Name: 3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer
Uploaded: 2021-01-05T14:30:00
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Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo Ministério da Educação (nº 2020R1A6A1A1A03047902 e NRF-2018H1A2A1062091) e pelo governo da Coreia (MSIT) (N. No. NRF-2019R1C1C1009606 e NRF-2019R1A3A3005437).

1. Simulação computacional da formação de gradiente de oxigênio
<ol><li>
Geração de um modelo de geometria 3D para impressão hipoxica de câncer em um chip
	<ol>
<li>Execute um software CAD 3D.</li>
		<li>Esboce o modelo de geometria do câncer hipóxico em um chip. Clique em Sketch e selecione o plano desejado para desenhar a geometria. Consulte o desenho (Figura 2A) para a escala de detalhes de cada peça.</li>
		<li>Defina a espessura da geometr...

<ol>
	<li>Jing, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypoxia+in+cancer+therapy+by+regulating+the+tumor+microenvironment.">Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).</li><li>Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-modified+cancer+cell+metabolism.">Hypoxia-modified cancer cell metabolism.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).</li><li>Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+tumour+microenvironment.">The hypoxic tumour microenvironment.</a> Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).</li><li>Hockel, M., Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+hypoxia:+definitions+and+current+clinical,+biologic,+and+molecular+aspects.">Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).</li><li>Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+tumor+microenvironment+in+vivo+selects+the+cancer+stem+cell+fate+of+breast+cancer+cells.">The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).</li><li>Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids+as+in+vitro+models+to+mimic+in+vivo+human+solid+tumors+resistance+to+therapeutic+drugs.">3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).</li><li>Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-on-a-chip+for+integrating+a+3D+tumor+microenvironment:+chemical+and+mechanical+factors.">Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors.</a> Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).</li><li>Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. 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P., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model.">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crossing+and+integration+between+microfluidic+technology+and+3D+printing+for+organ-on-chips.">The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).</li><li>Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+organs-on-chips.">3D printing of organs-on-chips.</a> Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).</li><li>Yi, H. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprinted+human-glioblastoma-on-a-chip+for+the+identification+of+patient-specific+responses+to+chemoradiotherapy.">A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).</li><li>Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+assessment+of+a+microfluidic+network+system+for+oxygen+transport+in+engineered+tissue.">Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue.</a> Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).</li><li>Woo Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effective+diffusivity+of+a+freeform+fabricated+scaffold+using+computational+simulation.">Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).</li><li>Brown, A. C., De Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+stereolithography+(STL)+slicing+and+G-code+generation+algorithm+for+an+entry+level+3-D+printer.">Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer.</a> 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).</li><li>Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue/organ+building+system.">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).</li><li>Gillispie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+methodologies+for+extrusion-based+bioink+printability.">Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability.</a> Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).</li><li>Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix-based+bioinks+for+engineering+tissue-and+organ-specific+microenvironments.">Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).</li></ol>

Neste estudo, descrevemos o processo de fabricação de um câncer hipóxico baseado na tecnologia de impressão celular 3D. A formação do gradiente hipóxico no chip projetado foi prevista através de simulações de computador. O ambiente que pode induzir um gradiente hipóxico heterogêneo foi reproduzido através de uma estratégia simples combinando a barreira permeável a gás impresso em 3D e a tampa de vidro. As características patológicas relacionadas à hipóxia do glioblastoma, incluindo pseudopalisade e u...

