Name: 3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer
Uploaded: 2021-01-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer at JoVE.com

Diese Forschung wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (Nr. 2020R1A6A1A03047902 und NRF-2018H1A2A1062091) und der koreanischen Regierung (MSIT) (Nr. NRF-2019R1C1C1009606 und NRF-2019R1A3A3005437).

1. Computersimulation der Sauerstoffgradientenbildung
<ol><li>
Erstellung eines 3D-Geometriemodells für den hypoxischen Krebs-on-a-Chip-Druck
	<ol>
<li>Führen Sie eine 3D-CAD-Software aus.</li>
		<li>Skizzieren Sie das Geometriemodell von hypoxischem Krebs auf einem Chip. Klicken Sie auf Skizze und wählen Sie die gewünschte Ebene aus, um die Geometrie zu zeichnen. Die Detailskala der einzelnen Teile finden Sie in der Zeichnung (Abbildung 2A).</li>
		<l...

<ol>
	<li>Jing, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypoxia+in+cancer+therapy+by+regulating+the+tumor+microenvironment.">Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).</li><li>Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-modified+cancer+cell+metabolism.">Hypoxia-modified cancer cell metabolism.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).</li><li>Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+tumour+microenvironment.">The hypoxic tumour microenvironment.</a> Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).</li><li>Hockel, M., Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+hypoxia:+definitions+and+current+clinical,+biologic,+and+molecular+aspects.">Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).</li><li>Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+tumor+microenvironment+in+vivo+selects+the+cancer+stem+cell+fate+of+breast+cancer+cells.">The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).</li><li>Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+lithography+for+fabricating+self-organizing+soft+micro-honeycomb+structures+with+ultra-high+aspect+ratios.">Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates.">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).</li><li>Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-on-a-chip+for+integrating+a+3D+tumor+microenvironment:+chemical+and+mechanical+factors.">Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors.</a> Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).</li><li>Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+migration+and+cancer+drug+screening+in+oxygen+tension+gradient+chip.">Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip.</a> Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).</li><li>Palacio-Casta&#241;eda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crossing+and+integration+between+microfluidic+technology+and+3D+printing+for+organ-on-chips.">The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).</li><li>Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+organs-on-chips.">3D printing of organs-on-chips.</a> Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).</li><li>Yi, H. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy.">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).</li><li>Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+assessment+of+a+microfluidic+network+system+for+oxygen+transport+in+engineered+tissue.">Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue.</a> Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).</li><li>Woo Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effective+diffusivity+of+a+freeform+fabricated+scaffold+using+computational+simulation.">Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).</li><li>Brown, A. C., De Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+stereolithography+(STL)+slicing+and+G-code+generation+algorithm+for+an+entry+level+3-D+printer.">Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer.</a> 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).</li><li>Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue/organ+building+system.">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).</li><li>Gillispie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+methodologies+for+extrusion-based+bioink+printability.">Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability.</a> Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).</li><li>Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix-based+bioinks+for+engineering+tissue-and+organ-specific+microenvironments.">Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).</li></ol>

In dieser Studie beschreiben wir den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips auf Basis der 3D-Zelldrucktechnologie. Die Bildung des hypoxischen Gradienten im entworfenen Chip wurde durch Computersimulationen vorhergesagt. Die Umgebung, die einen heterogenen hypoxischen Gradienten induzieren kann, wurde über eine einfache Strategie reproduziert, die die 3D-gedruckte gasdurchlässige Barriere und die Glasabdeckung kombiniert. Die hypoxiebedingten pathologischen Merkmale des Glioblastoms, einschließlic...

