Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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이 연구는 교수 연구위원회에서 K.S.H. (연구 및 보조금 사무소, Azusa Pacific University-USA)에 대한 보조금으로 지원되었습니다. ANG와 JFM은 학술 학부 연구 경험 (SURE) 펠로우십의 수혜자입니다. SKM과 BMR은 STEM Research Fellowship Grants (미국 Azusa Pacific University-Science 연구 센터)의 수혜자입니다. 생물학적 분석에 대한 지침을 주신 Matthew Berezuk 박사와 Philip Cox 박사에게 감사드립니다.

알림: 이 프로토콜에 사용되는 여러 화학 물질 및 생물학적 시약은 독성이 있고 발암성입니다. 사용하기 전에 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 실험을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비(산업안전보건청에서 승인한 안전 고글, 적절한 장갑, 실험실 코트, 전신 바지 및 발가락이 막힌 신발)를 사용하십시오. 또한 합성을 수행하고 독성 화학 물질 및 시약(흄 후드)을 취급할 때 적?...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

스피로 클릭 화합물의 합성은이 실험실에서 수행 한 이전 연구를 기반으로했지만 일부 수정되었습니다 (그림 1)11,12. 각 반응 단계의 진행을 IR 분광법으로 모니터링하였다. 마이클푸르푸릴아민과 함께 REM 링커 1의 첨가는 중합체 결합 2(IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1)를 제공하였다.<...

소분자 E3 유비퀴틴-리가아제 마우스의 이중 분2 동족체(MDM2)와 p53의 상호작용의 억제는 종양 세포 사멸 1,2,3의 p53 매개 유도를 회복시키는 것으로 알려져 있다. MDM2는 p53 경로의 음성 조절자이며 종종 암세포 4,5,6,7,8,9에서 과발현됩니다. 최근의 결정학적 및 생화학적 연구에 따르면 스피로사이클릭 프레임워크를 포함하는 소분자가 MDM2-p53 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다10. 스피로사이클릭 프레임워크(그림 1, 파란색으로 음영 처리됨)는 이 단단한 직교 고리 시스템의 유도체화가 새로운 치료 약물의 발견으로 이어짐에 따라 특권적인 모티브로 간주됩니다. 이 흥미로운 아키텍처에 접근하는 것은 전통적인 유기 합성 기술을 사용할 때 어려움을 겪습니다. 생물학적 시스템에서 스피로 사이 클릭 분자의 치료 효과가 조사되었지만 이러한 분자의 합성은 여전히 번거로운 과정입니다. 가혹한 조건을 사용하는 원치 않는 부산물 및 위험한 전이 금속은 종종 문제가됩니다.
약물 개발에서 스피로 사이 클릭 모티프의 잠재적 인 사용은 다른 상호 교환 가능한 작용기11,12 이외에 모티프를 갖는 분자 라이브러리를 생성하기 위해 고체상 합성을 활용하는 프로토콜의 개발로 이어졌다. 단계 간 생성물과 반응물의 분리는 수지 비드와 고체상 필터 용기에 부착된 REM 링커를 간단히 활용하여 달성할 수 있습니다. 이것은 단계를 줄이고 잠재적으로 수율을 증가시킬 것입니다. 이 합성 접근법은 많은 잠재적 인 약물 후보를 생성 할 수 있습니다. 그러나 생물학적 시스템에서 이러한 분자의 효과는 추가 조사가 필요합니다.
이들 스피로사이클릭 화합물의 세포독성을 결정하기 위해, MTT 분석13,14를 사용하였다. 이 방법은 세포 생존율을 측정하고 세포 세포 독성을 간접적으로 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 96웰 플레이트에서 배양된 세포에 다양한 농도의 억제제를 첨가하고, 보라색 포르마잔 화합물에 대한 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 노란색 MTT의 감소 정도를 비색 분석으로 비색 분석하여 측정했습니다(그림 2). 활성은 가장 자주 IC 50 값, 즉 세포 성장이 처리되지 않은 대조군에 비해50% 억제되는 농도로 보고됩니다. 이 논문은 MTT 분석의 프로토콜과 이러한 새로운 스피로 사이클릭 분자의 예비 결과를 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

