Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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इस काम को केएसएच (अनुसंधान और अनुदान कार्यालय, अज़ुसा पैसिफिक यूनिवर्सिटी-यूएसए) को संकाय अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ए.एन.जी. और जे.एफ.एम. विद्वानों के स्नातक अनुसंधान अनुभव (SURE) फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं। एस.के.एम. और बी.एम.आर. एसटीईएम रिसर्च फैलोशिप अनुदान (सेंटर फॉर रिसर्च इन साइंस, अज़ुसा पैसिफिक यूनिवर्सिटी-यूएसए) के प्राप्तकर्ता हैं। हम बायोएस पर मार्गदर्शन के लिए डॉ मैथ्यू बेरेजुक और डॉ फिलिप कॉक्स के आभारी हैं।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कई रसायन और जैविक अभिकर्मक विषाक्त और कार्सिनोजेनिक हैं। उपयोग करने से पहले प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। प्रयोग शुरू करने से पहले उ?...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों का संश्लेषण इस प्रयोगशाला द्वारा किए गए पिछले शोध पर आधारित था, लेकिन कुछ संशोधनों के साथ (चित्रा 1)11,12)। आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्?...

पी 53 के साथ ई 3 यूबिकिटिन-लिगेज माउस डबल मिनट 2 होमोलॉग (एमडीएम 2) की बातचीत के छोटे-अणु अवरोध को ट्यूमर सेल एपोप्टोसिस 1,2,3 के पी 53-मध्यस्थता प्रेरण को बहाल करने के लिए जाना जाता है। एमडीएम 2 पी 53 मार्ग का एक नकारात्मक नियामक है और अक्सर कैंसर कोशिकाओं 4,5,6,7,8,9 में अतिरंजित होता है। हाल के क्रिस्टलोग्राफिक और जैव रासायनिक अध्ययनों से पता चला है कि स्पाइरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क वाले छोटे अणु एमडीएम 2-पी 53 इंटरैक्शन को प्रभावी ढंग से रोकसकते हैं। स्पाइरोसाइक्लिक फ्रेमवर्क (चित्रा 1, नीले रंग में छायांकित) को एक विशेषाधिकार प्राप्त आकृति माना जाता है क्योंकि इस कठोर ऑर्थोगोनल रिंग सिस्टम के व्युत्पन्नीकरण ने नई चिकित्सीय दवाओं की खोज की है। पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण तकनीकों का उपयोग करते समय इस दिलचस्प वास्तुकला तक पहुंचना एक चुनौती है। यद्यपि जैविक प्रणालियों में स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के चिकित्सीय प्रभावों की जांच की गई है, इन अणुओं का संश्लेषण अभी भी एक बोझिल प्रक्रिया है। अवांछित पक्ष उत्पाद, कठोर परिस्थितियों का उपयोग करते हुए, और खतरनाक संक्रमण धातुएं अक्सर समस्याग्रस्त होती हैं।
दवा के विकास में स्पाइरोसाइक्लिक मोटिफ के संभावित उपयोग ने अन्य विनिमेय कार्यात्मक समूहों11,12 के अलावा आकृति के साथ अणुओं की एक लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए ठोस-चरण संश्लेषण का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का विकास किया। चरणों के बीच उत्पादों और अभिकारकों का पृथक्करण केवल राल मोती और एक ठोस-चरण फिल्टर पोत से जुड़े आरईएम लिंकर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह कदमों में कटौती करेगा और संभावित रूप से पैदावार में वृद्धि करेगा। यह सिंथेटिक दृष्टिकोण संभावित दवा उम्मीदवारों की एक बड़ी सरणी का उत्पादन कर सकता है। हालांकि, जैविक प्रणाली में इन अणुओं की प्रभावशीलता को आगे की जांच की आवश्यकता होगी।
इन स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करने के लिए, एमटीटी परख13,14 को नियोजित किया गया था। यह विधि सेल व्यवहार्यता को मापती है और अप्रत्यक्ष रूप से सेल साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जा सकती है। अवरोधकों की विभिन्न सांद्रता को 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ा गया था, और जीवित कोशिकाओं के अनुपात को माइटोकॉन्ड्रियल डिहाइड्रोजनेज द्वारा बैंगनी फॉर्माज़ान यौगिक (चित्रा 2) में पीले एमटीटी की कमी की सीमा के वर्णमिति विश्लेषण द्वारा मापा गया था। गतिविधि को अक्सर आईसी50 मूल्य के रूप में रिपोर्ट किया जाता है- एकाग्रता जिस पर कोशिका वृद्धि अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष 50% तक बाधित होती है। यह पेपर एमटीटी परख के लिए प्रोटोकॉल और इन उपन्यास स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के प्रारंभिक परिणामों का वर्णन करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

स्पाइरोसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल को हाल ही में साहित्य में कैंसर चिकित्सा के लिए संभावित दवाएं बताया गया है। इन उपन्यास ऑर्थोगोनल रिंग सिस्टम का संश्लेषण चुनौतीपूर्ण है। इन यौगिकों को संश्लेषित करने के लिए एक कुशल पद्धति हाल ही में प्रकाशित की गई थी जिसने पहले रिपोर्ट किए गए पांच चरणों के बजाय चार चरणों में ठोस चरण संश्लेषण का वर्णन किया था। इस छोटे संश्लेषण का लाभ विषाक्त अभिकर्मकों के उपयोग का उन्मूलन है। कम-लोडिंग रीजेनरेटिंग माइकल (आरईएम) लिंकर-आधारित राल को संश्लेषण में महत्वपूर्ण पाया गया क्योंकि उच्च-लोडिंग संस्करणों ने भारी फिनाइल और सुगंधित साइड चेन वाले अभिकर्मकों को जोड़ने से रोक दिया। इन नए स्पाइरोसाइक्लिक अणुओं के माइक्रोमोलर सांद्रता की साइटोटॉक्सिसिटी की जांच करने के लिए कलरिमेट्रिक 3-(4', 5'-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2'-यल)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख का उपयोग किया गया था। एमटीटी व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत तेज, विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करता है, जिससे यह परख इन स्पाइरोसाइक्लिक हेटरोसाइकिल के लिए आदर्श हो जाती है। ऑर्थोगोनल रिंग संरचनाओं के साथ-साथ फरफ्यूरिलमाइन (संश्लेषण विधि में एक अग्रदूत जिसमें एक समान 5-सदस्यीय रिंग मोटिफ होता है) का परीक्षण किया गया था।

