Name: electroporation-mediated rna interference method in odonata
Uploaded: 2021-02-06T13:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata at JoVE.com

Мы благодарим Минору Морияму за техническую консультацию и поддержку, Бин Хирота и Рютаро Судзуки за сбор личинок Одонаты и Мису Синю за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Грант номера JP18J21561 GO и JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287, и JP20H04936 в РФ.

<ol>
	<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution.">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li><li>Wipfler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+Polyneoptera+and+its+implications+for+our+understanding+of+early+winged+insects.">Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).</li><li>Corbet, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , (1999).</li><li>Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+vision+and+color+formation+in+dragonflies.">Color vision and color formation in dragonflies.</a> Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).</li><li>Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+UV+reflection+patterns+in+Odonata.">Diversity of UV reflection patterns in Odonata.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).</li><li>C&#243;rdoba-Aguilar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , (2008).</li><li>Bybee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odonata+(dragonflies+and+damselflies)+as+a+bridge+between+ecology+and+evolutionary+genomics.">Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics.</a> Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).</li><li>Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borr&#224;s-Castelles, F., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNA+interference+the+red+flour+beetle,+Tribolium+castaneum.">Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum.</a> Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).</li><li>Okude, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+RNA+interference+reveals+a+role+of+multicopper+oxidase+2+gene+in+dragonfly&#8217;s+cuticular+pigmentation.">Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly&#8217;s cuticular pigmentation.</a> Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).</li><li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Lepidoptera:+An+overview+of+successful+and+unsuccessful+studies+and+implications+for+experimental+design.">RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design.</a> Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).</li><li>Ando, T., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+somatic+transgenesis+for+rapid+functional+analysis+in+insects.">Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects.</a> Development. 140, 454-458 (2013).</li><li>Nishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mechanism+for+female-limited+Batesian+mimicry+in+Papilio+butterfly.">A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly.</a> Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).</li><li>Osanai-Futahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+Bombyx+pink-eyed+white+egg+locus+reveals+the+major+role+of+cardinal+in+ommochrome+synthesis.">Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis.</a> Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).</li><li>Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+rearing+system+for+Ischnura+senegalensis+(Insecta:+Odonata)+enables+detailed+description+of+dragonfly&#8217;s+larval+development+and+morphogenesis.">Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly&#8217;s larval development and morphogenesis.</a> Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).</li><li>Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dragonflies of Japan (3rd edition). , (2017).</li><li>Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , (2019).</li><li>Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+metabolism+for+insect+cuticle+pigmentation+and+sclerotization.">Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization.</a> Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , 165-220 (2016).</li><li>Asano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review+an+insect-specific+system+for+terrestrialization:+Laccase-mediated+cuticle+formation.">Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).</li><li>Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+hybrids+in+Japanese+Odonata.">Interspecific hybrids in Japanese Odonata.</a> Tombo. 60, 1-49 (2018).</li><li>Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+crossing+between+blue-tailed+damselflies+Ischnura+elegans+and+I.+senegalensis+in+the+laboratory.">Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory.</a> Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).</li><li>Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siDirect+2.0:+updated+software+for+designing+functional+siRNA+with+reduced+seed-dependent+off-target+effect.">siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect.</a> BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).</li><li>Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNAs+induce+efficient+RNAi+response+in+Bombyx+mori+embryos.">siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos.</a> PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).</li><li>Futahashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+of+sectioned+tissues+of+species+hybrids+to+detect+cis-regulatory+changes+in+gene+expression+pattern.">Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern.</a> Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).</li><li>Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+essential+for+bacteriocyte+development.">Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).</li><li>Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pterin-pigmented+nanospheres+create+the+colours+of+the+polymorphiic+damselfly+Ischnura+elegans.">Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans.</a> Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).</li><li>Nishide, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+function+of+multicopper+oxidase+genes+in+the+stinkbug+Plautia+stali.">Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).</li><li>Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DsRNA+degradation+in+the+pea+aphid+(Acyrthosiphon+pisum)+associated+with+lack+of+response+in+RNAi+feeding+and+injection+assay.">DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay.</a> Peptides. 53, 307-314 (2014).</li><li>Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+prospects+of+CRISPR/Cas+systems+in+insects+and+other+arthropods.">Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods.</a> Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).</li><li>Miyakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+life-history+of+Pseudothemis+zonata+(Burm.)+(Odonata,+Libellulidae)+II.+Immature+stage.">A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage.</a> Konty&#251;. 37 (4), 409-422 (1969).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Летальность лечения РНК
