Name: 3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer
Uploaded: 2021-01-05T14:30:00
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Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) financée par le ministère de l’Éducation (n ° 2020R1A6A1A03047902 et NRF-2018H1A2A1062091) et le gouvernement coréen (MSIT) (n ° NRF-2019R1C1C1009606 et NRF-2019R1A3A3005437).

1. Simulation informatique de la formation du gradient d’oxygène
<ol><li>
Génération d’un modèle de géométrie 3D pour l’impression hypoxique de cancer sur puce
	<ol>
<li>Exécutez un logiciel de CAO 3D.</li>
		<li>Esquissez le modèle de géométrie du cancer hypoxique sur puce. Cliquez sur Esquisse (Sketch) et sélectionnez le plan souhaité pour dessiner la géométrie. Reportez-vous au dessin(figure 2A)pour l’échelle de détail de chaque ...

<ol>
	<li>Jing, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypoxia+in+cancer+therapy+by+regulating+the+tumor+microenvironment.">Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).</li><li>Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. 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C., De Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+stereolithography+(STL)+slicing+and+G-code+generation+algorithm+for+an+entry+level+3-D+printer.">Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer.</a> 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).</li><li>Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue/organ+building+system.">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).</li><li>Gillispie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+methodologies+for+extrusion-based+bioink+printability.">Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability.</a> Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).</li><li>Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix-based+bioinks+for+engineering+tissue-and+organ-specific+microenvironments.">Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).</li></ol>

Dans cette étude, nous décrivons le processus de fabrication d’un cancer-sur-une-puce hypoxique basé sur la technologie d’impression cellulaire 3D. La formation du gradient hypoxique dans la puce conçue a été prédite par des simulations informatiques. L’environnement qui peut induire un gradient hypoxique hétérogène a été reproduit via une stratégie simple combinant la barrière perméable au gaz imprimée en 3D et le couvercle en verre. Les dispositifs pathologiques hypoxie-connexes du glioblastoma, y...

