Name: functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет гранта Исследовательского совета факультета K.S.H. (Управление исследований и грантов, Тихоокеанский университет Азуса-США). A.N.G. и J.F.M. являются получателями стипендии Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. и B.M.R. являются получателями грантов STEM Research Fellowship Grants (Центр исследований в области науки, Тихоокеанский университет Азуса-США). Мы благодарны доктору Мэтью Березуку и доктору Филипу Коксу за руководство по биоанализам.

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые химические вещества и биологические реагенты, используемые в этом протоколе, являются токсичными и канцерогенными. Перед использованием ознакомьтесь с соответствующими паспортами безопасности материалов (MSDS). Используйте соответствующие средства индивидуальн...

<ol>
	<li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function:+a+novel+approach+for+cancer+therapy.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li><li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+(MDM2+inhibitors)+in+clinical+trials+for+cancer+treatment.">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li><li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors.">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li><li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2.">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li><li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair.">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li><li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53.">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li><li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDM2-p53+pathway+revisited.">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li><li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans.">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li><li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13.">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li><li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy.">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li><li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes.">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li><li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+[4.4]spirocyclic+oximes.">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).</li><li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones.">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li><li>. MTT assay protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol">https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol</a> (2020)</li></ol>

Синтез спироциклических соединений был основан на предыдущих исследованиях, проведенных этой лабораторией, но с некоторыми модификациями (Рисунок 1)11,12. Ход каждой стадии реакции контролировался с помощью ИК-спектроско...

Известно, что низкомолекулярное ингибирование взаимодействия Е3 убиквитин-лигазы мышиным двухминутным гомологом 2 (MDM2) с р53 восстанавливает р53-опосредованную индукцию апоптоза опухолевых клеток 1,2,3. MDM2 является отрицательным регулятором пути p53 и часто чрезмерно экспрессируется в раковых клетках 4,5,6,7,8,9. Недавние кристаллографические и биохимические исследования показали, что малые молекулы, содержащие спироциклическую структуру, могут эффективно ингибировать взаимодействия MDM2-p5310. Спироциклическая структура (рисунок 1, закрашенный синим цветом) считается привилегированным мотивом, поскольку дериватизация этой жесткой ортогональной кольцевой системы привела к открытию новых терапевтических препаратов. Доступ к этой интересной архитектуре представляет собой проблему при использовании традиционных методов органического синтеза. Хотя терапевтические эффекты спироциклических молекул в биологических системах были исследованы, синтез этих молекул все еще является громоздким процессом. Нежелательные побочные продукты, использующие суровые условия, и опасные переходные металлы часто являются проблематичными.
Потенциальное использование спироциклического мотива в разработке лекарств привело к разработке протокола, использующего твердофазный синтез для создания библиотеки молекул с мотивом в дополнение к другим взаимозаменяемым функциональным группам11,12. Разделение продуктов и реагентов между стадиями может быть достигнуто простым использованием линкера REM, прикрепленного к смоляному шарику, и твердофазного фильтрующего сосуда. Это сократило бы шаги и потенциально увеличило бы урожайность. Этот синтетический подход может привести к появлению большого количества потенциальных кандидатов на лекарства. Однако эффективность этих молекул в биологической системе потребует дальнейшего изучения.
Для определения цитотоксичности этих спироциклических соединений был использован анализ МТТ13,14. Этот метод измеряет жизнеспособность клеток и может быть использован для косвенного определения цитотоксичности клеток. Различные концентрации ингибиторов добавляли к культивируемым клеткам в 96-луночной пластине, а долю живых клеток измеряли колориметрическим анализом степени восстановления желтого МТТ митохондриальными дегидрогеназами до соединения фиолетового формазана (рисунок 2). Активность чаще всего сообщается как значение IC50 - концентрация, при которой рост клеток ингибируется на 50% по сравнению с необработанным контролем. В этой статье описывается протокол анализа MTT и предварительные результаты этих новых спироциклических молекул.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COS-7 cells (ATCC CRL-1651)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1651</td>
			<td>African green monkey kidney cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHEMICALS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromooctane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152951</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>337528</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzylbromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B17905</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13119</td>
			<td>Cytotoxicity control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, with L-glutamine</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-500</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine serum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furfurylamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119800050</td>
			<td>reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td>Alkyl-halide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Calbiochem 475989-1GM</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-507</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REM Resin</td>
			<td>Nova Biochem</td>
			<td>8551010005</td>
			<td>Polymer support; 0.500 mmol/g loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-&#946;-nitrostyrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N26806</td>
			<td>Nitro-olefin reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine (TEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0886</td>
			<td>Reagent for beta-elimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylsilyl chloride (TMSCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>386529</td>
			<td>Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL solid-phase reaction vessel</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1861-02</td>
			<td>Glassware with filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate reader</td>
			<td>Promega (Turner Biosystems)</td>
			<td>9310-011</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVANCE III NMR Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nicole iS5</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrist-Action Shaker</td>
			<td>Burrell Scientific</td>
			<td>757950819</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functionalized spirocyclic heterocycle synthesis and cytotoxicity assay