Мы обнаружили, что летальность лечения РНК сильно зависит от истории воспитания и состояния личинок Одонаты. Личинки вскоре после сбора в поле, как правило, здоровы и демонстрируют низкие показатели смертности после электропорации опосредованного лечения РНК. В отличие от этого, личинки, подрастаемые в лаборатории в течение длительного периода времени (например, один месяц), как правило, страдают от низких показателей успеха взрослого появления. В I. senegalensis, вместо личинок, собранных в полевых условиях, личинки, вырастиеные в лаборатории изяиц, могут быть использованы 14, но показатели успеха РНК с использованием лабораторно-хозяйских личинок, как правило, значительно ниже (многие люди умерли во время метаморфоз), чем те, которые используют собранные на местах личинки. Кроме того, частое кормление личинками и выращивание чистой воды имеют важное значение для повышения успешности взрослого возникновения и снижения летальности лечения РНК.
Эффективность лечения РНК
Как описано выше, уровни фенотипа РНК, а именно размер и расположение деколоризации кутикулы, часто проявляли значительные различия между лицами, подвергаемыми той же обработке РНК (например, рисунок 4), но уровни фенотипического пенетранса, кажется, удивительно отличаются между видами Одонаты. Наблюдаемые фенотипические регионы были больше и заметнее в I. senegalensis (рисунки 4-5),чем в P. zonata (рисунок 6) и N. pygmaea9. Эта разница может быть связана с толщиной кутикулы на поверхности личинки, учитывая, что кутикула I. senegalensis тоньше, чем кутикула P. zonata и N. pygmaea). Насколько мы рассмотрели, не было признано четкой разницы между эффектами siRNA и dsRNA(рисунок 4, таблица 1).
Соответствующий этап развития РНК
Следует отметить, что правильная постановка личинок важна для эффективного выполнения РНК. Ингибирование пигментации взрослых было вызвано MCO2 РНК до стадии D (примерно за 3 дня до появления взрослого), что согласуется с предыдущим докладом о N. pygmaea9. Фенотипы РНК, наблюдаемые при введении на стадиях C и D, были менее заметными, чем те, которые лечились на стадиях А и В, которые указывают на то, что этапы C и D могут быть слишком поздно, чтобы достаточно подавить экспрессию генов. Подходящее время для лечения РНК зависит от сроков экспрессии генов, и ген MCO2 проявляет преходящую высокую экспрессию во время появлениявзрослых 9, как и удругих насекомых 17,18. В stinkbug Plautia stali, РНК нокдаун гена MCO2 наблюдался с 4-го дня послеинъекции 27, что соответствует нынешним результатам.
Наше предыдущее исследование на I. senegalensis показало, что после этапа B, дней до появления взрослых проявляют относительно небольшие различия между большинством окончательных личинок instar, предполагая, что этап B может соответствовать началу процесса к появлению взрослых, после чего процессы развития метаморфозы продолжаются в префиксированной искоординированной манере 14. Морфологические аномалии, вызванные ранами, часто наблюдались, когда личинки лечились РНК на стадиях C и D(рисунок 7B, 7C). Это, вероятно, будет связано с резким прогрессированием метаморфозы на этих стадиях, предполагая, что лечение РНК следует избегать от стадии С и далее. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы окончательные личинки instar на этапе A или B (или на этапе, прежде чем личиночиное крыло значительно расширить) должны быть использованы для экспериментов РНК.
Полезность и превосходство метода РНК, опосредованного электропорацией
Обычный РНК является простым и мощным экспериментальным методом, но некоторые линии насекомых,как бабочки 10, тля28 и стрекозы9 демонстрируют низкую эффективность РНК, для которых создание анализа функции генов является серьезной проблемой. В этом исследовании мы обнаружили, что электропорация опосредованного РНК может вызвать локальное подавление генов у стрекоз с почти 100% эффективностью, по крайней мере в эпидермис, если лечить на соответствующих стадиях развития (Таблица 1). В последнее время, CRISPR / Cas9 основе генов нокауты были успешно применены к различным насекомым, обеспечивая мощный молекулярно-генетический инструмент для не-модель организмов29. Здесь, однако, мы узнаем, что CRISPR/Cas9, безусловно, велик, но электропорация опосредованного метода РНК может быть выше CRISPR/Cas9 в некоторых отношениях.
Во-первых, в методе РНК, опосредованном электропорацией, область тела, где появляются фенотипы РНК, может легко контролироваться экспериментально положением положительного электрода при электропорации. Кроме того, поскольку область, где экспрессия генов подавляется ограничена вокруг области, где положительный электрод был помещен, фенотипы РНК можно легко сравнить с контрольными фенотипами бок о бок в одном и том же человеке. Во-вторых, по сравнению с методом CRISPR/Cas9, в котором инъекционные яйца должны быть воспитаны до совершеннолетия, чтобы наблюдать нокаут фенотипы, электропорация опосредованного РНК превосходит в том, что ген нокдаун фенотипы обычно можно наблюдать в гораздо более короткое время. Например, это занимает от трех до четырех месяцев для I. senegalensis и от одного до двух лет для P. zonata от яицдо взрослых 14,30. Однако, для того, чтобы наблюдать фенотипы РНК в рамках взрослого эпидермиса, это занимает менее одного месяца от инъекции dsRNA в окончательные личинки instar на этапе B для взрослых появление как для I. senegalensis и P. zonata (Рисунок 7). В-третьих, метод РНК, опосредованный электропорацией, влечет за собой инъекцию dsRNA в крупные личинки, что проще, чем микроинъекция в крошечные яйца, необходимые для метода CRISPR/Cas9. Кроме того, электропорация опосредованная РНК применима к видам насекомых, чьи недавно откладанные яйца трудно собрать. Например, самки P. zonata откладывают яйца на плавающие растения на поверхности воды во время полета, и поэтому трудно собрать их яйца как в поле, так и в лаборатории. Таким образом, мы ожидаем, что этот протокол может быть в целом применим к не модели организмов, в которых обычный метод РНК не работает эффективно.

