Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Arbejdet i Januschke laboratoriet er støttet af Wellcome trust tilskud 100031/Z/12/A og 1000032/Z/12/A. Vævsscanningsfaciliteten understøttes af bevillingen WT101468 fra Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Live billeddannelse af hele mount D. melanogaster larve hjerner giver mulighed for at observere asymmetriske neurale stamceller divisioner i forhold tæt på en fysiologisk sammenhæng. Den første del af vores protokol introducerer vores tilgang til dissektion af larvehjerner. Som allerede nævnt13, et kritisk aspekt af præparatet er at undgå at beskadige hjernen. Det mest udfordrende aspekt af dette er at adskille hjernen fra de nærliggende tænkelige diske uden at trække overdrevent på hjernen. Vores tilgang til "skæring uden at trække" er at udføre enten en slibning bevægelse med spidsen af et par pincet, eller at skubbe en pincet tips langs to andre pincet tips holde forbindelsen mellem væv (Figur 1A), mens Lerit et al. beskrive sav-lignende bevægelser med en dissekering pin. Vi råder eksperimentatoren til at prøve alle tilgange og til at vedtage den bedst egnede til sig selv. Vi foreslår også at bruge BSA- eller FCS-belagte pipettespidser i stedet for dissektionsværktøjer til at overføre isolerede hjerner. Belægningen forhindrer væv i at klæbe til plasten og tillader sikker overførsel af væv, mens de altid holder dem helt nedsænket uden at udsætte dem for en mulig forbigående deformation, når de klæber til dissektionsværktøjet under overførslen. Coatede tips har andre fordele ved at tillade overførsel af flere hjerner på én gang, hvilket er særligt nyttigt, når det er afgørende at kontrollere prøvernes opholdstid inden for et bestemt medium; de er egnede til overførsel af andet væv, selv skrøbelige, som for eksempel fedtlegemer; de kan rumme en lang række forskellige stikprøvestørrelser ved hjælp af større spidser eller skære spidsens ekstremitet.
Dernæst beskriver denne protokol brugen af Fibrinogen-koagulation til at immobilisere larvehjerner på coverlip af en kulturret. En hjerne er orienteret inden for en dråbe kultur medium + Fibrinogen, hvorefter koagulation er induceret ved tilsætning af Thrombin. Fibrindannelsen sker gradvist, hvilket giver et tidsvindue, hvor prøvens retning om nødvendigt kan finjusteres (Figur 2C). Hvis der er behov for en let kompression af prøven - hvilket vi fraråder i tilfælde af larvehjerner - kan den også justeres fint ved at trykke på blodproppen mere eller mindre tæt på prøven under trin 3.4.4 og 3.5.2. Den største fordel ved denne Fibrinogen-koagulation i forhold til den protokol, der er beskrevet i Lerit et al., hvor hjerner er monteret mellem en gasgennemtrængelig membran og en coverlip, er evnen til at erstatte kulturmediet under levende billeddannelse. En mulig fordel ved at bruge en gas gennemtrængelig membran over vores protokol kunne være, at det giver en optimal iltning af prøverne, som kunne være mere begrænset med vores tilgang som hjerner er adskilt fra luften af blodprop og nogle medium. Af denne grund, selvom vi ikke vurderede effekten af mængden af kulturmedie inden for kulturretten, foreslår vi at begrænse mængden af kulturmedie oven på blodproppene, mens vi holder blodproppene helt nedsænket.
Da manipulation af blodpropper kan være eksperimentelt vanskelige og tidskrævende, anbefaler vi, at eksperimentatoren først praksis manipulere blodpropper uden prøver. Graduering af volumenet af dråben af dyrkningsmedie + Fibrinogen på coverslip, koncentrationen af Fibrinogen eller mængden og koncentrationen af Thrombin kan bidrage til at gøre præparatet lettere og kan være vigtigt, når protokollen tilpasses andre typer væv. Med tilstrækkelig erfaring med at manipulere blodpropperne kan flere hjerner immobiliseres i en blodprop, hvis det er nødvendigt, selvom det komplicerer finjusteringen af orienteringen. Der kan dannes flere blodpropper på coverlipet, hvilket f.eks. gør det muligt at afbilde prøver af forskellige genotyper. Det er også muligt at udsætte forskellige blodpropper på samme coverlip til forskellige kultur medier, selv om man skal passe på aldrig at blande dråber af kultur medium, der dækker de forskellige blodpropper. Når larvehjerner er immobiliseret og klar til live billeddannelse, anbefaler vi at følge anbefalingerne fra Lerit et al.13 for at undgå overdreven fotodamage. Vi tilføjer kun disse anbefalinger for ikke kun at opretholde hjernen ved 25 °C under levende billeddannelse med en sceneinkubator, men også for at forvarme dette stadium i mindst 30 minutter før billeddannelsens start. I vores hænder, ikke at gøre det systematisk resulterer i en stærk fokus drift.