Le microenvironnement du cancer est un facteur essentiel de la progression du cancer. Les composants multiples, y compris les indices biochimiques, biophysiques et cellulaires, déterminent les dispositifs pathologiques du cancer. Parmi ceux-ci, l’hypoxie est fortement associée à la survie, à la prolifération et à l’invasion du cancer1. En raison de la croissance et de la division illimitées des cellules cancéreuses, les nutriments et l’oxygène sont continuellement épuisés et un gradient hypoxique est généré. Dans des conditions de faible teneur en oxygène, les cellules activent la cascade moléculaire associée au facteur de transcription inductible par l’hypoxie (HIF). Ce processus induit un noyau nécrotique, déclenche des changements métaboliques et initie une hyperplasie des vaisseaux sanguins et des métastases2,3. Par la suite, l’hypoxie dans les cellules cancéreuses provoque la destruction des tissus normaux voisins. En outre, l’hypoxie est fortement associée à la résistance thérapeutique des tumeurs solides de manière multifactorielle. L’hypoxie peut gravement entraver la radiothérapie, car la radiosensibilité est limitée en raison des espèces réactives de l’oxygène1,4. En outre, il diminue les niveaux de pH des microenvironnements du cancer, ce qui diminue l’accumulation de médicaments1. Par conséquent, la reproduction des dispositifs pathologiques liés à l’hypoxie in vitro est une stratégie prometteuse pour des résultats scientifiques et précliniques.
La modélisation d’un microenvironnement spécifique du cancer est essentielle pour comprendre le développement du cancer et explorer les traitements appropriés. Bien que les modèles animaux aient été largement utilisés en raison de leur forte pertinence physiologique, des problèmes liés aux différences entre les espèces et aux problèmes éthiques existent5. De plus, bien que les modèles 2D et 3D conventionnels permettent la manipulation et l’imagerie en temps réel des cellules cancéreuses pour une analyse approfondie, leur complexité architecturale et cellulaire ne peut pas être entièrement récapitulée. Par exemple, les modèles de sphéroïdes du cancer ont été largement utilisés, car l’agrégation des cellules cancéreuses dans un sphéroïde peut générer naturellement une hypoxie dans le noyau. De plus, un grand nombre de sphéroïdes cellulaires de taille uniforme ont été produits à l’aide de systèmes multi-puits à base de plastique ou de silicone6,7. Cependant, la flexibilité moindre en ce qui concerne la capture de la structure hétérogène exacte des tissus cancéreux avec des plates-formes conventionnelles a nécessité la mise en place d’une technologie de biofabrication avancée pour construire une plate-forme hautement biomimétique afin d’améliorer la recherche sur le cancer8.
Les systèmes microphysiologiques 3D (MPS) sont des outils utiles pour récapituler la géométrie complexe et la progression pathologique des cellules cancéreuses9. Comme les cellules cancéreuses détectent le gradient biochimique des facteurs de croissance et des chimiokines et l’hétérogénéité mécanique reproduite sur le système, des caractéristiques importantes du développement du cancer peuvent être étudiées in vitro. Par exemple, la viabilité du cancer, la malignité métastatique et la résistance aux médicaments en fonction des concentrations variables d’oxygène ont été étudiées à l’aide des MPS10,11. Malgré les progrès récents, la génération de conditions hypoxiques de modèles in vitro repose sur des procédures de fabrication complexes, y compris la connexion avec des pompes à essence physiques. Par conséquent, des méthodes simples et flexibles pour construire des microenvironnements spécifiques au cancer sont nécessaires.
La technologie d’impression cellulaire 3D a fait l’effet d’une attention considérable en raison de son contrôle précis de la disposition spatiale des biomatériaux pour récapituler les architectures biologiques natives12. En particulier, cette technologie surmonte les limites existantes des modèles d’hypoxie 3D en raison de sa grande contrôlabilité et de sa faisabilité pour la construction des caractéristiques spatiales du microenvironnement du cancer. L’impression 3D facilite également la fabrication assistée par ordinateur grâce à un processus couche par couche, fournissant ainsi une construction rapide, précise et reproductible de géométries complexes pour imiter les architectures tissulaires réelles. En plus des avantages des stratégies de fabrication existantes pour les MPS 3D, les caractéristiques physiopathologiques de la progression du cancer peuvent être reproduites en modelant les composants biochimiques, cellulaires et biophysiques13,14.
Nous présentons ici une stratégie d’impression cellulaire 3D pour un cancer hypoxique sur puce permettant de récapituler l’hétérogénéité d’un cancer solide(Figure 1)15. Les paramètres de fabrication ont été déterminés par une simulation computationnelle de la formation centrale d’hypoxie dans le système. Des anneaux concentriques de Cancer-stroma ont été imprimés utilisant des bioinks de collagène contenant des cellules de glioblastoma et des cellules endothéliales pour imiter la pathophysiologie du glioblastoma, un type de cancer plein. La formation d’un gradient radial d’oxygène a aggravé la malignité de cancer, indiquant l’agressivité renforcée. En outre, nous indiquons des perspectives d’avenir pour les applications de la puce aux modèles précliniques spécifiques au patient. L’approche proposée pour créer un système microphysiologique solide-cancer-mimétique devrait combler l’écart entre les modèles in vivo et in vitro de cancer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringe</td>
			<td>Jung Rim</td>
			<td>10ml 21G32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vial</td>
			<td>Hubena</td>
			<td>A0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G plastic needle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>PN-18G-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G plastic tapered dispense tip</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>TPND-20G-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 glass cover</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0101142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL disposable syringes</td>
			<td>HENKE-JET</td>
			<td>4020-X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50N precision nozzle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>HN-0.5ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>SINKWANG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-scrapper</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>200350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-coated histology slide</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>MAS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 cell culture flask</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>70075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DX printer</td>
			<td>T&#38;R Biofab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>AC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuger</td>
			<td>Cyrozen</td>
			<td>1580MGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscopy</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>FV 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>FISHER SCEINTIFIC</td>
			<td>O221S366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand tally counter</td>
			<td>KTRIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>DAECHUNG SCIENCE</td>
			<td>CB-BMMS C-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal syringe</td>
			<td>IWASHITA engineering</td>
			<td>SUS BARREL 10CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>OF-12, H070023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>NJ05652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>SAMSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltex Mixer</td>
			<td>DAIHAN scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>DAIHAN SCIENTIFIC</td>
			<td>WB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier</td>
			<td>WASSER LAB</td>
			<td>DI-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>4018-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIF-1 alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHMT2/SHMT antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab88664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J10857-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from porcine skin</td>
			<td>Dalim tissen</td>
			<td>PC-001-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311413-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene-vinyl acetate)&#160;</td>
			<td>Poly science</td>
			<td>06108-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dowhitech</td>
			<td>sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab37415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Samchun</td>
			<td>S0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>TRI020-500-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMSOL Multiphysics 3.5a</td>
			<td>COMSOL AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMS beamer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks Package</td>
			<td colspan="2">Dassault Systems SolidWorks Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer

Le microenvironnement du cancer a un impact significatif sur la progression de la maladie. En particulier, l’hypoxie est le principal moteur de la survie au cancer, de l’invasion et de la chimiorésistance. Bien que plusieurs modèles in vitro aient été développés pour étudier la pathologie cancéreuse liée à l’hypoxie, l’interaction complexe du microenvironnement cancéreux observé in vivo n’a pas encore été reproduite en raison de l’absence de contrôle spatial précis. Au lieu de cela, des approches de biofabrication 3D ont été proposées pour créer des systèmes microphysiologiques pour une meilleure émulation de l’écologie du cancer et une évaluation précise du traitement anticancéreux. Ici, nous proposons une approche d’impression cellulaire 3D pour fabriquer un cancer hypoxique sur puce. Les composants induisant l’hypoxie dans la puce ont été déterminés sur la base d’une simulation informatique de la distribution de l’oxygène. Des anneaux concentriques de Cancer-stroma ont été imprimés utilisant des bioinks contenant des cellules de glioblastoma et des cellules endothéliales pour récapituler un type de cancer solide. La puce résultante a réalisé l’hypoxie centrale et la malignité aggravée dans le cancer avec la formation des marqueurs pathophysiologiques représentatifs. Dans l’ensemble, l’approche proposée pour créer un système microphysiologique solide-cancer-mimétique devrait combler l’écart entre les modèles in vivo et in vitro pour la recherche sur le cancer.

Le cancer hypoxique sur puce a été développé à l’aide de la technologie d’impression cellulaire 3D assistée par ordinateur pour récapituler l’hypoxie et la pathologie liée au cancer (Figure 1). Le transport et la consommation d’oxygène ont été simulés à l’aide du modèle de géométrie 3D. La puce a été conçue sous la forme d’anneaux concentriques pour imiter la diffusion et l’épuisement radiaux de l’oxygène, dans les tissus ...

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3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

L’hypoxie est une caractéristique du microenvironnement tumoral et joue un rôle crucial dans la progression du cancer. Cet article décrit le processus de fabrication d’un cancer-sur-une-puce hypoxique basé sur la technologie 3D d’impression cellulaire pour récapituler une pathologie hypoxie-connexe du cancer.

Cancer hypoxique sur puce imprimé par cellules 3D pour récapituler la progression pathologique du cancer solide

