Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
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Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa da Faculdade para K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. são destinatários da Bolsa de Experiência de Pesquisa de Graduação Acadêmica (SURE). S.K.M. e B.M.R. são beneficiários das Bolsas de Pesquisa STEM (Centro de Pesquisa em Ciência, Azusa Pacific University-EUA). Somos gratos ao Dr. Matthew Berezuk e ao Dr. Philip Cox pela orientação sobre os bioensaios.

NOTA: Vários produtos químicos e reagentes biológicos utilizados neste protocolo são tóxicos e cancerígenos. Consulte as fichas de dados de segurança do material (FISPQ) relevantes antes de utilizar. Use equipamentos de proteção individual apropriados (óculos de segurança aprovados pela Administração de Segurança e Saúde Ocupacional, luvas adequadas, jalecos, calças de corpo inteiro e sapatos fechados) antes de iniciar o experimento. Além disso, adote práticas de segurança apropriadas ao realizar a sí...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

A síntese dos compostos espirocíclicos foi baseada em pesquisas anteriores realizadas por este laboratório, porém com algumas modificações (Figura 1)11,12. O progresso de cada etapa de reação foi monitorado por espectroscopia de RI. Michael adição do ligador REM 1 com furfurilamina proporcionada polímero ligado 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).<sup...

Sabe-se que a inibição de moléculas pequenas da interação do camundongo E3 ubiquitina-ligase duplo minuto 2 (MDM2) com p53 restaura a indução mediada pela p53 da apoptose de células tumorais 1,2,3. O MDM2 é um regulador negativo da via p53 e é frequentemente superexpresso em células cancerígenas 4,5,6,7,8,9. Estudos cristalográficos e bioquímicos recentes revelaram que pequenas moléculas contendo uma estrutura espirocíclica podem efetivamente inibir as interações MDM2-p5310. A estrutura espirocíclica (Figura 1, sombreada em azul) é considerada um motivo privilegiado, pois a derivatização desse sistema rígido de anéis ortogonais levou à descoberta de novas drogas terapêuticas. Acessar essa arquitetura interessante representa um desafio ao usar técnicas tradicionais de síntese orgânica. Embora os efeitos terapêuticos de moléculas espirocíclicas em sistemas biológicos tenham sido investigados, a síntese dessas moléculas ainda é um processo complicado. Produtos secundários indesejados, usando condições adversas e metais de transição perigosos são muitas vezes problemáticos.
O potencial uso do motivo espirocíclico no desenvolvimento de fármacos levou ao desenvolvimento de um protocolo utilizando síntese em fase sólida para gerar uma biblioteca de moléculas com o motivo, além de outros grupos funcionais intercambiáveis11,12. A separação de produtos e reagentes entre as etapas pode ser alcançada simplesmente utilizando um ligador REM ligado a um grânulo de resina e um recipiente de filtro de fase sólida. Isso reduziria as etapas e potencialmente aumentaria os rendimentos. Essa abordagem sintética poderia produzir uma grande variedade de potenciais candidatos a medicamentos. No entanto, a eficácia dessas moléculas em um sistema biológico exigiria uma investigação mais aprofundada.
Para determinar a citotoxicidade desses compostos espirocíclicos, foi empregado o ensaio MTT13,14. Este método mede a viabilidade celular e pode ser usado para determinar indiretamente a citotoxicidade celular. Diferentes concentrações dos inibidores foram adicionadas às células cultivadas em uma placa de 96 poços, e a proporção de células vivas foi medida pela análise colorimétrica da extensão da redução do MTT amarelo pelas desidrogenases mitocondriais ao composto formazano roxo (Figura 2). A atividade é mais frequentemente relatada como um valor de CI 50 - a concentração na qual o crescimento celular é inibido em50% em relação a um controle não tratado. Este trabalho descreve o protocolo para o ensaio de MTT e os resultados preliminares dessas novas moléculas espirocíclicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

Heterociclos espirocíclicos têm sido recentemente relatados na literatura como potenciais drogas para a terapia do câncer. A síntese desses novos sistemas de anéis ortogonais é um desafio. Uma metodologia eficiente para sintetizar esses compostos foi publicada recentemente que descreveu a síntese em fase sólida em quatro etapas, em vez das cinco etapas relatadas anteriormente. A vantagem desta síntese mais curta é a eliminação do uso de reagentes tóxicos. A resina à base de ligador Regenerating Michael (REM) de baixa carga foi considerada crucial na síntese, pois as versões de alta carga impediram a adição de reagentes contendo fenil volumoso e cadeias laterais aromáticas. O ensaio colorimétrico de brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para examinar a citotoxicidade das concentrações micromolares destas novas moléculas espirocíclicas in vitro. O MTT está prontamente disponível comercialmente e produz resultados relativamente rápidos e confiáveis, tornando este ensaio ideal para esses heterociclos espirocíclicos. Estruturas de anéis ortogonais, bem como furfurilamina (um precursor no método de síntese contendo um motivo de anel semelhante de 5 membros) foram testados.

