Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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この研究は、ファカルティリサーチカウンシルからK.S.H.(アズサパシフィック大学研究助成金局-米国)への助成金によって資金提供されました。A.N.G.とJFMは、学術学部研究経験(SURE)フェローシップの受賞者です。S.K.M.とB.M.R.は、STEM研究フェローシップ助成金(米国アズサパシフィック大学科学研究センター)の受賞者です。バイオアッセイの指導をしてくれたマシュー・ベレズク博士とフィリップ・コックス博士に感謝します。

注:このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質および生物学的試薬は、有毒で発がん性があります。使用する前に、関連する製品安全データシート(MSDS)を参照してください。実験を開始する前に、適切な個人用保護具(労働安全衛生局が承認した安全ゴーグル、適切な手袋、白衣、フルレングスのズボン、つま先の開いた靴)を使用してください。さらに、合成を行い、有毒な化学物質や?...

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	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

スピロ環状化合物の合成は、本研究室が実施した先行研究に基づいていましたが、いくつかの変更が加えられています(図1)11,12。各反応工程の進行をIR分光法によりモニターした。REMリンカー1とフルフリルアミンのマイケル添加により、ポリマー結合2が得られました(IR 1722 <sup...

E3ユビキチン-リガーゼマウスダブルミニッツ2ホモログ(MDM2)とp53との相互作用の低分子阻害は、腫瘍細胞アポトーシスのp53媒介誘導を回復させることが知られている1,2,3。MDM2はp53経路の負の調節因子であり、癌細胞でしばしば過剰発現している4、5、6、7、8、9。最近の結晶学的および生化学的研究は、スピロ環状フレームワークを含む小分子がMDM2-p53相互作用を効果的に阻害できることが明らかになりました10。スピロサイクリックフレームワーク(図1、青の網掛け)は、この剛直交環系の誘導体化が新しい治療薬の発見につながったため、特権的なモチーフと考えられています。この興味深いアーキテクチャにアクセスすることは、従来の有機合成技術を使用する場合に課題をもたらします。生体系におけるスピロ環状分子の治療効果は研究されているが、これらの分子の合成は依然として煩雑なプロセスである。過酷な条件を使用した不要な副産物、および危険な遷移金属はしばしば問題になります。
医薬品開発におけるスピロサイクリックモチーフの潜在的な使用は、他の交換可能な官能基に加えてモチーフを有する分子のライブラリを生成するための固相合成を利用するプロトコルの開発につながった11,12。ステップ間の生成物と反応物の分離は、樹脂ビーズと固相フィルター容器に取り付けられたREMリンカーを利用するだけで実現できます。これにより、ステップが削減され、歩留まりが向上する可能性があります。この合成アプローチは、潜在的な薬剤候補の大規模な配列を生成する可能性があります。ただし、生物学的システムにおけるこれらの分子の有効性には、さらなる調査が必要です。
これらのスピロ環状化合物の細胞毒性を決定するために、MTTアッセイ13、14 を採用した。この方法は、細胞生存率を測定し、細胞傷害性を間接的に決定するために使用できます。異なる濃度の阻害剤を96ウェルプレートの培養細胞に添加し、紫色ホルマザン化合物に対するミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる黄色MTTの減少の程度を比色分析により生細胞の割合を測定しました(図2)。活性は、ほとんどの場合、IC50 値(未処理の対照と比較して細胞増殖が50%阻害される濃度)として報告されます。この論文では、MTTアッセイのプロトコルと、これらの新しいスピロ環式分子の予備的な結果について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