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

L’hypoxie est un facteur clé du développement du cancer qui induit une instabilité génomique et une tumorigenèse. Nous démontrons une méthode pour générer une hypoxie centrale dans un cancer solide in vitro basée sur la technologie de bioimpression 3D. En utilisant cette méthode, un gradient radio hypoxique peut être reproduit à l’aide d’une stratégie simple qui combine une barrière perméable au gaz imprimée en 3D et un couvercle en verre.Cette technologie sur puce de cancer hypoxique peut être employée pour prévoir l’efficacité de drogue pour faciliter la prescription spécifique patient de drogue anticancéreuse. Et on s’attend également à ce qu’il permette un diagnostic rapide des cancers agressifs. Pour aider à la préparation d’une solution de pré-gel de collagène neutralisée de trois millilitres, couper des éponges de collagène de 30 milligrammes en un cinq par cinq millimètres au carré.Placez les morceaux dans un flacon en verre stérile de 10 millilitres et ajoutez 2,4 millilitres de filtre à seringue de 0,2 micron 0,1 acide chlorhydrique normal au flacon pour une incubation de trois jours à quatre degrés Celsius et 15 tours par minute. Après la digestion, filtrer toutes les particules de collagène non digérées à travers une passoire cellulaire de 40 microns et stocker la solution de collagène acide à quatre degrés Celsius pendant sept jours. Pour ajuster le pH de la solution de prégél gel de collagène neutralisée à 1%, ajouter 30 microlitres de solution rouge de phénol à une concentration finale de 1% et 300 microlitres de PBS 10X à une concentration finale de 10%Après mélange et centrifugation, utilisez un hydroxyde de sodium normal pour neutraliser le pH à sept, en vérifiant le changement de couleur et ajoutez de l’eau distillée pour obtenir un volume total de trois millilitres.Ensuite, conservez la solution de pré-gel de collagène neutralisée à 1% ajustée au pH à quatre degrés Celsius pour une utilisation dans les trois jours. Pour préconcérifier la gélification de la solution de pré-gel de collagène neutralisée, utilisez une pipette à déplacement positif pour ajouter 50 microlitres de gouttelettes de collagène à un petit plat et incuber les gouttelettes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, vérifiez si le collagène est passé d’une couleur transparente à un blanc opaque.Inclinez le récipient pour confirmer que le collagène adhère au fond du récipient. Et versez du PBS sur la gouttelette pour confirmer que la construction de collagène ne se casse pas en solution. Pour l’impression 3D d’un moule PEVA sacrificiel, cliquez sur Fichier et enregistrez le type de fichier en tant que STL pour convertir le fichier CAO 3D en fichier STL, puis cliquez sur Option et formulaire de sortie au format ASCII pour générer le code G.Pour importer le fichier STL généré, cliquez sur Fichier et ouvrez le fichier STL et sélectionnez le fichier STL enregistré. Pour générer automatiquement le code G du moule PEVA sacrificiel, sélectionnez le modèle de tranche de l’échangeur STL-CAD. Ensuite, pour générer des chemins d’impression pour la fabrication de la puce, utilisez une buse de précision de 50 calibres à une pression pneumatique de 500 kilopascals à 110 degrés Celsius pour imprimer le moule PEVA sacrificiel sur une lame d’histologie hydrophile adhésive adhésive stérile.Pour couler la barrière PDMS, mélanger six millilitres d’élastomère de base PDMS et 600 microlitres d’agent de durcissement pendant cinq minutes dans un réservoir en plastique et charger la solution mélangée de manière homogène dans une seringue jetable de 10 millilitres. Equipé la seringue d’une pointe de distribution conique en plastique de 20 calibres et remplissez le moule PEVA sacrificiel avec la solution PDMS mélangée. Le PDMS mélangé remplira ce moule PEVA sacrificiel avec une surface convexe et la barrière sera plus haute que celle du moule.Après avoir durci la barrière PDMS dans un four à 40 degrés Celsius pendant plus de 36 heures pour éviter de faire fondre la PEVA, utilisez une paire de pinces de précision pour détacher le moule PEVA sacrificiel et stérilisez la barrière perméable au gaz à 120 degrés Celsius dans un autoclave. Pour mélanger la solution avec des cellules cancéreuses, remettre en suspension chaque type de pastille de cellules collectées dans 20 microlitres de milieu de culture et ajouter un millilitre de solution de pré-gel de collagène neutralisé à 1% dans chacune des suspensions cellulaires remises en suspension sur de la glace humide