Os oximas espirocíclicos 6 e 7 foram sintetizados por meio de um protocolo modificado (Figura 1). A adição de furfurilamina a um ligador REM 1b proporcionou resina 2 ligada ao polímero. O progresso da reação foi monitorado por espectroscopia de infravermelho (IR), detectando-se o desaparecimento do éster α,β-insaturado a 1722 cm-1 (Figura 3). A resina espirocíclica 4 foi formada a partir de 2 através de um intermediário transitório 3. A h...

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Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Aqui, descrevemos um bioensaio usando brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para testar oximas espirocíclicos previamente sintetizados.

Síntese Espirocíclica Funcionalizada de Heterociclos e Ensaio de Citotoxicidade

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Este protocolo utiliza um método reciclável e modificado na produção de compostos espirocíclicos. O ensaio MTT ajuda a responder à questão relativa à citotoxicidade dessas novas moléculas. Esta técnica produz novas moléculas modificáveis usando um material de partida regenerador.O ensaio MTT fornece resultados biológicos relativamente rápidos e fáceis de analisar Comece realizando a síntese de fase sólida dos heterociclos espirocíclicos seis e sete, como demonstrado anteriormente. Prepare 20 mililitros de uma solução de MTT de cinco miligramas por mililitro usando PBS estéril como diluente. Filtrar e conservar a solução a menos 20 graus Celsius.Em seguida, prepare uma diluição um-para-um da solução de MTT em DMEM. Preparar um mililitro cada de soluções-estoque em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro de compostos de teste em DMSO. Armazene-os a menos 20 graus Celsius.Preparar 200 microlitros por dose das soluções de trabalho dos compostos de ensaio, diluindo as concentrações de reserva. Um a 1000 em meio livre de soro. Nas sementes de cultura de tecidos, sete células de COS em meio completo em cultura de tecido de fundo plano trataram 96 placas de poço a uma concentração de 4.000 células por 200 microlitros por poço.Usando um pipeter multicanal. Incubar as células durante 24 horas a 37 graus Celsius numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, aspirar o sobrenadante dos poços usando uma pipeta de pastagem de vidro presa a uma bomba de vácuo.Dosar as células em triplicado com os compostos de ensaio utilizando as soluções de trabalho previamente preparadas. Em seguida, devolva as células à incubadora. Após 24 horas, aspirar o sobrenadante dos poços e adicionar 200 microlitros de solução de MTT a cada poço.Incube a placa por quatro horas. Aspirar suavemente o sobrenadante dos poços sem perturbar os cristais formazanos roxos. Adicione 200 microlitros de DMSO a cada poço para dissolver os cristais.Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por 15 minutos. Meça a absorvância para cada poço a 590 ou 600 nanômetros usando um leitor de placas de 96 poços. Use poços sem células como pano de fundo e faça a média do valor de absorvência.As costuras espirocíclicas de gox seis e sete foram sintetizadas usando um protocolo modificado. O progresso da reação foi monitorado pela detecção do desaparecimento da Esther alfa beta insaturada usando espectroscopia de infravermelho. O ensaio de MTT foi utilizado para determinar a viabilidade celular.A cisplatina, que é conhecida por induzir a morte celular em altas concentrações, serviu como um controle positivo. Como esperado, quanto maior a concentração de cisplatina, menor é a viabilidade celular. O ensaio de MTT foi então utilizado para testar os compostos espirocíclicos seis e sete e a furfurilamina.A furfurilamina e a spirocíclica gox seam six apresentaram citotoxicidade semelhante. No entanto, a toxicidade do composto espirocíclico sete foi visivelmente maior do que a da furfurilamina e seis. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a N-alquilação realizada usando haletos de acila volumosos foi encontrada para reduzir a taxa de eliminação beta, reduzindo assim o rendimento do produto.

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