O microambiente do câncer é um fator crítico que impulsiona a progressão do câncer. Múltiplos componentes, incluindo sinais bioquímicos, biofísicos e celulares, determinam as características patológicas do câncer. Entre elas, a hipóxia está fortemente associada à sobrevivência do câncer, à proliferação e à invasão1. Devido ao crescimento ilimitado e divisão de células cancerosas, nutrientes e oxigênio são continuamente esgotados, e um gradiente hipóxico é gerado. Em condições de baixo oxigênio, as células ativam o fator de transcrição indutível de hipóxia (HIF) em cascata molecular associada ao HIF. Esse processo induz um núcleo necrosado, desencadeia alterações metabólicas e inicia hiperplasia e metástase do vaso sanguíneo2,3. Posteriormente, a hipóxia nas células cancerosas causa a destruição de tecidos normais vizinhos. Além disso, a hipóxia está fortemente associada à resistência terapêutica de tumores sólidos de modos multifatoriais. A hipóxia pode impedir severamente a radioterapia, uma vez que a radiosensibilidade é limitada devido à espécie de oxigênio reativo1,4. Além disso, diminui os níveis de pH de microambientes de câncer, o que diminui o acúmulo de medicamentos1. Portanto, a reprodução de características patológicas relacionadas à hipóxia in vitro é uma estratégia promissora para achados científicos e pré-clínicos.
A modelagem de um microambiente específico do câncer é essencial para entender o desenvolvimento do câncer e explorar tratamentos adequados. Embora os modelos animais tenham sido amplamente utilizados devido à sua forte relevância fisiológica, existem questões relacionadas às diferenças de espécies e problemas éticos5. Além disso, embora os modelos convencionais 2D e 3D permitam a manipulação e a imagem em tempo real das células cancerosas para uma análise aprofundada, sua complexidade arquitetônica e celular não pode ser totalmente recapitulada. Por exemplo, modelos de spheroid de câncer têm sido amplamente utilizados, já que a agregação de células cancerosas em um esferoide pode naturalmente gerar hipóxia no núcleo. Além disso, um grande número de esferoides celulares de tamanho uniforme foram produzidos utilizando sistemas multi-poços à base de plástico ou silicone6,7. No entanto, a menor flexibilidade no que diz respeito à captura da estrutura heterogênea exata dos tecidos cancerígenos com plataformas convencionais exigiu o estabelecimento de uma tecnologia avançada de biofabização para construir uma plataforma altamente biomimética para melhorar a pesquisa sobre o câncer8.
Os sistemas microfisiológicos 3D (MPSs) são ferramentas úteis para recapitular a geometria complexa e a progressão patológica das célulascancerosas 9. À medida que as células cancerígenas sentem o gradiente bioquímico de fatores de crescimento e quimiocinas e a heterogeneidade mecânica reproduzida no sistema, características importantes do desenvolvimento do câncer podem ser investigadas in vitro. Por exemplo, viabilidade do câncer, malignidade metastática e resistência a medicamentos, dependendo das variadas concentrações de oxigênio tem sido estudada usando MPSs10,11. Apesar dos avanços recentes, a geração de condições hipóxiis de modelos in vitro depende de procedimentos complexos de fabricação, incluindo conexão com bombas de gás físico. Portanto, são necessários métodos simples e flexíveis para construir microambientes específicos para o câncer.
A tecnologia de impressão celular 3D ganhou considerável atenção devido ao seu controle preciso do arranjo espacial de biomateriais para recapitular arquiteturas biológicas nativas12. Em particular, essa tecnologia supera as limitações existentes dos modelos de hipóxia 3D devido à sua alta controlabilidade e viabilidade para a construção das características espaciais do microambiente do câncer. A impressão 3D também facilita a fabricação auxiliada por computador através de um processo camada por camada, fornecendo assim uma construção rápida, precisa e reprodutível de geometrias complexas para imitar arquiteturas de tecidos reais. Além das vantagens das estratégias de fabricação existentes para MPSs 3D, as características fisiofológicas da progressão do câncer podem ser reproduzidas pela padronização dos componentes bioquímicos, celulares e biofísicos13,14.
Aqui, apresentamos uma estratégia de impressão celular 3D para um câncer hipóxico em um chip para recapitular a heterogeneidade de um câncer sólido (Figura 1)15. Os parâmetros de fabricação foram determinados através de uma simulação computacional da formação central de hipóxia no sistema. Anéis concêntricos de câncer foram impressos usando bioinks de colágeno contendo células de glioblastoma e células endoteliais para emular a fisiopatologia do glioblastoma, um tipo de câncer sólido. A formação de um gradiente de oxigênio radial agravou a malignidade do câncer, indicando uma agressividade reforçada. Além disso, indicamos perspectivas futuras para as aplicações do chip a modelos pré-clínicos específicos do paciente. Espera-se que a abordagem proposta para a criação de um sistema microfisiológico mímético de câncer sólido e que altere a distância entre modelos in vivo e in vitro de câncer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-12200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disposable syringe</td>
			<td>Jung Rim</td>
			<td>10ml 21G32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL glass vial</td>
			<td>Hubena</td>
			<td>A0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G plastic needle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>PN-18G-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G plastic tapered dispense tip</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>TPND-20G-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 glass cover</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0101142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL disposable syringes</td>
			<td>HENKE-JET</td>
			<td>4020-X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>91005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Serological pipette tip</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50N precision nozzle</td>
			<td>Musashi engineering</td>
			<td>HN-0.5ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>SINKWANG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-scrapper</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>90030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>200350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-coated histology slide</td>
			<td>MATSUNAMI</td>
			<td>MAS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>23050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 cell culture flask</td>
			<td>SPL lifescience</td>
			<td>70075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DX printer</td>
			<td>T&#38;R Biofab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>AC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuger</td>
			<td>Cyrozen</td>
			<td>1580MGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser microscopy</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>FV 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>FISHER SCEINTIFIC</td>
			<td>O221S366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Korea Ace Scientific</td>
			<td>HC.203-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand tally counter</td>
			<td>KTRIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>MARIENFIELD</td>
			<td>0650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>DAECHUNG SCIENCE</td>
			<td>CB-BMMS C-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal syringe</td>
			<td>IWASHITA engineering</td>
			<td>SUS BARREL 10CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Hirose</td>
			<td>HC.13-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>JEIOTECH</td>
			<td>OF-12, H070023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>NJ05652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>SAMSUNG</td>
			<td>CRFD-1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltex Mixer</td>
			<td>DAIHAN scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>DAIHAN SCIENTIFIC</td>
			<td>WB-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier</td>
			<td>WASSER LAB</td>
			<td>DI-GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Intron</td>
			<td>IBS-BP007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Daejung</td>
			<td>4018-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIF-1 alpha antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHMT2/SHMT antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab88664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J10857-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from porcine skin</td>
			<td>Dalim tissen</td>
			<td>PC-001-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium-2</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Theromofisher</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311413-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab170190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene-vinyl acetate)&#160;</td>
			<td>Poly science</td>
			<td>06108-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dowhitech</td>
			<td>sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab37415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Samchun</td>
			<td>S0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>TRI020-500-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMSOL Multiphysics 3.5a</td>
			<td>COMSOL AB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMS beamer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in-house software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks Package</td>
			<td colspan="2">Dassault Systems SolidWorks Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d cell-printed hypoxic cancer-on-a-chip for recapitulating pathologic progression of solid cancer