avec un mélange doux. Utilisez une pipette à déplacement positif pour mélanger chaque suspension de cellule.Lorsque des solutions homogènes sont obtenues, utilisez une pipette jetable positive pour transférer les bioinks de collagène encapsulés cellulaires dans des seringues jetables individuelles de trois millilitres et stockez les seringues à quatre degrés Celsius jusqu’à l’impression cellulaire 3D. Pour l’impression 3D d’anneaux concentriques cancer-stroma, convertissez le fichier CAO 3D approprié dans un format de fichier STL et utilisez un échangeur STL-CAD pour générer un code G des anneaux concentriques cancer-stroma. Chargez les bioinks de collagène encapsulés de la cellule dans la tête d’imprimante 3D et réglez la température de la tête et de la plaque à 15 degrés Celsius.Chargez le chemin d’impression généré sur le logiciel de contrôle de l’imprimante 3D et cliquez sur Démarrer pour imprimer les bioinks de collagène sur la barrière perméable au gaz selon le code G chargé avec une aiguille en plastique de calibre 18 à une pression pneumatique d’environ 20 kilopascals à 15 degrés Celsius. À la fin de chaque opération d’impression, placez manuellement un couvercle en verre stérilisé de 22 x 50 millimètres sur la barrière perméable au gaz pour générer le gradient hypoxique. Après avoir généré trois cancer-sur-puces hypoxiques, transférez les puces dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure pour réticuler les bioinks de collagène.Lorsque tous les cancer-sur-une-puce hypoxique ont été imprimés, frotté doucement les verres de couverture sur le dessus des barrières perméables au gaz avec un grattoir de cellules pour une liaison serrée. Pour rafraîchir le milieu de culture cellulaire aux puces sans détacher la construction cancéreuse, inclinez les puces et utilisez une pipette pour introduire 1,5 millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale sur le côté de chaque puce. Le cancer-sur-une-puce hypoxique a été conçu sous forme d’anneaux concentriques pour imiter la diffusion et l’épuisement radiaux de l’oxygène observés dans les tissus de cancer.Après avoir défini le volume de contrôle d’un espace dans lequel l’oxygène est diffusé et consommé par les cellules, une densité cellulaire appropriée pour la génération d’hypoxie centrale peut être déterminée par une analyse computationnelle par éléments finis. Lors de l’impression cellulaire 3D, une structure compartimentée en anneau concentrique cancer-stroma peut être créée pour reproduire les caractéristiques anatomiques du cancer solide. Quantitativement, la viabilité des cellules post-impression est généralement supérieure à 96%, ce qui confirme que les conditions de fabrication sont appropriées pour le cancer et les cellules stromales.Dans cette analyse représentative, deux groupes ont été comparés en fonction de la présence et de l’absence du gradient d’oxygène pour vérifier les effets d’un gradient hypoxique sur la progression du cancer. Dans les deux conditions, des cellules endothéliales CD31 positives matures étaient présentes dans les régions périphériques, ce qui indique que des constructions vivantes spatialement modelées ont été produites à l’aide de la technologie de bioimpression 3D. Comparé à l’état négatif de gradient d’oxygène l’état positif de gradient a démontré un gradient hypoxique, indiquant l’expression progressive de l’alpha HIF1.On a également observé les cellules pseudopalisaded positives SHMT2 et les cellules pluripotentes positives SOX2, indicatives de la présence des dispositifs pathophysiologiques agressifs du cancer plein. Le cancer-sur-une-puce hypoxique est un outil utile pour étudier les caractéristiques pathophysiologiques des cancers solides et la diaphonie dynamique entre les cellules cancéreuses et le tumorigenesis favorisant le microenvironnement. Comme la méthodologie peut être adaptée à la conception d’un médicament spécifique au patient dans un délai raisonnable, cette approche devrait combler l’écart entre les modèles in vivo et in vitro de cancer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Suivi de signalisation hypoxique dans les agrégats de cellules encapsulées

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Recherche

Bio-ingénierie

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modélisation Comportement cancer de l&#39;ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Rigide incrustation du fixe et tachée, ensemble, échelle millimétrique spécimens pour histologie exempt de Section 3D de Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...