Die Mikroumgebung von Krebs ist ein kritischer Faktor, der das Fortschreiten des Krebses antreibt. Mehrere Komponenten, einschließlich biochemischer, biophysikalischer und zellulärer Hinweise, bestimmen die pathologischen Merkmale von Krebs. Unter diesen ist Hypoxie stark mit krebserhaltendem Überleben, Proliferation und Invasion verbunden1. Durch das unbegrenzte Wachstum und die Teilung von Krebszellen werden Nährstoffe und Sauerstoff kontinuierlich erschöpft und es entsteht ein hypoxischer Gradient. Unter sauerstoffarmen Bedingungen aktivieren Zellen eine mit Hypoxie induzierbare Transkriptionsfaktor (HIF) assoziierte molekulare Kaskade. Dieser Prozess induziert einen nekrotischen Kern, löst metabolische Veränderungen aus und initiiert Blutgefäßhyperplasie und Metastasierung2,3. Anschließend verursacht Hypoxie in Krebszellen die Zerstörung benachbarter normaler Gewebe. Darüber hinaus ist Hypoxie stark mit der therapeutischen Resistenz solider Tumoren in multifaktorieller Weise verbunden. Hypoxie kann die Strahlentherapie stark behindern, da die Strahlenempfindlichkeit aufgrund der reaktiven Sauerstoffspezies1,4begrenzt ist. Darüber hinaus senkt es den pH-Wert der Mikroumgebung von Krebs, was die Arzneimittelakkumulation verringert1. Daher ist die Reproduktion pathologischer Merkmale im Zusammenhang mit Hypoxie in vitro eine vielversprechende Strategie für wissenschaftliche und präklinische Befunde.
Die Modellierung einer spezifischen Mikroumgebung von Krebs ist für das Verständnis der Krebsentwicklung und die Erforschung geeigneter Behandlungen unerlässlich. Obwohl Tiermodelle aufgrund ihrer starken physiologischen Relevanz weit verbreitet sind, gibt es Fragen im Zusammenhang mit Artenunterschieden und ethischen Problemen5. Obwohl herkömmliche 2D- und 3D-Modelle die Manipulation und Echtzeit-Bildgebung von Krebszellen für eine eingehende Analyse ermöglichen, kann ihre architektonische und zelluläre Komplexität nicht vollständig rekapituliert werden. Zum Beispiel sind Krebs-Sphäroid-Modelle weit verbreitet, da die Aggregation von Krebszellen in einem Sphäroid auf natürliche Weise Hypoxie im Kern erzeugen kann. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von zellulären Sphäroiden einheitlicher Größe mit kunststoff- oder silikonbasierten Multi-Well-Systemenhergestellt 6,7. Die geringere Flexibilität in Bezug auf die Erfassung der genauen heterogenen Struktur von Krebsgewebe mit herkömmlichen Plattformen hat jedoch die Etablierung einer fortschrittlichen Biofabrikationstechnologie erfordert, um eine hochbiomimetische Plattform zur Verbesserung der Krebsforschung aufzubauen8.
Mikrophysiologische 3D-Systeme (MPS) sind nützliche Werkzeuge, um die komplexe Geometrie und das pathologische Fortschreiten von Krebszellen zu rekapitulieren9. Da Krebszellen den biochemischen Gradienten von Wachstumsfaktoren und Chemokinen und die auf dem System reproduzierte mechanische Heterogenität spüren, können wichtige Merkmale der Krebsentfaltung in vitro untersucht werden. Zum Beispiel wurden Krebslebensfähigkeit, metastasierende Malignität und Arzneimittelresistenz in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen mit MPSs10,11untersucht. Trotz der jüngsten Fortschritte beruht die Erzeugung hypoxischer Bedingungen von In-vitro-Modellen auf komplexen Herstellungsverfahren, einschließlich der Verbindung mit physikalischen Gaspumpen. Daher sind einfache und flexible Methoden zum Aufbau krebsspezifischer Mikroumgebungen erforderlich.
Die 3D-Zelldrucktechnologie hat aufgrund ihrer präzisen Kontrolle der räumlichen Anordnung von Biomaterialien zur Rekapitulation nativer biologischer Architekturen erhebliche Aufmerksamkeit erregt12. Insbesondere überwindet diese Technologie die bestehenden Einschränkungen von 3D-Hypoxiemodellen aufgrund ihrer hohen Kontrollierbarkeit und Machbarkeit für den Aufbau der räumlichen Merkmale der Krebsmikroumgebung. Der 3D-Druck erleichtert auch die computergestützte Fertigung durch einen Schicht-für-Schicht-Prozess und bietet so eine schnelle, genaue und reproduzierbare Konstruktion komplexer Geometrien, um tatsächliche Gewebearchitekturen nachzuahmen. Zusätzlich zu den Vorteilen bestehender Herstellungsstrategien für 3D-MPS können die pathophysiologischen Merkmale des Krebsprogressiones durch Musterung der biochemischen, zellulären und biophysikalischen Komponenten reproduziert werden13,14.