스피로 사이 클릭 헤테로 사이클은 최근 암 치료를위한 잠재적 인 약물로 문헌에서보고되었습니다. 이러한 새로운 직교 고리 시스템의 합성은 어렵습니다. 이들 화합물을 합성하기 위한 효율적인 방법론이 최근에 발표되었는데, 이는 이전에 보고된 5단계가 아닌 4단계로 고체상 합성을 기술하였다. 이 짧은 합성의 장점은 독성 시약의 사용을 제거하는 것입니다. 저로딩 재생 마이클(REM) 링커 기반 수지는 고로딩 버전이 부피가 큰 페닐 및 방향족 측쇄를 포함하는 시약의 첨가를 방지하므로 합성에 중요한 것으로 밝혀졌습니다. 비색 3- (4 ', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 사용하여 시험관 내에서 이러한 새로운 스피로 사이 클릭 분자의 마이크로 몰 농도의 세포 독성을 조사했습니다. MTT는 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며 비교적 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 생성하므로 이 분석은 이러한 스피로사이클릭 헤테로사이클에 이상적입니다. 직교 고리 구조 뿐만 아니라 푸르푸릴아민(유사한 5-원 고리 모티프를 함유하는 합성 방법의 전구체)을 시험하였다.

스피로사이클릭 옥심 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성되었습니다(그림 1). 마이클-푸르푸릴아민을 REM 링커 1b에 첨가하여 중합체-결합된 수지 2를 수득하였다. 반응의 진행은 1722 cm-1에서 α,β- 불포화 에스테르의 소실을 검출함으로써 적외선 (IR) 분광법에 의해 모니터링되었다 (그림 3). 스피로사이클릭 결합 수지 4는 일시적인 중간체 3...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

이 프로토콜은 스피로 클릭 화합물을 생산할 때 재활용 가능하고 변형 된 방법을 사용합니다. MTT 분석은 이러한 새로운 분자의 세포 독성과 관련된 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 재생 출발 물질을 사용하여 새로운 변형 가능한 분자를 생산합니다.MTT 분석은 이전에 입증된 바와 같이 스피로사이클릭 헤테로사이클 6 및 7의 고체상 합성을 수행하여 시작하는 비교적 빠르고 쉬운 생물학적 결과를 제공합니다. 희석제로 멸균 PBS를 사용하여 밀리리터당 5밀리그램의 MTT 용액 20밀리리터를 준비합니다. 용액을 여과하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.이어서, DMEM에서 MTT 용액의 일대일 희석액을 준비한다. DMSO에서 테스트 화합물의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 각각 1 밀리리터의 스톡 용액을 준비하십시오. 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.스톡 농도를 희석하여 시험 화합물의 작업 용액 당 200 마이크로 리터를 준비하십시오. 혈청이없는 배지에서 1에서 1000까지. 조직 배양 종자에서, COS 7 세포를 평평한 바닥 조직 배양 위에 완전한 배지로 웰 당 200 마이크로리터당 4, 000 세포의 농도로 96 웰 플레이트를 처리하였다.다중 채널 파이퍼 사용. 세포를 5%이산화탄소를 포함하는 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 진공 펌프에 부착 된 유리 목초지 피펫을 사용하여 우물에서 상청액을 흡인하십시오.이전에 준비된 작업 용액을 사용하여 시험 화합물로 세포를 3 배로 투여하십시오. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24 시간 후, 웰에서 상청액을 흡입하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 MTT 용액을 첨가한다.플레이트를 4 시간 동안 배양하십시오. 보라색 포르 마잔 결정을 방해하지 않고 우물에서 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 결정을 용해시키기 위해 각 웰에 200 마이크로 리터의 DMSO를 첨가하십시오.그런 다음 플레이트를 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 96웰 플레이트 리더를 사용하여 590 또는 600나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 세포가 없는 웰을 배경으로 사용하고 흡광도 값을 평균화합니다.스피로사이클릭 곡스 이음새 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 반응의 진행은 적외선 분광법을 사용하여 알파 베타 불포화 에스더의 소멸을 검출함으로써 모니터링하였다. MTT 분석을 세포 생존율을 결정하기 위해 사용하였다.고농도에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 시스플라틴은 양성 대조군으로 작용했습니다. 예상대로, 시스플라틴의 농도가 높을수록 세포 생존율이 낮아진다. 이어서, MTT 분석을 사용하여 스피로사이클릭 화합물 6 및 7과 푸르푸릴아민을 시험하였다.푸르푸릴아민 및 스피로고사이클릭 심식스는 유사한 세포독성을 나타내었다. 그러나, 스피로 클릭 화합물 7의 독성은 푸르 푸릴 아민 및 6의 독성보다 눈에 띄게 컸다. 이 프로토콜을 시도할 때 부피가 큰 아실 할라이드를 사용하여 수행된 N-알킬화는 베타 제거 속도를 감소시켜 제품 수율을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

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Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

의 마이크로 웨이브를 이용한 원 - 냄비 합성 N - succinimidyl - 4 - [ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

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