スピロ環式複素環は、癌治療のための潜在的な薬物であることが最近文献で報告されている。これらの新しい直交環系の合成は困難である。これらの化合物を合成するための効率的な方法論が最近発表され、以前に報告された5つのステップではなく4つのステップで固相合成が説明されました。この短い合成の利点は、有毒な試薬の使用を排除することです。低負荷再生マイケル(REM)リンカーベースの樹脂は、高負荷バージョンではかさばるフェニルおよび芳香族側鎖を含む試薬の添加が妨げられるため、合成に重要であることがわかりました。比色3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して、これらの新規スピロ環式分子のマイクロモル濃度の細胞毒性をin vitroで調べました。MTTは市販品として容易に入手でき、比較的高速で信頼性の高い結果を生成するため、このアッセイはこれらのスピロ環式複素環に最適です。直交環構造ならびにフルフリルアミン(類似の5員環モチーフを含む合成法の前駆体)を試験した。

スピロ環式オキシム6および7は、改変されたプロトコルを用いて合成した(図1)。REMリンカー1bへのフルフリルアミンのマイケル付加により、ポリマー結合樹脂2を得た。反応の進行は、1722 cm-1でのα,β-不飽和エステルの消失を検出することにより、赤外(IR)分光法によってモニターされました(図3)。スピロ環結合樹脂4は、一過性中間体3を介し...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

ここでは、以前に合成したスピロ環式オキシムをテストするために、3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を使用するバイオアッセイについて説明します。

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

このプロトコルは、スピロ環式化合物を製造する際にリサイクル可能で修正された方法を利用しています。MTTアッセイは、これらの新規分子の細胞毒性に関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は、再生出発物質を用いて新規な修飾可能な分子を生成する。MTTアッセイは、以前に実証したように、比較的迅速で、かつ容易に分析できる生物学的結果を提供するスピロ環式ヘテロサイクル6および7の固相合成を行うことから始める。希釈剤として滅菌PBSを使用して、20ミリリットルの5ミリグラム/ミリリットルのMTT溶液を調製します。溶液をろ過し、摂氏マイナス20度で保管します。次に、DMEMでMTT溶液の1対1希釈液を調製する。DMSO中の試験化合物の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに各1ミリリットルのストック溶液を調製する。マイナス20°Cで保管してください。ストック濃度を希釈することによって、試験化合物の作業溶液の用量あたり200マイクロリットルを調製する。無血清培地で1〜1000。組織培養種子において、平底組織培養上の完全培地中の7細胞を、1ウェルあたり200マイクロリットルあたり4,000細胞の濃度で処理した96ウェルプレート上にCOSした。マルチチャンネルピペッターを使用する。5%二酸化炭素を含む雰囲気中で摂氏37度で24時間細胞をインキュベートします。翌日、真空ポンプに取り付けられたガラス製牧草ピペットを用いてウェルから上清を吸引する。事前に調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3回で細胞に投与します。その後、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、ウェルから上清を吸引し、各ウェルに200マイクロリットルのMTT溶液を加えます。プレートを4時間インキュベートします。紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200マイクロリットルのDMSOを加えて結晶を溶解します。次に、プレートを室温で15分間インキュベートします。96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を590または600ナノメートルで測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。スピロサイクリックゴックスシーム6および7は、修正されたプロトコルを用いて合成された。反応の進行は、赤外分光法を用いてアルファベータ不飽和エステルの消失を検出することによってモニターした。MTTアッセイは、細胞生存率を決定するために使用されました。高濃度で細胞死を誘導することが知られているシスプラチンは、ポジティブコントロールとして機能しました。予想通り、シスプラチンの濃度が高いほど、細胞生存率は低くなります。次いで、MTTアッセイを用いて、スピロ環状化合物6および7ならびにフルフリルアミンを試験した。フルフリルアミンおよびスピロサイクリックゴックスシームシックスは、同様の細胞毒性を示した。しかし、スピロ環状化合物7の毒性は、フルフリルアミンおよび6の毒性よりも著しく大きかった。このプロトコルを試みる場合、かさばるハロゲン化アシルを使用して実行されるN-アルキル化は、ベータ除去の速度を低下させ、したがって生成物収率を低下させることがわかったことに留意してください。

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