O microambiente do câncer tem um impacto significativo na progressão da doença. Em particular, a hipóxia é o principal motor da sobrevivência do câncer, invasão e chemoresistance. Embora vários modelos in vitro tenham sido desenvolvidos para estudar a patologia do câncer relacionada à hipóxia, a complexa interação do microambiente cancerígeno observado in vivo ainda não foi reproduzida devido à falta de controle espacial preciso. Em vez disso, foram propostas abordagens de biofabricação 3D para criar sistemas microfisiológicos para melhor emulação da ecologia do câncer e avaliação precisa do tratamento anticâncer. Aqui, propomos uma abordagem de impressão celular 3D para fabricar um câncer hipóxico em um chip. Os componentes indutores de hipóxia no chip foram determinados com base em uma simulação computacional da distribuição de oxigênio. Anéis concêntricos de câncer foram impressos usando bioinks contendo células de glioblastoma e células endoteliais para recapitular um tipo de câncer sólido. O chip resultante percebeu a hipóxia central e a malignidade agravada no câncer com a formação de marcadores fisiodicosiológicos representativos. No geral, espera-se que a abordagem proposta para a criação de um sistema microfisiológico mímético de câncer sólido e mímica seja a ponte entre modelos in vivo e in vitro para pesquisa de câncer.

O câncer hipóxico foi desenvolvido usando tecnologia de impressão celular 3D auxiliada por computador para recapitular a hipóxia e a patologia relacionada ao câncer(Figura 1). O transporte e o consumo de oxigênio foram simulados utilizando o modelo de geometria 3D. O chip foi projetado na forma de anéis concêntricos para imitar a difusão e esgotamento do oxigênio radial, em tecidos cancerígenos(Figura 2A). Após a defi...