Det kan være en fordel i nogle sammenhænge at være i stand til at udføre korreleret mikroskopi og fastsætte og immunplet en prøve efter levende billeddannelse. Men en begrænsning af at bruge Fibrin blodpropper er, at det er næsten umuligt at mekanisk isolere en hjerne fra en blodprop uden at beskadige den. En mulig måde at overvinde denne begrænsning kunne være at udvikle metoder til at nedbryde Fibrin blodpropper med Plasmin eller at fremkalde blodprop demontering ved tilsætning af en peptid efterligne knapperne tillader Fibrin polymerisering28. Vi bruger typisk Fibrin-blodpropper på prøver fra enkeltceller til 200 μM lange væv, men vi kunne også med succes immobilisere i blodpropper og billedhjerner fra voksne humlebier over 3 mm brede. Den øvre grænse for prøvestørrelsen, der kan immobiliseres i blodpropper, er endnu ikke fastlagt. Tilsvarende, selvom vi normalt billede immobiliserede prøver i 4 til 5 timer, har vi med succes afbildet neuroblaster i primærkulturen i op til 3 dage, hvilket indikerer, at blodproppen i det mindste ikke forstyrrer levedygtigheden på længere sigt. Tværtimod kan blodpropper lette den regelmæssige udskiftning af mediet, et krav om længerevarende billeddannelse, uden behov for enheder som peristaltiske pumper til dette formål. Selv om vi ikke har målt permeabilitet parametre fibrin blodpropper, den fiber gel-lignende karakter af blodpropper synes at være gennemtrængelig af celle gennemtrængelige molekyler. Vi fandt, at Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligands og andre standard farvestoffer, der anvendes i cellebiologi nå cellerne i fibrin blodprop uden problemer og har hidtil ikke stødt på molekyler, der ville blive bevaret af blodprop, som dog er en mulighed, der skal empirisk testet.
Afslutningsvis, ved hjælp af Fibrin blodpropper giver en pålidelig og relativt let at gennemføre en måde at immobilisere levende væv til levende billeddannelse. Ud over dets anvendelighed til at begrænse lateral drifting har evnen til at ændre kulturmediet under live billeddannelse vist sig uvurderlig for vores kemiske genetik tilgang til at studere den asymmetriske celledeling af D. melanogaster neuroblaster21. Vi forventer, at denne teknik vil være gavnlig for undersøgelser i en lang række forskellige væv, især hvis de involverer kemisk genetik eller for eksempel protein selvmærkning29.