Спироциклические гетероциклы недавно были зарегистрированы в литературе как потенциальные лекарства для терапии рака. Синтез этих новых ортогональных кольцевых систем является сложной задачей. Недавно была опубликована эффективная методология синтеза этих соединений, которая описывала синтез твердой фазы в четыре этапа, а не ранее сообщенные пять этапов. Преимуществом такого более короткого синтеза является исключение использования токсичных реагентов. Было обнаружено, что смола на основе линкера с низкой нагрузкой Regenerating Michael (REM) имеет решающее значение в синтезе, поскольку версии с высокой нагрузкой предотвращают добавление реагентов, содержащих громоздкие фениловые и ароматические боковые цепи. Колориметрический анализ 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) был использован для изучения цитотоксичности микромолярных концентраций этих новых спироциклических молекул in vitro. MTT легко доступен в продаже и дает относительно быстрые и надежные результаты, что делает этот анализ идеальным для этих спироциклических гетероциклов. Были протестированы ортогональные кольцевые структуры, а также фурфуриламин (предшественник в методе синтеза, содержащий аналогичный 5-членный кольцевой мотив).

Спироциклические оксимы 6 и 7 синтезировали с использованием модифицированного протокола (рисунок 1). Добавление Майклом фурфуриламина к линкеру REM 1b обеспечило полимерно-связанную смолу 2. Ход реакции контролировали с помощью инфракрасной (ИК) спектроскопии путем обнар...

Watch this Scientific Journal Video about Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay at JoVE.com

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Здесь мы описываем биоанализ с использованием 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT) для тестирования ранее синтезированных спироциклических оксимов.

Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Этот протокол использует перерабатываемый и модифицированный метод получения спироциклических соединений. Анализ MTT помогает ответить на вопрос, касающийся цитотоксичности этих новых молекул. Этот метод производит новые модифицируемые молекулы с использованием регенерирующего исходного материала.Анализ MTT обеспечивает относительно быстрые и простые для анализа биологические результаты Начните с выполнения твердофазного синтеза спироциклических гетероциклов шесть и семь, как было продемонстрировано ранее. Приготовьте 20 миллилитров пяти миллиграммов на миллилитр раствора МТТ, используя стерильный PBS в качестве разбавителя. Отфильтруйте и храните раствор при минус 20 градусах Цельсия.Затем приготовьте один к одному разведение раствора МТТ в ДМЭМ. Готовят по одному миллилитру каждого из исходных растворов в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках исследуемых соединений в ДМСО. Храните их при минус 20 градусах Цельсия.Готовят 200 микролитров на дозу рабочих растворов исследуемых соединений путем разбавления исходных концентраций. От одного до 1000 в свободной от сыворотки среде. В семенах тканевой культуры семь клеток COS в полной среде на плоской нижней тканевой культуре обрабатывали 96 пластин лунки в концентрации 4000 клеток на 200 микролитров на лунку.Использование многоканального трубоукладчика. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. На следующий день аспирируйте супернатант из скважин с помощью стеклянной пастбищной пипетки, прикрепленной к вакуумному насосу.Дозируйте клетки в трех экземплярах с исследуемыми соединениями, используя предварительно приготовленные рабочие растворы. Затем верните клетки в инкубатор. Через 24 часа аспирировать супернатант из скважин и добавить в каждую скважину 200 микролитров раствора МТТ.Инкубируйте пластину в течение четырех часов. Осторожно аспирируйте супернатант из лунок, не нарушая фиолетовые кристаллы формазана. Добавьте 200 микролитров ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить кристаллы.Затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 15 минут. Измерьте поглощение для каждой скважины при 590 или 600 нанометрах с помощью считывателя пластин 96 скважин. Используйте скважины без ячеек в качестве фона и усредняйте значение поглощения.Спироциклические гоксовые швы шесть и семь были синтезированы с использованием модифицированного протокола. Ход реакции контролировали путем обнаружения исчезновения альфа-бета-ненасыщенной Эстер с помощью инфракрасной спектроскопии. Анализ MTT использовался для определения жизнеспособности клеток.Цисплатин, который, как известно, индуцирует гибель клеток при высоких концентрациях, служил положительным контролем. Как и ожидалось, чем выше концентрация цисплатина, тем ниже жизнеспособность клеток. Затем анализ MTT был использован для тестирования спироциклических соединений шесть и семь и фурфуриламин.Фурфуриламин и спироциклический гоксовый шов шесть показали сходную цитотоксичность. Однако токсичность спироциклического соединения семь была заметно больше, чем у фурфуриламина и шести. При попытке этого протокола имейте в виду, что N-алкилирование, выполненное с использованием громоздких ацилгалогенидов, как было обнаружено, снижает скорость бета-элиминации, тем самым уменьшая выход продукта.

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

Оптимизация реакции Уги Использование параллельных Синтез и автоматизированной обработки жидких

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

РНК Изоляция от эмбриональных данио рерио и кДНК синтеза для анализа экспрессии генов

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Синтез и калибровка Фосфоресцирующая нанозонды для кислорода изображений в биологических системах

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Микроволновая при содействии одного банка Синтез N-Сукцинимидил-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

Intracellular Refolding Assay

Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Твердофазный синтез функционализированных Бис-пептида Использование «Безопасность Поймать« Методология

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...