Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Faculty Research Council an K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA) finanziert. A.N.G. und J.F.M. sind Empfänger des Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. und B.M.R. sind Empfänger der STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Wir danken Dr. Matthew Berezuk und Dr. Philip Cox für die Beratung zu den Bioassays.

HINWEIS: Mehrere Chemikalien und biologische Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Konsultieren Sie vor der Verwendung die relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie vor Beginn des Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (von der Occupational Safety and Health Administration zugelassene Schutzbrille, geeignete Handschuhe, Laborkittel, durchgehende Hosen und geschlossene Schuhe). Darüber hinaus sollten Sie bei der Synthese und dem Umgang mit toxis...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

Die Synthese der spirocyclischen Verbindungen basierte auf früheren Forschungen dieses Labors, jedoch mit einigen Modifikationen (Abbildung 1)11,12. Der Fortschritt jedes Reaktionsschrittes wurde mittels IR-Spektroskopie überwacht. Michael Zusatz des REM-Linkers 1 mit Furfurylamin ergab polymergebundenes 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Aus dem ...

Es ist bekannt, dass die kleinmolekulare Hemmung der Interaktion von E3-Ubiquitin-Ligase-Maus-Doppelminuten-2-Homolog (MDM2) mit p53 die p53-vermittelte Induktion der Tumorzellapoptose 1,2,3 wiederherstellt. MDM2 ist ein negativer Regulator des p53-Signalwegs und wird in Krebszellenoft überexprimiert 4,5,6,7,8,9. Neuere kristallographische und biochemische Studien haben gezeigt, dass kleine Moleküle, die ein spirozyklisches Gerüst enthalten, MDM2-p53-Wechselwirkungen wirksam hemmen können10. Das spirozyklische Gerüst (Abbildung 1, blau schattiert) gilt als privilegiertes Motiv, da die Derivatisierung dieses starren orthogonalen Ringsystems zur Entdeckung neuartiger therapeutischer Medikamente geführt hat. Der Zugang zu dieser interessanten Architektur stellt eine Herausforderung dar, wenn traditionelle organische Synthesetechniken verwendet werden. Obwohl die therapeutischen Wirkungen spirozyklischer Moleküle in biologischen Systemen untersucht wurden, ist die Synthese dieser Moleküle immer noch ein umständlicher Prozess. Unerwünschte Nebenprodukte, raue Bedingungen und gefährliche Übergangsmetalle sind oft problematisch.
Die mögliche Verwendung des spirozyklischen Motivs in der Arzneimittelentwicklung führte zur Entwicklung eines Protokolls, das die Festphasensynthese verwendet, um eine Bibliothek von Molekülen mit dem Motiv zusätzlich zu anderen austauschbaren funktionellen Gruppen11,12 zu erzeugen. Die Trennung von Produkten und Reaktanten zwischen den Schritten könnte durch die einfache Verwendung eines REM-Linkers erreicht werden, der an einer Harzperle und einem Festphasenfilterbehälter befestigt ist. Dies würde die Stufen reduzieren und möglicherweise die Erträge erhöhen. Dieser synthetische Ansatz könnte eine Vielzahl potenzieller Arzneimittelkandidaten hervorbringen. Die Wirksamkeit dieser Moleküle in einem biologischen System würde jedoch weitere Untersuchungen erfordern.
Um die Zytotoxizität dieser spirocyclischen Verbindungen zu bestimmen, wurde der MTT-Assay13,14 verwendet. Diese Methode misst die Zelllebensfähigkeit und kann zur indirekten Bestimmung der Zellzytotoxizität verwendet werden. Verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren wurden kultivierten Zellen in einer 96-Well-Platte zugesetzt, und der Anteil lebender Zellen wurde durch kolorimetrische Analyse des Ausmaßes der Reduktion von gelbem MTT durch mitochondriale Dehydrogenasen zur violetten Formazanverbindung gemessen (Abbildung 2). Die Aktivität wird am häufigsten als IC 50-Wert angegeben - die Konzentration, bei der das Zellwachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle um50% gehemmt wird. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für den MTT-Test und die vorläufigen Ergebnisse dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

