Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Faculty Research Council a K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. sono destinatari della borsa di studio Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. e B.M.R. sono destinatari delle borse di ricerca STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Siamo grati al Dr. Matthew Berezuk e al Dr. Philip Cox per la guida sui saggi biologici.

NOTA: Diversi prodotti chimici e reagenti biologici utilizzati in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima dell'uso. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza approvati dalla Occupational Safety and Health Administration, guanti adeguati, camici da laboratorio, pantaloni lunghi e scarpe chiuse) prima di iniziare l'esperimento. Inoltre, adottare adeguate pratiche di sicurezza durante l'esecuzione della sinte...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

La sintesi dei composti spirociclici era basata su precedenti ricerche condotte da questo laboratorio, ma con alcune modifiche (Figura 1)11,12. L'avanzamento di ogni fase di reazione è stato monitorato mediante spettroscopia IR. Michael aggiunta del linker REM 1 con furfurilammina ha permesso di legare polimericamente 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).</...

È noto che l'inibizione di piccole molecole dell'interazione dell'omologo doppio minuto 2 del topo ubiquitina-ligasi E3 (MDM2) con p53 ripristina l'induzione mediata da p53 dell'apoptosi delle cellule tumorali 1,2,3. MDM2 è un regolatore negativo della via p53 ed è spesso sovraespresso nelle cellule tumorali 4,5,6,7,8,9. Recenti studi cristallografici e biochimici hanno rivelato che piccole molecole contenenti una struttura spirociclica possono inibire efficacemente le interazioni MDM2-p5310. La struttura spirociclica (Figura 1, sfumata in blu) è considerata un motivo privilegiato in quanto la derivatizzazione di questo rigido sistema di anelli ortogonali ha portato alla scoperta di nuovi farmaci terapeutici. L'accesso a questa interessante architettura rappresenta una sfida quando si utilizzano tecniche di sintesi organica tradizionali. Sebbene siano stati studiati gli effetti terapeutici delle molecole spirocicliche nei sistemi biologici, la sintesi di queste molecole è ancora un processo ingombrante. I prodotti collaterali indesiderati, l'utilizzo di condizioni difficili e i metalli di transizione pericolosi sono spesso problematici.
Il potenziale uso del motivo spirociclico nello sviluppo di farmaci ha portato allo sviluppo di un protocollo che utilizza la sintesi in fase solida per generare una libreria di molecole con il motivo in aggiunta ad altri gruppi funzionali intercambiabili11,12. La separazione dei prodotti e dei reagenti tra le fasi potrebbe essere ottenuta semplicemente utilizzando un linker REM collegato a un cordone di resina e un contenitore filtrante in fase solida. Ciò ridurrebbe i passaggi e potenzialmente aumenterebbe i rendimenti. Questo approccio sintetico potrebbe produrre una vasta gamma di potenziali candidati farmaci. Tuttavia, l'efficacia di queste molecole in un sistema biologico richiederebbe ulteriori indagini.
Per determinare la citotossicità di questi composti spirociclici, è stato utilizzato il saggio MTT13,14. Questo metodo misura la vitalità cellulare e può essere utilizzato per determinare indirettamente la citotossicità cellulare. Diverse concentrazioni degli inibitori sono state aggiunte alle cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti e la proporzione di cellule viventi è stata misurata mediante analisi colorimetrica dell'entità della riduzione della MTT gialla da parte delle deidrogenasi mitocondriali al composto formazan viola (Figura 2). L'attività è più spesso riportata come un valore IC 50, la concentrazione alla quale la crescita cellulare è inibita del50% rispetto a un controllo non trattato. Questo articolo descrive il protocollo per il saggio MTT e i risultati preliminari di queste nuove molecole spirocicliche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

