do ventrículo lateral para liberar o núcleo septo dorsalmente e o estriado ventral ventrally. Remova a pequena quantidade do córtex da superfície lateral para remover o núcleo sucumbência e tubérculo olfativo. Separe a porção rostral do estriado corpus do córtex sobrelada através de um bisturi curvo cortado fora da cápsula externa.Identifique os núcleos septos ou septo e isole-os desta seção. Faça um corte curvo para separar o hipotálamo nesta etapa. Isso será feito usando um corte coronal parcial posterior aos corpos mammillary que se estendem apenas tão lateralmente quanto o sulco hipotalâmico.Em seguida, liberte a seção transversal de hipotálamo com um corte parasagital ao longo do comprimento do sulco hipotalâmico. Everta o ventrículo lateral para revelar conexões intralíbicas adicionais nos componentes restantes do sistema límbico. Na parte interna do córtex interno, uma estrutura semelhante ao ventilador é observada após a abertura do ventrículo.Use a estrutura semelhante ao ventilador no córtex entorhinal para definir as margens para fins de dissecção, em seguida, identificar e remover a amígdala, o córtex entorhinal, o córtex cingulado posterior e o hipocampo. Confirme a identificação do tálamo pela visualização da estria medullaris em sua superfície dorsal estendendo-se no plano cortical rostral médio. Separe o tálamo completamente do meio do cérebro por um corte coronal.Este protocolo pode ser usado para a remoção imediata do cérebro do crânio, seguido de dissecção. Os tecidos dissecados podem ser preservados e processados posteriormente, dependendo das exigências do estudo. RNA extraído de múltiplos tecidos dissecados pode ser testado para expressão genética.Os resultados representativos foram obtidos utilizando cérebros colhidos que foram armazenados a menos 80 graus Celsius durante vários meses antes da extração do RNA. Regiões cerebrais distintas, juntamente com dados de peso, foram coletadas no estudo o agressor expôs o modelo de estresse social de TEPT. Concentrações de RNA e leituras espectrofotométricas são mostradas aqui.Ao seguir este protocolo, certifique-se de que os tecidos são resfriados o tempo todo mantendo o cérebro em um bloco de aço gelado, e periodicamente doando o tecido com soro fisiológico. Uma vez que os tecidos são coletados e imediatamente congelados, eles podem ser usados para ensaios como transcriômica, metabolômica e proteômica posteriormente.

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Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Neurociência

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Mapping Cortical Dynamics Using Simultaneous MEG/EEG and Anatomically-constrained Minimum-norm Estimates: an Auditory Attention Example

Mapeamento Dynamics cortical MEG simultâneas / EEG e anatomicamente constrangido mínima norma-Estimativas: um exemplo Atenção Auditiva

Magneto- and electroencephalography (MEG/EEG) are neuroimaging techniques that provide a high temporal resolution particularly suitable to investigate the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...