Vores MultiHyperStackReg makro er afhængig af TurboReg ImageJ plugin, som justerer successive rammer eller skiver af en stak, og MultiStackReg ImageJ plugin, som gør det muligt at anvende transformationer til andre stakke. MultiHyperStackReg gør det ganske enkelt muligt at anvende disse transformationer på hyperstacks (stakke med mindst fire dimensioner). Da brugen af MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, kræver mange handlinger og kan blive ret tidskrævende, skrev vi også Makroen AutoHyperStackReg, som automatisk udfører alle de trin, der er beskrevet i trin 6.2 og 6.3. I modsætning til MultiHyperStackReg mangler AutoHyperStackReg i øjeblikket muligheden for at beregne justeringen af en stak baseret på et underområde af denne stak, en mulighed, som vi fandt, er undertiden afgørende for en tilfredsstillende justering. En anden begrænsning af AutoHyperStackReg er, at dens anvendelse er begrænset til oversættelser og ikke de andre transformationer foreslået af TurboReg og MultiStackReg, mens MultiHyperStackReg kan gælde for en hyperstack enhver transformationstype, hvis brugeren har brug for det. Fremtidige udgivelser implementerer disse funktioner og vil være tilgængelige på GitHub30. Endelig giver vores roterende linescan makro en nem måde til hurtigt at måle kortikale signaler i tidsforskydninger, selvom cortex ændrer sin position eller orientering over tid. Om dens sporingstilstand eller dens ikke-sporingstilstand er bedst egnet til analyse afhænger af kvaliteten og konsistensen af det kortikale signal. Sporingstilstanden er lettere at bruge, da brugeren ikke behøver at overveje, hvor cortex vil være for hvert tidspunkt og kan rumme store ændringer af position og orientering over tid. Det er dog kun egnet, hvis det kortikale signal forbliver stærkt nok til detektion under hele filmen: en manglende detektering af andet end cortex (f.eks. et lyst cytoplasmisk rum tæt på cortex) kan kompromittere detektionen for hvert efterfølgende tidspunkt (f.eks. bevæger det cytoplasmiske rum sig væk fra cortex, og de kortikale linjer kan følge det resten af tiden bortfalder). Ikke-sporingstilstanden har ikke denne faldgrube, da detektionen er begrænset til den linje, der oprindeligt blev trukket af brugeren (f.eks. kan et lyst cytoplasmisk rum forårsage, at detektionen mislykkes i et par tidspunkter, men da det cytoplasmiske rum bevæger sig væk fra detektionszonen, genoptages korrekt detektion af cortex), men opfører sig ikke godt, hvis cortexpositionen eller orienteringen ændres meget over tid. Den næste funktion (som vil være tilgængelig på GitHub30), der skal udvikles til sporingstilstanden, vil være muligheden for kun at analysere angivne tidspunkter og definere et referencetidspunktspunkt (i stedet for det første tidspunkt), før hvilket og efter hvilket registreringen udføres, hvilket giver brugeren mulighed for i det mindste at undgå problematiske tidspunkter.

Drosophila er fortsat et vigtigt modelsystem til at studere en lang række biologiske spørgsmål og har udmærket sig i at fremme viden inden for mange discipliner i årtier. En funktion, der får det til at skille sig særligt ud, er, at det er særligt velegnet til live billedbehandling. Evnen til at overvåge subcellulære processer eller adfærd af celler og væv i realtid fortsætter med at bidrage til at generere nøglebegreber, der er relevante for celle- og udviklingsbiologi. Mange succesfulde protokoller er blevet udviklet af forskellige grupper til at opretholde sådanne Drosophila prøver i live og sunde til at studere adfærd prøven og fluorescerende molekyler lever. Organer og væv fra fluen, såsom imaginaale diske1,2, larvehjernen3,4,5,6eller ægkamre af voksne kvinder7,8,9eller den voksne tarm10 for eksempel kan udvindes og holdes i kultur til billeddannelse med time-lapse mikroskopi. En vigtig udfordring for live billedbehandling er at sikre, at prøven holdes tæt på billedfladen for optimal opløsning og immobil uden at gå på kompromis med prøveintegriteten, der kan være følsom over for mekaniske påvirkninger. At studere neurale stamceller, kaldet neuroblaster eller neuroner i Drosophila larve hjernen, for eksempel, at holde prøver tæt på billeddannelse overfladen kan opnås ved at dække dem med kultur medier i forseglede billeddannelsekamre 11,12,13. Denne tilgang tillader dog ikke let medieudveksling og begrænser dermed eksperimentelle manøvrerum. Alternativt kan prøver fremstilles og placeres på coverslips behandlet for at øge vedhæftning af celler og tillade multi-point besøgende mikroskopi og udvidet levende celle billeddannelse i åben kultur retter, der potentielt tillader medieudveksling, men giver ikke nemme midler til at forhindre prøve drift eller tab under medieudveksling14,15.