Gli eterocicli spirociclici sono stati recentemente riportati in letteratura come potenziali farmaci per la terapia del cancro. La sintesi di questi nuovi sistemi ad anello ortogonale è impegnativa. Recentemente è stata pubblicata una metodologia efficiente per sintetizzare questi composti che descrive la sintesi in fase solida in quattro fasi anziché le cinque fasi precedentemente riportate. Il vantaggio di questa sintesi più breve è l'eliminazione dell'uso di reagenti tossici. La resina a base di linker Regenerating Michael (REM) a basso carico è risultata cruciale nella sintesi poiché le versioni ad alto carico hanno impedito l'aggiunta di reagenti contenenti ingombranti catene laterali feniliche e aromatiche. Il saggio colorimetrico 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) è stato utilizzato per esaminare la citotossicità delle concentrazioni micromolari di queste nuove molecole spirocicliche in vitro. MTT è prontamente disponibile in commercio e produce risultati relativamente veloci e affidabili, rendendo questo test ideale per questi eterocicli spirociclici. Sono state testate strutture ad anello ortogonali e furfurilammina (un precursore nel metodo di sintesi contenente un motivo ad anello simile a 5 membri).

Le ossime spirocicliche 6 e 7 sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato (Figura 1). Michael aggiunta di furfurilammina ad un linker REM 1b ha fornito resina legata al polimero 2. Il progresso della reazione è stato monitorato mediante spettroscopia infrarossa (IR) rilevando la scomparsa dell'estere α,β-insaturo a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 legata allo spirociclico è stata formata da 2 attraverso un intermedio transitorio ...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Questo protocollo utilizza un metodo riciclabile e modificato nella produzione di composti spirociclici. Il test MTT aiuta a rispondere alla domanda relativa alla citotossicità di queste nuove molecole. Questa tecnica produce nuove molecole modificabili utilizzando un materiale di partenza rigenerante.Il test MTT fornisce risultati biologici relativamente rapidi e facili da analizzare Inizia eseguendo la sintesi in fase solida dei cicli etero spirociclici sei e sette, come precedentemente dimostrato. Preparare 20 millilitri di una soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro utilizzando PBS sterile come diluente. Filtrare e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.Quindi, preparare una diluizione uno-a-uno della soluzione MTT in DMEM. Preparare un millilitro ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri di composti in esame in DMSO. Conservali a meno 20 gradi Celsius.Preparare 200 microlitri per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock. Uno a 1000 in mezzo libero da siero. Nei semi di coltura tissutale, COS sette cellule in mezzo completo su coltura tissutale a fondo piatto hanno trattato 96 piastre di pozzetto ad una concentrazione di 4.000 cellule per 200 microlitri per pozzetto.Utilizzando un pipeter multicanale. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aspirare il surnatante dai pozzetti usando una pipetta di pascolo di vetro collegata a una pompa per vuoto.Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro precedentemente preparate. Quindi restituire le cellule all'incubatore. Dopo 24 ore, aspirare il surnatante dai pozzetti e aggiungere 200 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto.Incubare il piatto per quattro ore. Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazane. Aggiungere 200 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli.Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Misurare l'assorbanza per ciascun pozzetto a 590 o 600 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza.Le cuciture gox spirocicliche sei e sette sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato. Il progresso della reazione è stato monitorato rilevando la scomparsa dell'alfa beta insatura Esther utilizzando la spettroscopia infrarossa. Il test MTT è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare.Il cisplatino, che è noto per indurre la morte cellulare ad alte concentrazioni, è servito come controllo positivo. Come previsto, maggiore è la concentrazione di cisplatino, minore è la vitalità cellulare. Il test MTT è stato quindi utilizzato per testare i composti spirociclici sei e sette e la furfurilammina.La furfurilammina e la cucitura spirociclica gox six hanno mostrato citotossicità simile. Tuttavia, la tossicità del composto spirociclico sette era notevolmente maggiore di quella della furfurilammina e sei. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la N-alchilazione eseguita utilizzando alogenuri acilici voluminosi è stata trovata per ridurre il tasso di eliminazione beta riducendo così la resa del prodotto.

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