Hier stellen wir eine 3D-Zelldruckstrategie für einen hypoxischen Krebs-on-a-Chip vor, um die Heterogenität eines soliden Krebses zu rekapitulieren (Abbildung 1)15. Die Herstellungsparameter wurden durch eine computergestützte Simulation der zentralen Hypoxiebildung im System bestimmt. Krebs-Stroma-Konzentrische Ringe wurden mit Kollagen-Biotinten gedruckt, die Glioblastomzellen und Endothelzellen enthalten, um die Pathophysiologie des Glioblastoms, einer Art von solidem Krebs, nachzuahmen. Die Bildung eines radialen Sauerstoffgradienten verschlimmerte die Malignität des Krebses, was auf eine verstärkte Aggressivität hindeutet. Darüber hinaus zeigen wir Zukunftsperspektiven für die Anwendungen des Chips auf patientenspezifische präklinische Modelle auf. Der vorgeschlagene Ansatz zur Schaffung eines solid-krebsmimetischen mikrophysiologischen Systems soll die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Krebsmodellen schließen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringe</td>
			<td>Jung Rim</td>
			<td>10ml 21G32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vial</td>
			<td>Hubena</td>
			<td>A0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G plastic needle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>PN-18G-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G plastic tapered dispense tip</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>TPND-20G-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 glass cover</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0101142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL disposable syringes</td>
			<td>HENKE-JET</td>
			<td>4020-X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50N precision nozzle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>HN-0.5ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>SINKWANG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-scrapper</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>200350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-coated histology slide</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>MAS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 cell culture flask</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>70075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DX printer</td>
			<td>T&#38;R Biofab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>AC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuger</td>
			<td>Cyrozen</td>
			<td>1580MGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscopy</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>FV 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>FISHER SCEINTIFIC</td>
			<td>O221S366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand tally counter</td>
			<td>KTRIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>DAECHUNG SCIENCE</td>
			<td>CB-BMMS C-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal syringe</td>
			<td>IWASHITA engineering</td>
			<td>SUS BARREL 10CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>OF-12, H070023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>NJ05652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>SAMSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltex Mixer</td>
			<td>DAIHAN scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>DAIHAN SCIENTIFIC</td>
			<td>WB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier</td>
			<td>WASSER LAB</td>
			<td>DI-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>4018-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIF-1 alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHMT2/SHMT antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab88664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J10857-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from porcine skin</td>
			<td>Dalim tissen</td>
			<td>PC-001-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311413-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene-vinyl acetate)&#160;</td>
			<td>Poly science</td>
			<td>06108-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dowhitech</td>
			<td>sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab37415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Samchun</td>
			<td>S0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>TRI020-500-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMSOL Multiphysics 3.5a</td>
			<td>COMSOL AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMS beamer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks Package</td>
			<td colspan="2">Dassault Systems SolidWorks Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer

Die Mikroumgebung von Krebs hat einen signifikanten Einfluss auf das Fortschreiten der Krankheit. Insbesondere Hypoxie ist der Schlüsselfaktor für das Überleben, die Invasion und die Chemoresistenz von Krebs. Obwohl mehrere In-vitro-Modelle entwickelt wurden, um die hypoxiebedingte Krebspathologie zu untersuchen, wurde das komplexe Zusammenspiel der in vivo beobachteten Krebsmikroumgebung aufgrund des Mangels an präziser räumlicher Kontrolle noch nicht reproduziert. Stattdessen wurden 3D-Biofabrikationsansätze vorgeschlagen, um mikrophysiologische Systeme für eine bessere Nachbildung der Krebsökologie und eine genaue Bewertung der Krebsbehandlung zu schaffen. Hier schlagen wir einen 3D-Zelldruckansatz vor, um einen hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip herzustellen. Die Hypoxie-induzierenden Komponenten im Chip wurden auf Basis einer Computersimulation der Sauerstoffverteilung bestimmt. Krebs-Stroma-Konzentrische Ringe wurden mit Biotinten gedruckt, die Glioblastomzellen und Endothelzellen enthielten, um eine Art von solidem Krebs zu rekapitulieren. Der resultierende Chip realisierte zentrale Hypoxie und verschlimmerte maligne bei Krebs mit der Bildung repräsentativer pathophysiologischer Marker. Insgesamt wird erwartet, dass der vorgeschlagene Ansatz zur Schaffung eines solid-krebsmimetischen mikrophysiologischen Systems die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen für die Krebsforschung schließen wird.