Fibrin-koagulationsmetoden, der oprindeligt blev udviklet til at studere meiose hos levende kranflue spermatocytter16, er specielt egnet til at overvinde disse problemer. Fibrinogen opløses i det relevante dyrkningsmedium, prøverne placeres og orienteres i en dråbe af denne opløsning på et passende glasoverfladebilledkammer, før Thrombin tilsættes, hvilket resulterer i hurtig dannelse af en uopløselig Fibrin-blodprop, et klæbrigt fibernet, der klæber til glasoverfladen og prøverne, samtidig med at prøvens adgang til kulturmediet sikres. Mediet kan derefter udskiftes uden at forstyrre blodproppen eller prøvepositionen. Kulturmediumudveksling under billeddannelse er f.eks. ønskelig, når der skal tilføjes hæmmere som i den oprindelige metode eller til udvasknings- eller pulsjagtforsøg, eller når der skal tilsættes fluorescerende farvestoffer under levende cellebilleddannelse, samtidig med at celler og væv holdes på plads. Fibrin blodpropper er velegnede til billeddannelse af Drosophila væv samt individuelle celler13,17. Fibrin blodpropper kan yderligere bruges til at hjælpe orientere prøver, at på grund af deres form eller andre egenskaber normalt ikke ville være orienteret på den ønskede måde ved at modulere prøvepositionen inden for Fibrin-koagulationen og selve blodproppens form.
Her leverer vi en opdatering på vores nuværende Fibrin-koagulationsbaserede billeddannelsesmetoder og leverer værktøjer til segmenteringsbaseret billedanalyse og fokuserer på brugen af denne metode til at studere neuroblastdivisioner i den udviklende fluehjerne. Vi bruger rutinemæssigt Fibrin-blodpropmetoden til at følge flere prøver i forskellige blodpropper i den samme kulturret. Dette gør det muligt i) billeddannelse af subcellulære hændelser såsom centrafæringsadfærd eller mRNA-lokalisering live18,19, ii) overvågning af prøvernes opførsel ved farmakologisk behandling af forskellige genotyper under de samme billedindstillinger ved hjælp af multipunktbesøg mikroskopi20, iii) undersøgelse af virkningerne af akut hæmning af enzymer21 og iv) minimering af drifting for at undersøge ændringer i retningen af celledeling af celler i deres fysiologiske miljø ved målrettet laserabsorption22. Mens uønskede virkninger af Thrombin og Fibrinogen og Fibrin-blodproppen skal testes empirisk for hver prøve, denne metode er i princippet egnet til at immobilisere enhver type prøve, der skal analyseres ved levende cellebilleddannelse, og i Drosophila er med succes blevet brugt til at studere flere aspekter af neuroblasterbiologi5,19,20, men også dynamikken i cytosensorprojektioner af kvindelige kimlinjestamceller23 og ændringer i polaritet ved akut aPKC-hæmning af follikelceller i Drosophila kvindelige ægkamre21.
Time-lapse fluorescerende billeddannelse resulterer i generering af komplekse tidsløste 3D-datasæt, der kræver metoder til at udtrække disse kvantitative oplysninger. Her beskriver vi vores videre udvikling af ImageJ-baserede24 makroer, der kan bruges til at korrigere for drifting i hyperstacks og specialfremstillede ImageJ makroer, der tillader semi-automatiseret kvantificering af multi-kanal fluorescens på cell cortex udviklet til at kvantificere kortikale proteiner i neuroblaster af Drosophila larve hjerner eller af individuelle neuroblasts i primær celle kultur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila er et vigtigt modelsystem til at studere en lang række biologiske spørgsmål. Forskellige organer og væv fra forskellige udviklingsstadier af fluen, såsom imaginaale diske, larvehjernen eller ægkamrene hos voksne kvinder eller voksen tarmen kan udvindes og opbevares i kultur til billeddannelse med time-lapse mikroskopi, hvilket giver værdifuld indsigt i celle- og udviklingsbiologi. Her beskriver vi i detaljer vores nuværende protokol for dissektion af Drosophila larve hjerner, og derefter præsentere vores nuværende tilgang til immobilisering og orientering larve hjerner og andet væv på et glas coverlip ved hjælp af Fibrin blodpropper. Denne immobiliseringsmetode kræver kun tilsætning af Fibrinogen og Thrombin til kulturmediet. Det er velegnet til høj opløsning tid bortfalder billeddannelse på omvendte mikroskoper af flere prøver i samme kultur parabol, minimerer lateral drifting ofte forårsaget af bevægelser af mikroskop fase i multi-punkts besøger mikroskopi og giver mulighed for tilsætning og fjernelse af reagenser i løbet af billeddannelse. Vi præsenterer også specialfremstillede makroer, som vi rutinemæssigt bruger til at korrigere for drifting og til at udtrække og behandle specifikke kvantitative oplysninger fra time-lapse-analyse.