स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम 6 और 7 को एक संशोधित प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। एक आरईएम लिंकर 1 बी में फरफ्यूरिलमाइन के माइकल ने बहुलक-बाध्य राल 2 को जोड़ा। 1722 सेमी -1 (<stro...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

यहां, हम पहले संश्लेषित स्पाइरोसाइक्लिक ऑक्सीम का परीक्षण करने के लिए 3-(4', 5'-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2'-yl)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) का उपयोग करके एक बायोसेसे का वर्णन करते हैं।

कार्यात्मक स्पाइरोसाइक्लिक हेटेरोसाइकिल संश्लेषण और साइटोटॉक्सिसिटी परख

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

यह प्रोटोकॉल स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों के उत्पादन में एक पुनर्नवीनीकरण और संशोधित विधि का उपयोग करता है। एमटीटी परख इन नए अणुओं की साइटोटॉक्सिसिटी से संबंधित प्रश्न का उत्तर देने में मदद करता है। यह तकनीक एक पुनरुत्पादक प्रारंभिक सामग्री का उपयोग करके नवीन परिवर्तनीय अणुओं का उत्पादन करती है।एमटीटी परख अपेक्षाकृत त्वरित, और जैविक परिणामों का विश्लेषण करने में आसान प्रदान करता है, जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, स्पिरोसाइक्लिक हेटेरो चक्र छह और सात के ठोस चरण संश्लेषण करके शुरू करें। डिल्यूएंट के रूप में बाँझ पीबीएस का उपयोग करके पांच मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर एमटीटी समाधान के 20 मिलीलीटर तैयार करें। घोल को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर छानकर स्टोर करें।फिर, डीएमईएम में एमटीटी समाधान का एक-से-एक कमजोर पड़ने की तैयारी करें। डीएमएसओ में परीक्षण यौगिकों के 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टॉक समाधान का एक मिलीलीटर तैयार करें। इन्हें माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।स्टॉक सांद्रता को कम करके परीक्षण यौगिकों के कामकाजी समाधानों की प्रति खुराक 200 माइक्रोलीटर तैयार करें। सीरम मुक्त माध्यम में एक से 1000। ऊतक संवर्धन बीजों में, सीओएस सात कोशिकाओं ने फ्लैट बॉटम टिशू कल्चर पर पूर्ण माध्यम में 4,000 कोशिकाओं प्रति 200 माइक्रोलीटर प्रति कुएं की एकाग्रता पर 96 अच्छी तरह से प्लेटों का इलाज किया।एक बहु-चैनल पाइपेटर का उपयोग करना। 5% कार्बन डाइऑक्साइड वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, वैक्यूम पंप से जुड़े ग्लास चरागाह पिपेट का उपयोग करके कुओं से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।पहले से तैयार किए गए समाधानों का उपयोग करके परीक्षण यौगिकों के साथ कोशिकाओं को तीन प्रतियों में खुराक दें। फिर कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें। 24 घंटे के बाद, कुओं से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में एमटीटी घोल के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्लेट को चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बैंगनी फॉर्माज़ेन क्रिस्टल को परेशान किए बिना कुओं से धीरे-धीरे सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें। क्रिस्टल को भंग करने के लिए प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर प्लेट को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 96 वेल प्लेट रीडर का उपयोग करके 590 या 600 नैनोमीटर पर प्रत्येक कुएं के लिए अवशोषण मापें। पृष्ठभूमि के रूप में बिना कोशिकाओं वाले कुओं का उपयोग करें और अवशोषण मूल्य का औसत निकालें।स्पाइरोसाइक्लिक गोक्स सीम छह और सात को एक संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके अल्फा बीटा असंतृप्त एस्तेर के गायब होने का पता लगाकर प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी की गई थी। एमटीटी परख का उपयोग सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया गया था।सिस्प्लैटिन, जो उच्च सांद्रता में कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, ने सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। जैसा कि अपेक्षित था, सिस्प्लाटिन की सांद्रता जितनी अधिक होगी, सेल व्यवहार्यता उतनी ही कम होगी। एमटीटी परख का उपयोग तब स्पाइरोसाइक्लिक यौगिकों छह और सात और फरफ्यूरिलमाइन का परीक्षण करने के लिए किया गया था।फरफ्यूरिलमाइन और स्पाइरोसाइक्लिक गोक्स सीम छह ने समान साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई। हालांकि, स्पाइरोसाइक्लिक यौगिक सात की विषाक्तता फरफ्यूरिलमाइन और छह की तुलना में काफी अधिक थी। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि भारी एसाइल हलाइड्स का उपयोग करके किए गए एन-अल्काइलेशन को बीटा उन्मूलन की दर को कम करने के लिए पाया गया था, जिससे उत्पाद उपज कम हो गई थी।

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