Стрекозы и damselflies (порядок Odonata) являются одними из самых предков групп насекомых, которые проявляют "метаморфозы"1,2. По метаморфозы, они меняют свою среду обитания, морфологии и поведения резко от водных личинок наземных / воздушныхвзрослых 3. Odonata взрослых имеют хорошо развитое цветовое зрение и представляют собой замечательное разнообразие в цветах тела и узоры между полами, этапами ивидами 3,4,5. Хотя многие экологические и поведенческие исследования на Odonata былипроведены 6,7, молекулярно-генетические исследования были затруднены главным образом трудности в применении генного функционального анализа Odonata.
Обычный метод РНК-интерференции (РНК), при котором двухструновая РНК (dsRNA) вводится для подавленияфункции гена интереса 8, оказался неэффективным у насекомых Одоната9, как сообщается в Lepidopteranнасекомых 10. С другой стороны, предыдущие доклады показали, что электропорация опосредованных РНК эффективен в Lepidopteran видов, особенно в эпидермальныхтканях 11,12,13. Недавно мы обнаружили, что электропорация опосредованное РНК эффективно работает в крошечной стрекозе Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, но N. pygmaea является относительно редким видом и поэтому не подходит для молекулярно-генетических исследований.
Большинство видов Одоната классифицируются на любой из двух подзарядок, Зигоптера (damselflies) или Anisoptera (истинные стрекозы)3. Здесь мы сосредоточились на синехвостый damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Рисунок 1A) в качестве представителя вида Зигоптеран и скиммерной стрекозы Pseudothemis zonata (Libellulidae; Рисунок 1B) в качестве представителя анизопротеранского вида. Эти два вида являются одними из наиболее распространенных видов одоната в естественных и городских прудов в Японии, в том числе в цукуба-Сити, и мы можем собрать много личинок двух видов в этой области. Недавно мы создали лабораторную систему выращивания отдельных личинок I. senegalensis, которая позволила непрерывно контролировать развитие и морфогенез личинок Одонатыв деталях 14.
В этом отчете мы предоставляем усовершенствованную методику и видео протокол для электропорации опосредованного РНК в I. senegalensis и P. zonata. В Японии, I. senegalensis и Ischnura asiatica, которые генетически близки, часто встречаются симпатрически15, и они трудно различить вличинках 16. Мы также описываем, как два вида Ишнуры можно отличить по полиморфизму длины фрагмента ограничения (RFLP).
Для оценки эффективности электропорации опосредованных РНК, мы выбираем многокопперный оксидазы 2 ген (MCO2; также известный как laccase2) в качестве репрезентативного гена цели, из-за видимого фенотипа бледнее кутикулы цвета при нокдауне экспрессиигена 9. MCO2, как известно, имеет важное значение для затемнения эпидермиса в различныхвидах насекомых 17,18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>VTC-P12</td>
			<td>For rearing larvae before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp eggs</td>
			<td>JAPAN PET DESIGN</td>
			<td>4975677012396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micropipette (1-5 &#181;L)</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposit pestle 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K749520-0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital high defenition microscope camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MC170HD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable non-woven mesh</td>
			<td>HAKUGEN EARTH</td>
			<td>DSC-105A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ligation Kit Ver.2.1</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DraI</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>1037A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode (1mm&#966;)</td>
			<td>NEPAGENE</td>
			<td>CUY650P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>CellProduce</td>
			<td>Cure-gene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>KOWA Forceps&#160;Industry</td>
			<td>K-10 No1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass needle puller</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>PN-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand mixer</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-229-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand net</td>
			<td>HOGA</td>
			<td>IS33-3B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>346-01373</td>
			<td>For injection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pin capitate No. 3</td>
			<td>Shiga Konchu Fukyusha</td>
			<td>N230</td>
			<td>For fixing larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>169-04245</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>160-03175</td>
			<td>For injection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For injection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Jack (150x150)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-4642-11</td>
			<td>For adjusting the position of the manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>2369385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Muromachi Kikai Co., Ltd.</td>
			<td>SJ-1</td>
			<td>For adjusting the position of the injector and the capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript RNAi kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg(OAc)2</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>130-00095</td>
			<td>For injection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>197-02865</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>For PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (5 cm diameter)</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1010-060</td>
			<td>For rearing injected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Injector</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>IM-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT7Blue T-Vector</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>FUJIFILM Wako&#160;Pure Chemical Corporation</td>
			<td>9109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shiga micro insect pin with stainless headless</td>
			<td>Shiga Konchu Fukyusha</td>
			<td>N251</td>
			<td>For making a small hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S8APO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR001B</td>
			<td>For PCR-amplification from plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks Gflex DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>R060B</td>
			<td>For PCR-amplification from caudal gill</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-mediated rna interference method in odonata