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3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

A hipóxia é uma marca registrada do microambiente tumoral e desempenha um papel crucial na progressão do câncer. Este artigo descreve o processo de fabricação de um câncer hipóxico baseado na tecnologia de impressão celular 3D para recapitular uma patologia relacionada à hipóxia do câncer.

Câncer hipoxico impresso em células 3D para recapitulando progressão patológica do câncer sólido

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

A hipóxia é um dos principais impulsionadores do desenvolvimento do câncer que induz instabilidade genômica e tumorigênese. Demonstramos um método para gerar hipóxia central em um câncer sólido in vitro baseado na tecnologia de bioimpressão 3D. Usando este método, um gradiente hipoxic de rádio pode ser reproduzido usando uma estratégia simples que combina uma barreira permeável a gás impresso em 3D e uma tampa de vidro.Esta tecnologia de câncer hipóxico em um chip pode ser usada para prever a eficácia da droga para facilitar a prescrição específica de medicamentos anticancerígenos do paciente. E espera-se também que permita um diagnóstico rápido de cânceres agressivos. Para auxiliar na preparação de uma solução de pré-gel de colágeno neutralizado de três mililitros, corte 30 miligramas de esponjas de colágeno em pedaços quadrados de cinco por cinco milímetros.Coloque as peças em um frasco de vidro estéril de 10 mililitros e adicione 2,4 mililitros de 0,2 minga filtro 0,1 ácido clorídrico normal ao frasco para uma incubação de três dias a quatro graus Celsius e 15 revoluções por minuto. Após a digestão, coe qualquer partígena de colágeno não digerida através de um coador de células de 40 mícrons e armazene a solução de colágeno ácido a quatro graus Celsius por até sete dias. Para ajustar o pH da solução pré-gel de colágeno neutralizado de 1%, adicionar 30 microliters de solução vermelha fenol a uma concentração final de 1%e 300 microliters de 10X PBS a uma concentração final de 10%Após a mistura e centrífugação, use um hidróxido de sódio normal para neutralizar o pH a sete, verificando a mudança de cor e adicionar água destilada para obter um volume total de três mililitros.Em seguida, armazene a solução de pré-gel de colágeno ajustada de 1% a 1% a quatro graus Celsius para uso dentro de três dias. Para verificar a gelação da solução de pré-gel de colágeno neutralizado, use uma pipeta de deslocamento positiva para adicionar 50 microliters de gotículas de colágeno a um prato pequeno e incubar as gotículas em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, verifique se o colágeno mudou de uma cor transparente para um branco opaco.Incline o recipiente para confirmar que o colágeno está aderindo ao fundo do recipiente. E despeje PBS na gota para confirmar que a construção do colágeno não quebra a solução. Para imprimir em 3D um molde PEVA sacrificial, clique em Arquivo e salvar o tipo de arquivo como STL para converter o arquivo CAD 3D em um arquivo STL e clique em Opção e formulário de saída como ASCII para gerar o código G.Para importar o arquivo STL gerado, clique em Arquivo e abra o arquivo STL e selecione o arquivo STL salvo. Para gerar automaticamente o código G do molde PEVA sacrificial, selecione o modelo de fatia do trocador STL-CAD. Em seguida, para gerar caminhos de impressão para a fabricação do chip, use um bocal de precisão de 50 medidores a uma pressão pneumática de 500 quilopascals a 110 graus Celsius para imprimir o molde de PEVA sacrificial em um slide de histologia hidrofílica adesivo estéril.Para lançar a barreira PDMS, misturou seis mililitros de elastômero base PDMS e 600 microliters de agente de cura por cinco minutos em um reservatório plástico e carregar a solução homogeneamente misturada em uma seringa descartável de 10 mililitros. Equipei a seringa com uma ponta de dispensa de distribuição de plástico de 20 bitolas e encha o molde de PEVA sacrificial com a solução PDMS combinada. O PDMS misturado encherá este molde de PEVA sacrificial com uma superfície convexa e a barreira será maior que a do molde.Depois de curar a barreira PDMS em um forno de 40 graus Celsius por mais de 36 horas para evitar derreter o PEVA, use um par de pinças de precisão