Immobilisering af Drosophila væv med Fibrin blodpropper og kultur medium udveksling under levende billeddannelse. Efter at være blevet dissekeret efter proceduren i trin 2 (Figur 1) og immobiliseret i Fibrin-blodpropper på samme coverlip efter proceduren i trin 3 (Figur 2), blev larvehjerner, der udtrykker GFP-mærket Bazooka (Baz::GFP), flue orthologen af polaritetsproteinet Par-3, afbildet i 30 minutter i time-lapse multi-position confocal imaging. Baz::GFP kombineres med apkcas4, en allel, der tillader akut hæmning af atypisk protein kinase C (aPKC) gennem tilsætning af den lille ATP analog 1-NAPP120. 1-NAPP1 blev derfor føjet til kulturmediet efter proceduren i trin 4, og live imaging blev genoptaget i 2,5 timer. Kontrol hjerner transporterer en vild-type version af kinase aPKC reagerede ikke på ATP analog, mens hjerner transporterer desuden en analog-følsom mutation af aPKC (apkcas4) viste en sammentrækning af neuroepithelium og lyse klynger af Baz i neuroblaster og deres afkom ( Figur6, Video 1). Neuroblaster holder på dividere hele time-lapse, hvilket tyder på, at vævet forbliver sundt, og hjerner viser lidt drift på trods af kultur medium forandring, hvilket tyder på, at de er godt immobiliseret. På samme måde blev ovarioler, der udtrykker Baz::GFP, efter at være blevet dissekeret efter den procedure, der blev fremlagt i27, immobiliseret i fibrin-blodpropper på samme coverlip og afbildet i 8 minutter, hvorefter anvendelsen af 1-NAPP1 fremkaldte sammentrækningen af apkcas4 mutant follikulære celler, men ikke af kontroller (Figur 7, Video 2).
Rettelse af sideværts og fokus afdrift ved hjælp af MultiHyperstackReg. En hyperstack, der viser både lateral og fokus drift (Video 3, venstre panel) blev først korrigeret for lateral drift (trin 6.2, Figur 3, Video 3, midterste panel), derefter fokusere drift (trin 6.3, Figur 4, Video 3, højre panel) ved hjælp af MultiStackReg plugin og MultiHyperstackReg makro, hvilket resulterer i en betydelig reduktion af bevægelser observeret i den oprindelige hyperstack.
Kortikal signalmåling ved hjælp af roterende linecans En neuroblast udtrykke Baz::GFP (grøn) og transmembrane protein CD4 mærket med en infrarød fluorescerende protein (CD4::mIFP, rød) blev afbildet under en mitose. CD4::mIFP-signalet blev brugt som reference til at detektere cortex i forskellige dele af neuroblasten med linecans (trin 7, Figur 5, Figur 8A-C) og Baz::GFP-signalet blev målt ved de fundne positioner Figur 8D). Under deres division polariserede neuroblaster forbigående ved at etablere forskellige og modsatte kortikale domæner: den apikale pol og den basale pol. Baz definerer den apikale pol, og konsekvent steg Baz::GFP-signalet ved neuroblasterens apikale pol og faldt ved basalstangen under divisionen (Figur 8C, D). Placeringen af cortex blev tilfredsstillende sporet i hele time-lapse(Figur 8C, Video 4). Der henvises til Drosophila-linjerne og genotyperne i supplerende tabel 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figur 6: Anvendelse af en ATP-analog på immobiliserede larvehjerner under levende billeddannelse. (A) Levende billeddannelse af to larvehjerner, der udtrykker Baz::GFP immobiliseret på samme coverlip. Dyrkningsmediet ændres til en koncentration på 10 μM af ATP analog 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrolhjerner reagerer ikke synligt på ATP-analogen, mens hjerner, der bærer en analog følsom mutation af aPKC (aPKCAS4), viser en sammentrækning af neuroepithelium (pilespidser) og lyse klynger af Baz i neuroblaster og deres afkom. Maksimal intensitetsprojektion på 33 skiver for en dybde på 23 μM. Skalastang: 20 μM. (B) Forstørrelse af neuroepithelium. Skalalinje: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figur 7: Anvendelse af en ATP-analog på immobiliserede ægkamre under levende billeddannelse. Live billeddannelse af to ovarioler udtrykke Baz:: GFP immobiliseret på samme coverslip. Dyrkningsmediet ændres til en koncentration på 10 μM af ATP analog 