Стрекозы и damselflies (порядок Odonata) представляют собой один из самых предков насекомых с метаморфозами, в которых они меняют свою среду обитания, морфологии и поведения резко от водных личинок до наземных / воздушных взрослых без куколки этапе. Взрослые Odonata имеют хорошо развитое цветовое зрение и показывают замечательное разнообразие цветов и узоров тела между полами, стадиями и видами. Хотя было проведено много экологических и поведенческих исследований Odonata, молекулярно-генетические исследования были скудными главным образом из-за трудностей в применении генного функционального анализа к Odonata. Например, РНК-интерференция (РНК) менее эффективна в Одонатах, как сообщается в Lepidoptera. Чтобы преодолеть эту проблему, мы успешно создали метод РНК в сочетании с электропорацией in vivo. Здесь мы предоставляем подробный протокол, включающий видео электропорации опосредованного метода РНК следующим образом: подготовка личинок, идентификация видов, подготовка раствора dsRNA/siRNA и иглы для инъекций, ледяная анестезия личинок, инъекция dsRNA/siRNA, электропорация in vivo и индивидуальное воспитание до появления взрослых. Метод РНК, опосредованный электропорацией, применим как к плотинам (подзарядка Зигоптера), так и к стрекозам (подзаказ Anisoptera). В этом протоколе, мы представляем методы для синехвостый damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) в качестве еще одного примера damselfly видов и pied скиммер стрекоза Pseudothemis zonata (Libellulidae) в качестве еще одного примера стрекоз видов. В качестве репрезентативных примеров мы показываем результаты РНК, ориентированных на ген синтеза меланина multicopper oxidase 2. Этот метод РНК облегчит понимание различных функций генов, участвующих в метаморфозах, морфогенезе, формировании цветовых паттернов и других биологических особенностях Одонаты. Кроме того, этот протокол может быть в целом применим к не-модель организмов, в которых РНК является менее эффективным в подавлении генов из-за неэффективности и низкого penetrance.