para desprender o molde de PEVA sacrificial e esterilizar a barreira permeável do gás a 120 graus Celsius em uma autoclave. Para misturar a solução com células cancerígenas, resuspenja cada tipo de pelota celular coletada em 20 microliters de meio de cultura e adicione um mililitro de solução pré-gel de colágeno neutralizado em cada uma das suspensões celulares resuspended em gelo molhado com mistura suave. Use uma pipeta de deslocamento positiva para misturar cada suspensão celular.Quando forem obtidas soluções homogêneas, use uma pipeta descartável positiva para transferir os bioinks de colágeno encapsulados para três seringas descartáveis mililitros e armazene as seringas a quatro graus Celsius até a impressão celular 3D. Para impressão 3D de anéis concêntricos de câncer- stroma, converta o arquivo 3D CAD apropriado em um formato de arquivo STL e use um trocador STL-CAD para gerar um código G dos anéis concêntricos de câncer. Carregue os bioinks de colágeno encapsulados da célula na cabeça da impressora 3D e coloque a temperatura da cabeça e da placa em 15 graus Celsius.Carregue o caminho de impressão gerado no software de controle da impressora 3D e clique Em Iniciar a impressão dos bioinks de colágeno na barreira permeável do gás de acordo com o código G carregado com uma agulha de plástico calibre 18 a uma pressão pneumática de aproximadamente 20 quilopascals a 15 graus Celsius. No final de cada operação de impressão, coloque manualmente uma tampa de vidro esterilizada de 22 por 50 milímetros em cima da barreira permeável a gás para gerar o gradiente hipóxico. Depois de gerar três câncers hipóxicos em chips, transfira os chips para uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora para cruzar os bioinks de colágeno.Quando todos os cânceres hipóxicos foram impressos, esfregou suavemente os óculos de cobertura em cima das barreiras permeáveis de gás com um raspador de células para uma ligação apertada. Para atualizar o meio de cultura celular para os chips sem separar a construção do câncer, incline os chips e use uma pipeta para introduzir 1,5 mililitros de meio de crescimento celular endotelial ao lado de cada chip. O câncer hipóxico foi projetado na forma de anéis concêntricos para imitar a difusão de oxigênio radial e o esgotamento observado nos tecidos cancerígenos.Após definir o volume de controle de um espaço no qual o oxigênio é difundido e consumido pelas células, uma densidade celular apropriada para a geração de hipóxia central pode ser determinada através da análise de elementos finitos computacionais. Após a impressão celular 3D, uma estrutura de anel concêntrico compartimentalizada de câncer-stroma pode ser criada para reproduzir as características anatômicas do câncer sólido. Quantitativamente, a viabilidade celular pós-impressão é tipicamente maior que 96% confirmando que as condições de fabricação são apropriadas para câncer e células estromicas.Nesta análise representativa, dois grupos foram comparados de acordo com a presença e ausência do gradiente de oxigênio para verificar os efeitos de um gradiente hipóxico na progressão do câncer. Em ambas as condições, as células endoteliais positivas de CD31 estavam presentes nas regiões periféricas, indicando que construtos vivos espacialmente padronizados foram produzidos utilizando tecnologia de bioimpressão 3D. Em comparação com a condição negativa do gradiente de oxigênio, a condição positiva do gradiente demonstrou um gradiente hipóxico, indicando a expressão gradual do HIF1 alfa.Também foram observadas células pseudopalisaded positivas SHMT2 e células pluripotentes positivas SOX2 e células pluripotentes positivas SOX2, indicativo da presença de características fisiofisiológicas agressivas do câncer sólido. O câncer hipóxico on-a-chip é uma ferramenta útil para investigar as características fisiopatológicas dos cânceres sólidos e o crosstalk dinâmico entre células cancerígenas e tumorigênese promovendo o microambiente. Como a metodologia pode ser adaptada para um projeto de medicamentos específico do paciente em um prazo razoável, espera-se que essa abordagem altere a lacuna entre modelos in vivo e in vitro de câncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Bioengenharia

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...