Der hypoxische Krebs-auf-einem-Chip wurde mit computergestützter 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt, um Hypoxie und krebsbedingte Pathologie zu rekapitulieren (Abbildung 1). Sauerstofftransport und -verbrauch wurden mit dem 3D-Geometriemodell simuliert. Der Chip wurde in Form von konzentrischen Ringen entwickelt, um die radiale Sauerstoffdiffusion und -erschöpfung in Krebsgeweben nachzuahmen (Abbildung 2A). Nach der Definition ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer at JoVE.com

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Hypoxie ist ein Kennzeichen der Tumormikroumgebung und spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten des Krebses. Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess eines hypoxischen Krebs-auf-einem-Chip basierend auf der 3D-Zelldrucktechnologie, um eine hypoxiebedingte Pathologie von Krebs zu rekapitulieren.

3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Hypoxie ist ein Schlüsselfaktor für die Krebsentwicklung, der genomische Instabilität und Tumorgenese induziert. Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung einer zentralen Hypoxie bei einem soliden Krebs in vitro auf Basis der 3D-Bioprinting-Technologie. Mit dieser Methode kann ein radiohypoxischer Gradient mit einer einfachen Strategie reproduziert werden, die eine 3D-gedruckte gasdurchlässige Barriere und eine Glasabdeckung kombiniert.Diese hypoxische Krebs-On-a-Chip-Technologie kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten vorherzusagen, um die patientenspezifische Verschreibung von Krebsmedikamenten zu erleichtern. Und es wird auch erwartet, dass es eine schnelle Diagnose von aggressiven Krebsarten ermöglicht. Um die Herstellung einer drei Milliliter neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung zu unterstützen, schneiden Sie 30 Milligramm Kollagenschwämme in fünf mal fünf Millimeter quadratische Stücke.Legen Sie die Stücke in eine sterile 10-Milliliter-Glasfläschchen und geben Sie 2,4 Milliliter 0,2-Mikron-Spritzenfilter 0,1 normale Salzsäure in die Durchstechflasche für eine dreitägige Inkubation bei vier Grad Celsius und 15 Umdrehungen pro Minute. Nach der Verdauung alle unverdauten Kollagenpartikel durch ein 40 Mikron Zellsieb abseihen und die saure Kollagenlösung bei vier Grad Celsius bis zu sieben Tage lagern. Um den pH-Wert der 1% neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung einzustellen, fügen Sie 30 Mikroliter Phenolrotlösung zu einer Endkonzentration von 1% und 300 Mikroliter von 10X PBS zu einer Endkonzentration von 10% hinzu Nach dem Mischen und Zentrifugieren verwenden Sie ein normales Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf sieben zu neutralisieren, überprüfen Sie die Farbänderung und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von drei Millilitern zu erhalten.Dann lagern Sie die pH-eingestellte 1% neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung bei vier Grad Celsius für die Verwendung innerhalb von drei Tagen. Um die Gelierung der neutralisierten Kollagen-Pre-Gel-Lösung vorzuprüfen, verwenden Sie eine Verdrängerpipette, um 50 Mikroliter Kollagentröpfchen in eine kleine Schüssel zu geben und die Tröpfchen in einem 37 Grad Celsius Inkubator für eine Stunde zu inkubieren. Überprüfen Sie am Ende der Inkubation, ob sich das Kollagen von einer transparenten Farbe zu einem undurchsichtigen Weiß verändert hat.Neigen Sie den Behälter, um zu bestätigen, dass das Kollagen am Boden des Behälters haftet. Und gießen Sie PBS auf das Tröpfchen, um zu bestätigen, dass das Kollagenkonstrukt nicht in Lösung bricht. Für den 3D-Druck einer PEVA-Opferform klicken Sie auf Datei und speichern Sie den Dateityp als STL, um die 3D-CAD-Datei in eine STL-Datei zu konvertieren, und klicken Sie auf Option und Ausgabeformular als ASCII, um den G-Code zu generieren.Um die generierte STL-Datei zu importieren, klicken Sie auf Datei, öffnen Sie die STL-Datei und wählen Sie die gespeicherte STL-Datei aus. Um den G-Code der PEVA-Opferform automatisch zu generieren, wählen Sie das Schnittmodell des STL-CAD-Austauschers aus. Um dann Druckpfade für die Chipherstellung zu generieren, verwenden Sie eine 50-Gauge-Präzisionsdüse bei einem pneumatischen Druck von 500 Kilopascal bei 110 Grad Celsius, um die PEVA-Opferform auf einen sterilen hydrophilen Histologie-Objektträger zu drucken.Um die PDMS-Barriere zu gießen, mischen Sie sechs Milliliter PDMS-Basiselastomer und 600 Mikroliter Härter fünf Minuten lang in ein Kunststoffreservoir und laden die homogen gemischte Lösung in eine 10-Milliliter-Einwegspritze. Die Spritze mit einer 20-Gauge-Kunststoff-Dosierspitze ausgestattet und die PEVA-Opferform mit der gemischten PDMS-Lösung füllen. Das gemischte