Мы применили вышеуказанный протокол к электропорации опосредованного РНК ориентации гена MCO2 и отрицательного контроля генов(EGFP для siRNA и бла для dsRNA) (i) в брюшной полости I. senegalensis (Рисунок 4), (ii) в грудной клетке I. senegalensis (Рисунок 5), и (iii) в брюшной полости P. zonata (Рисунок 6). Результаты экспериментов РНК обобщены в таблице 1. Поскольку отрицательно заряженная siRNA/dsRNA включается только в положительно заряженные клетки, фенотипы РНК наблюдались по всему региону, где положительный электрод был помещен для электропорации.
В обоих I. senegalensis и P. zonata, ингибирование пигментации меланина (т.е. черный, коричневый и красновато-коричневый) появились в пятнах вокруг региона, где положительный электрод был помещен (белые наконечники стрел и пунктирные линии на рисунке 4, Рисунок 5, и рисунок 6), когда MCO2 РНК была выполнена в сочетании с электропорацией (таблица1), как сообщалось ранее в N. pygma. В отличие от этого, никаких фенотипических эффектов не наблюдалось вокруг места электропорации, когда ген управления вводился(EGFP siRNA или bla dsRNA)(рисунок 4,рисунок 5 , и рисунок 6, Таблица 1). Кроме того, введение гена MCO2 без электропорации не повлияло на пигментациювзрослых (рисунок 4, таблица 1), что указывает на то, что электропорация необходима для РНК в Одоната. Следует отметить, что синий, зеленый и желтый окраски не влияют на РНК гена MCO2, который участвует в синтезе меланина в кутикуле, которые правдоподобно отражают тот факт, что эти цвета тела приписываются пигментных гранул, присутствующих в эпидермальных клетках, которые видны черезпрозрачную кутикулу 26. Как показано на рисунке 4, никаких замечательных фенотипических различий были признаны между лицами, подвергаемых лечению siRNA и лечения dsRNA, в то время как значительные различия в размерах и местоположении фенотипа РНК наблюдались среди различных лиц, подвергаемых одному и тому же лечению РНК (например, сравнить два примера ISMCO2 dsRNA на рисунке 4).
Чтобы определить стадию развития, наиболее подходящую для лечения РНК, мы сравнили фенотипические последствия лечения РНК на пяти морфологических стадиях (этап А-Е) в конечной личинке звезды I. senegalensis (рисунок 7A). Ингибирование пигментации меланина, вызванной MCO2 РНК наблюдалось у всех возникающих взрослых при введении на этапах А и В(рисунок 7C). При введении на стадиях C и D, подавление пигментации меланина, безусловно, наблюдается в некоторых появились взрослые, но другие взрослые выставлены ненормальной окраски, вызванной ранами (Рисунок 7B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig1.jpg"> Рисунок 1: Электропорация-опосредованное методы РНК в Одонате. А. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) как представитель damselfly видов. Б. Pseudothemis zonata (Libellulidae) как представитель вида стрекоз. К. Общая схема протоколов. Синие и оранжевые коробки указывают протоколы для I. senegalensis и P. zonata, соответственно. Фиолетовые ящики указывают на общие протоколы, применяемые к обоим видам. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig2.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативный результат полиморфизма длины фрагмента ограничения (RFLP) на основе идентификации видов для видов Ишнура. Arrowhead указывает на I. senegalensis-специфическойгруппы. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-базовая пара лестницы маркера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig3.jpg"> Рисунок 3: Электропорация-опосредованное метод RNAi в Odonata. А-С. Ледяная анестезия I. senegalensis. Наконечники стрел указывают на личинку. А. Положить личинку на дробленый лед с мокрой бумагой. Б. Увеличенный вид личинки на льду. К. Личинка, покрытая мокрой бумагой на льду. Д-Г. Метод РНК для I. senegalensis. Д. Инъекция в грудную клетку. Е. Электропорация на грудной клетке. Ф. Инъекция в живот. Г. Электропорация на животе. Х-Джей. Метод РНК для P. zonata. Х. Создание небольшое отверстие на животе. Я. Инъекция в живот. Дж. Электропорация на животе. Стрелки указывают на точку сделать отверстие или инъекции. Вопрос, -: Положительные/отрицательные боковые электроды. Цифры указывают на брюшной сегмент. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig4.jpg"> Рисунок 4: Дорсальные виды фенотипов РНК на животе I. senegalensis. Белые наконечники стрел указывают на регионы подавленной меланизации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig5.jpg"> Рисунок 5: Боковой и спинной мнения фенотипов РНК на грудной клетке I. senegalensis. Белые наконечники стрел и пунктирные линии указывают на области подавленной пигментации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig6.jpg"> Рисунок 6: Вентальные виды фенотипов РНК в брюшной полости P. zonata. Белые наконечники стрел и пунктирные линии указывают на регионы подавленной меланизации. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61952/61952fig7.jpg"> Рисунок 7: Этап зависит IsMCO2 РНК эффекты во время окончательного личинки instar I.senegalensis. А. Морфологические изменения в сложных глазах на пяти морфологических стадиях (этап A-E) и количество дней для взрослого появления в этом исследовании. Номера в скобках из предыдущего отчета14. Б. Аномальная пигментация из-за ран. Стрелка указывает на место электропорации. К. Влияние РНК на пяти морфологических стадиях на пигментацию взрослых в I. senegalensis. Номер на баре указывает количество лиц. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61952/61952fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Видов</td>
			<td colspan="7">И.Сенегаленис</td>
			<td colspan="3">П.Зоната</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Инъекционный регион</td>
			<td colspan="5">Живота</td>
			<td colspan="2">Грудной клетки</td>
			<td colspan="3">Живота</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">siRNA/dsRNA</td>
			<td colspan="2">siRNA</td>
			<td colspan="3">dsRNA</td>
			<td colspan="2">dsRNA</td>
			<td colspan="3">dsRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Целевой ген</td>
			<td>IsMCO2</td>
			<td>EGFP</td>
			<td>IsMCO2</td>
			<td>IsMCO2</td>
			<td>Бла</td>
			<td>IsMCO2</td>
			<td>Бла</td>
			<td>PzMCO2</td>
			<td>PzMCO2</td>
			<td>Бла</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Электропорация</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Инъекционные личинки</td>
			<td>22</td>
			<td>25</td>
			<td>30</td>
			<td>6</td>
			<td>53</td>
			<td>12</td>
			<td>20</td>
			<td>17</td>
			<td>5</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Появились взрослые</td>
			<td>7</td>
			<td>6</td>
			<td>13</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>11</td>
			<td>14</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Взрослые с менее пигментными регионами (коэффициент)</td>
			<td>7 (100%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>13 (100%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>10 (91%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>11 (100%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Влияние РНК на пигментацию взрослых в I. senegalensis и P. zonata. Результаты на этапе А показаны в I. senegalensis. IsMCO2: мультикоппер оксидазы 2 гена I. senegalensis, EGFP: Улучшенный зеленый флуоресцентный ген белка, бла: бета-лактамазы ген от pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: мультикоппер оксидазы 2 гена P. zonata. Результаты для контрольных генов представляют общее количество экспериментов, проведенных авторами на сегодняшний день.