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrolægkamre reagerer ikke synligt på ATP-analogen, mens ægkamre med en analog følsom mutation af aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrækning af epitelet (pilespidserne), hvilket i sidste ende fører til den tilsyneladende nedbrydning af klæbekryds. Maksimal intensitetsfremskrivning på 33 skiver for en dybde på 27 μM. Skalabjælke: 20 μM. Klik her for <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figur 8: Måling af det kortikale signal ved hjælp af roterende linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast udtrykke Baz::GFP (grøn) og CD4::mIFP (rød). Cyan linjer: indledende scanning linjer spores vinkelret på forskellige kortikale zoner til at måle. Skalalinje: 5 μM. (B) Identifikation af cortex (mørkeblå linje) ved hjælp af kortikale linecans og CD4::mIFP (rød) som referencekanal. Cyan linje: område defineret af "Mål omkring" parameter (her, 2 pixels), hvor signalet måles efter cortex detektion. Skalalinje: 2 μm. (C) Cyan: kortikale områder identificeret under en neuroblastdivision ved hjælp af den roterende linecans-metode fra de indledende scanningslinjer, der vises i (A), ved hjælp af CD4::mIFP (rød) som referencekanal. Skalabjælke: 5 μM. Pil: apikale stang. Pilespids: basal stang. (D) Måling af Baz::GFP-signalintensiteten over tid i de to tilsvarende zoner, der identificeres ved roterende linecans, der vises i (C). Under mitose bliver Baz::GFP forbigående beriget ved neuroblasterens apikale pol og er udtømt fra den modsatte basalstang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Video 1: Anvendelse af medieudveksling på immobiliserede larvehjerner under live billeddannelse for at tilføje en hæmmer, præsenteret i figur 6, skalabjælke: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Video 2: Anvendelse af medieudveksling på immobiliserede ægkamre under live billeddannelse for at tilføje en hæmmer, præsenteret i figur 7, skalabjælke: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Video 3: Korrektion af sideværts og fokus drift ved hjælp af MultiHyperStackReg. Levende billeddannelse af en neuroblast, der udtrykker membransonden PH::GFP. Xy: enkelt brændplan. Xz: ortogonal reslice. Til venstre: før korrektion af afdriften. Midt: efter korrektion af sideafdriften. Til højre: Efter korrektion af sideværts og fokus drift, skala bar: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Video 4: Påvisning af cortex ved hjælp af roterende linecans, præsenteret i figur 8, skala bar: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende tabel 1: Genotyper af afbildede Drosophila væv. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel 2: Oprindelsen af de anvendte transgener. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende kodningsfil 1: Oprindelsen af de anvendte transgener. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>
Supplerende kodningsfil 2: Oprindelsen af de anvendte transgener. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>
Supplerende kodningsfil 3: Oprindelsen af de anvendte transgener. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Denne protokol beskriver anvendelser af prøve immobilisering ved hjælp af Fibrin blodpropper, begrænse drivende, og tillader tilsætning og udvaskning af reagenser under levende billeddannelse. Prøver overføres til en dråbe Fibrinogen, der indeholder dyrkningsmedium på overfladen af en coverlip, hvorefter polymerisering induceres ved at tilsætte thrombin.

Anvendelse af immobilisering af Drosophila Tissues med Fibrin Blodpropper til Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsigtet Live-Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Stænger i Live Heat Stressed Drosophila Embryoner

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion og levende billeddannelse af den sene embryonale Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Visualisering af virkningerne af oxidative skader på Drosophila Egg Chambers ved hjælp af Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...