PDMS füllt diese PEVA-Opferform mit einer konvexen Oberfläche und die Barriere ist höher als die der Form.Nachdem Sie die PDMS-Barriere in einem 40-Grad-Celsius-Ofen für über 36 Stunden ausgehärtet haben, um das Schmelzen des PEVA zu vermeiden, verwenden Sie eine Präzisionspinzette, um die PEVA-Opferform zu lösen und die gasdurchlässige Barriere bei 120 Grad Celsius in einem Autoklaven zu sterilisieren. Um die Lösung mit Krebszellen zu mischen, resuspendieren Sie jede Art von gesammeltem Zellpellet in 20 Mikroliter Kulturmedium und fügen Sie einen Milliliter 1% neutralisierte Kollagen-Pre-Gel-Lösung in jede der resuspendierten Zellsuspensionen auf nassem Eis mit sanftem Mischen hinzu. Verwenden Sie eine Verdrängerpipette, um jede Zellsuspension zu mischen.Wenn homogene Lösungen erhalten werden, verwenden Sie eine positive Einwegpipette, um die zellverkapselten Kollagen-Biotinten in einzelne drei Milliliter-Einwegspritzen zu übertragen und die Spritzen bei vier Grad Celsius bis zum 3D-Zelldruck zu lagern. Für den 3D-Druck von krebs-stroma-konzentrischen Ringen konvertieren Sie die entsprechende 3D-CAD-Datei in ein STL-Dateiformat und verwenden einen STL-CAD-Austauscher, um einen G-Code der konzentrischen Krebs-Stroma-Ringe zu generieren. Laden Sie die zellverkapselten Kollagen-Biotinten in den 3D-Druckerkopf und stellen Sie die Temperatur von Kopf und Platte auf 15 Grad Celsius ein.Laden Sie den generierten Druckpfad auf die Steuerungssoftware des 3D-Druckers und klicken Sie auf Start, um die Kollagenbiotinten gemäß dem geladenen G-Code mit einer 18-Gauge-Kunststoffnadel bei einem pneumatischen Druck von ca. 20 Kilopascal bei 15 Grad Celsius auf die gasdurchlässige Barriere zu drucken. Legen Sie am Ende jedes Druckvorgangs manuell eine sterilisierte 22 x 50 Millimeter große Glasabdeckung auf die gasdurchlässige Barriere, um den hypoxischen Gradienten zu erzeugen. Nach der Erzeugung von drei hypoxischen Krebs-auf-Chips werden die Chips für eine Stunde in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator überführen, um die Kollagen-Biotinten zu vernetzen.Wenn alle hypoxischen Krebs-auf-einem-Chips gedruckt wurden, reiben Sie die Deckgläser vorsichtig auf die gasdurchlässigen Barrieren mit einem Zellschaber für eine enge Verklebung. Um das Zellkulturmedium zu den Chips aufzufrischen, ohne das Krebskonstrukt zu lösen, neigen Sie die Chips und verwenden Sie eine Pipette, um 1,5 Milliliter Endothelzellwachstumsmedium an die Seite jedes Chips einzuführen. Der hypoxische Krebs-auf-einem-Chip wurde in Form von konzentrischen Ringen entwickelt, um die radiale Sauerstoffdiffusion und -erschöpfung nachzuahmen, die in Krebsgeweben beobachtet werden.Nach der Definition des Kontrollvolumens eines Raumes, in dem Sauerstoff diffundiert und von Zellen verbraucht wird, kann durch rechnerische Finite-Elemente-Analyse eine geeignete Zelldichte für die zentrale Hypoxie-Erzeugung bestimmt werden. Beim 3D-Zelldruck kann eine kompartimentierte konzentrische Krebs-Stroma-Ringstruktur erstellt werden, um die anatomischen Merkmale des soliden Krebses zu reproduzieren. Quantitativ ist die Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Drucken typischerweise größer als 96%, was bestätigt, dass die Herstellungsbedingungen für Krebs- und Stromazellen geeignet sind.In dieser repräsentativen Analyse wurden zwei Gruppen nach dem Vorhandensein und Fehlen des Sauerstoffgradienten verglichen, um die Auswirkungen eines hypoxischen Gradienten auf das Fortschreiten des Krebses zu überprüfen. Unter beiden Bedingungen waren reife CD31-positive Endothelzellen in den peripheren Regionen vorhanden, was darauf hindeutet, dass räumlich gemusterte lebende Konstrukte mit 3D-Bioprinting-Technologie hergestellt wurden. Im Vergleich zum negativen Sauerstoffgradientenzustand zeigte der gradientenpositive Zustand einen hypoxischen Gradienten, was auf die allmähliche Expression von HIF1 alpha hinweist.SHMT2-positive pseudopalisadierte Zellen und SOX2-positive pluripotente Zellen wurden ebenfalls beobachtet, was auf das Vorhandensein aggressiver pathophysiologischer Merkmale von solidem Krebs hinweist. Der hypoxische Krebs-on-a-Chip ist ein nützliches Werkzeug, um die pathophysiologischen Eigenschaften solider Krebsarten und das dynamische Übersprechen zwischen Krebszellen und tumorigenessfördernder Mikroumgebung zu untersuchen. Da die Methodik in einem angemessenen Zeitrahmen für ein patientenspezifisches Arzneimitteldesign angepasst werden kann, wird erwartet, dass dieser Ansatz die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Krebsmodellen schließt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Forschung

Biotechnik

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...