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata at JoVE.com

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Мы предоставляем подробный протокол для электропорации опосредованного РНК-интерференции в насекомых порядка Odonata (стрекозы и damselflies) с использованием синехвостый damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Зигоптера) и pied skimmer стрекоза (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Метод РНК-интерференции при электропорации в Одоната

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

Это видео протокол для электропорации опосредованного метода РНК-интерференции в Одоната. Стрекозы и damselflies, члены ордена Одоната, являются одними из самых предков насекомых. Взрослый Odonata показать замечательное разнообразие в цветах тела и моделей, и многие экологические и поведенческие исследования были проведены.Тем не менее, молекулярно-генетических исследований на Odonata не хватает, потому что генный функциональный анализ очень трудно. Например, обычный метод РНК не эффективен у видов Одоната. Недавно мы создали метод RNM в сочетании с электропорацией in vivo.Здесь мы предоставляем видео-протокол для электропорации опосредованного РНК как в стрекозах, так и в плотинах. Как наш представитель damselflies видов мы используем синехвостый damselfly. Ишнура сенегаленсис.Это один из самых распространенных видов damselfly и часто встречается в солнечных прудах в Японии. Во-первых, мы показываем протокол РНК, направленный на брюшную полость плотины, Ischnura senegalensis. После ледяной анестезии при этом две булавки по обе стороны проторакса и зафиксировать личинку на фиксированной подсвеч.Потяните и растянуть меж сегментальную мембрану между седьмым и восьмым сегментом брюшной полости с помощью типсов. Держите меж сегментальную мембрану растянутой вручную. Вставьте кончик подготовленного капилляра в растянутую межсекментальную мембрану.Ввилите 1 микролитер раствора siRNA или dsRNA. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов. Поместите электроды на ультразвуковой гель, с положительным электродом на стороне инъекции.Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропоратора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней. Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления.Далее мы покажем протокол РНК, нацеленный на грудную клетку плотины, Ischnura senegalensis. После ледяной анестезии прикрепите две булавки по обе стороны проторакса и закрепите личинку на фиксированной подсвечок. Потяните и растянуть межсекментальную мембрану между протораксом и синтораксом с помощью руки.Вставьте кончик подготовленного капилляра в растянутую межсекментальную мембрану. Введать один микролитер раствора siRNA или dsRNA. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов.Поместите электроды на ультразвуковой гель, с положительным электродом на стороне инъекции. Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропролятора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней.Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления. В качестве репрезентативного вида стрекоз мы используем стрекозу Pied skimmer. Псевдотемис зоната.Это один из наиболее распространенных видов стрекоз и часто встречается в тенистых прудах в Японии. Наконец, мы показываем протокол RNI, направленный на живот стрекозы, Pseudothemis zonata. Растянуть межсекментальную мембрану между четвертым и пятым сегментом брюшной полости.Сделайте небольшое отверстие с тонкой иглой между четвертым и пятым сегментом брюшной полости. Вставьте кончик подготовленного капилляра в подготовленное отверстие. Введать один микролитер раствора siRNA или dsRNA.Зафиксите личинку на фиксированном стенде с помощью булавок. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов. Поместите электроды на ультразвуковой гель с положительным электродом на стороне инъекции.Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропоратора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней. Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления.Здесь мы выбрали ген синтеза меланина MCO2 в качестве целевого гена, и EGFP или бла в качестве отрицательной цели контроля. MCO2 имеет важное значение для формирования черного цвета у различных насекомых. Сначала мы показываем результаты в брюшной полости Ischnura senegalensis.Белые наконечники стрел указывают на области подавленной черной пигментации, где положительный электрод был помещен на электропорации. Инкубация пигментации наблюдалась как при лечении siRNA, так и при лечении dsRNA. Размер и расположение фенотипа RNI значительно различались среди отдельных лиц.Без электропорации не наблюдалось фенотипов RNI, что указывает на то, что электропорация необходима для RNI у этого вида. Далее мы покажем результаты в грудной клетке Ischnura senegalensis. Аналогичным образом ингибирование черной пигментации наблюдалось по всему региону, где положительный электрод был помещен на электропорации.Наконец, мы показываем результаты в брюшной полости Pseudothemis zonata. Как и ожидалось, фенотип RNI был обнаружен по всему региону, где положительный электрод был помещен на электропорации. Мы подтверждаем, что метод РНК, опосредованное электропророцией, очень полезен в Одонате.Он может вызвать локальное подавление генов почти на 100% эффективность. По крайней мере, при эпидермисе, когда мы выбираем соответствующие этапы развития. Этот метод имеет несколько по методу CRISPR/Cas9.Например, область, где появляются фенотипы РНК, может контролироваться положением положительного электрода при электрпорации, а фенотипы РНК можно легко сравнить с генотипами управления бок о бок у одного и того же человека. Кроме того, этот метод не требует микроинъекции в крошечные яйца. Таким образом, гораздо проще и быстрее наблюдать фенотип быстрее, чем метод CRISPR/Cas9.Кроме того, этот метод может быть применен к насекомым, чьи недавно обложенные яйца трудно собрать. Например, самки Псевдотемис зонаты откладывают яйца во время полета. Так что очень трудно собрать их недавно заложенные яйца.Мы ожидаем, что этот протокол может быть в целом применим к не моделей организмов, когда обычные RNI не работает эффективно.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Транскрипционная Анализ нарождающегося РНК рыб<em&gt; В Vivo</em&gt; Трофобласта гигантские клетки или<em&gt; In Vitro</em&gt; Краткосрочные Культуры Ectoplacental Cone эксплантов

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Метод для характеризующие эмбриогенеза в проростках Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

На базе РНК перепрограммирование первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Рассечение дрозофилы куколки сетчатки для иммуногистохимии, Западный анализ и РНК изоляции

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Электропорация Метод для In Vivo Доставка плазмидной ДНК в взрослых зебрафиш теленефалион

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Метод совместной культуры для изучения Нейрита Отток аурост в ответ на стоматологические целлюлозы Паракриновые сигналы

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...