Spirozyklische Heterocyclen wurden kürzlich in der Literatur als potenzielle Medikamente für die Krebstherapie beschrieben. Die Synthese dieser neuartigen orthogonalen Ringsysteme ist eine Herausforderung. Eine effiziente Methodik zur Synthese dieser Verbindungen wurde kürzlich veröffentlicht, die die Festphasensynthese in vier Schritten anstelle der zuvor berichteten fünf Schritte beschreibt. Der Vorteil dieser kürzeren Synthese ist der Wegfall der Verwendung toxischer Reagenzien. Es erwies sich heraus, dass REM-Linkerharz (Low Loading) Regenerating Michael (REM) entscheidend für die Synthese war, da hochladende Versionen die Zugabe von Reagenzien mit sperrigem Phenyl und aromatischen Seitenketten verhinderten. Der kolorimetrische 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der mikromolaren Konzentrationen dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle in vitro zu untersuchen. MTT ist kommerziell leicht erhältlich und liefert relativ schnelle, zuverlässige Ergebnisse, was diesen Assay ideal für diese spirocyclischen Heterocyclen macht. Orthogonale Ringstrukturen sowie Furfurylamin (eine Vorstufe der Synthesemethode, die ein ähnliches 5-gliedriges Ringmotiv enthält) wurden getestet.

Die spirozyklischen Oxime 6 und 7 wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls synthetisiert (Abbildung 1). Michaels Zusatz von Furfurylamin zu einem REM-Linker 1b ergab polymergebundenes Harz 2. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Infrarotspektroskopie (IR) überwacht, indem das Verschwinden des α,β-ungesättigten Esters bei 1722 cm-1 nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Spirozyklisch gebundenes Harz 4 wurde aus 2 über ein transientes Zw...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Dieses Protokoll verwendet eine recycelbare und modifizierte Methode zur Herstellung spirocyclischer Verbindungen. Der MTT-Assay hilft, die Frage nach der Zytotoxizität dieser neuartigen Moleküle zu beantworten. Diese Technik erzeugt neuartige modifizierbare Moleküle unter Verwendung eines regenerierenden Ausgangsmaterials.Der MTT-Assay liefert relativ schnelle und einfach zu analysierende biologische Ergebnisse Beginnen Sie mit der Durchführung der Festphasensynthese der spirozyklischen Heterozyklen sechs und sieben, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie 20 Milliliter einer fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung mit sterilem PBS als Verdünnungsmittel vor. Filtern und lagern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius.Anschließend wird eine Eins-zu-eins-Verdünnung der MTT-Lösung in DMEM hergestellt. Bereiten Sie je einen Milliliter Stammlösungen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Testverbindungen aus DMSO vor. Lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.Bereiten Sie 200 Mikroliter pro Dosis der Arbeitslösungen von Testverbindungen durch Verdünnen der Stammkonzentrationen vor. Ein bis 1000 in serumfreiem Medium. In den Gewebekultursamen behandelten COS-sieben Zellen in vollständigem Medium auf flachem Boden Gewebekultur 96 Well-Platten mit einer Konzentration von 4.000 Zellen pro 200 Mikroliter pro Well.Mit einem Mehrkanal-Pipeter. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Am nächsten Tag saugen Sie den Überstand aus den Brunnen mit einer Glasweidepipette ab, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist.Dosieren Sie die Zellen dreifach mit den Testverbindungen unter Verwendung der zuvor hergestellten Arbeitslösungen. Dann bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Nach 24 Stunden saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen ab und fügen Sie jedem Bohrloch 200 Mikroliter MTT-Lösung hinzu.Inkubieren Sie die Platte für vier Stunden. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen ab, ohne die violetten Formazankristalle zu stören. Fügen Sie 200 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung hinzu, um die Kristalle aufzulösen.Anschließend die Platte bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Messen Sie die Absorption für jede Vertiefung bei 590 oder 600 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenleser. Verwenden Sie Vertiefungen ohne Zellen als Hintergrund und mitteln Sie den Absorptionswert.Die Spirozyklischen Gox-Nähte sechs und sieben wurden mit einem modifizierten Protokoll synthetisiert. Der Verlauf der Reaktion wurde überwacht, indem das Verschwinden der alpha-beta-ungesättigten Esther mittels Infrarotspektroskopie nachgewiesen wurde. Der MTT-Assay wurde zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet.Cisplatin, von dem bekannt ist, dass es bei hohen Konzentrationen den Zelltod induziert, diente als Positivkontrolle. Wie erwartet, ist die Zelllebensfähigkeit umso geringer, je höher die Konzentration von Cisplatin ist. Der MTT-Assay wurde dann verwendet, um die spirocyclischen Verbindungen sechs und sieben und Furfurylamin zu testen.Furfurylamin und spirozyklische Gox-Naht sechs zeigten eine ähnliche Zytotoxizität. Die Toxizität der spirocyclischen Verbindung sieben war jedoch deutlich größer als die von Furfurylamin und sechs. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die N-Alkylierung unter Verwendung sperriger Acylhalogenide die Beta-Eliminationsrate reduziert und somit die Produktausbeute verringert.

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