Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Arbeidet i Januschke-laboratoriet støttes av Wellcome trust grants 100031/Z/12/A og 1000032/Z/12/A. Vevsavbildningsanlegget støttes av tilskuddet WT101468 fra Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Levende avbildning av hele fjellet D. melanogaster larvalhjerner gir mulighet til å observere asymmetriske nevrale stamcelledelinger under forhold nær en fysiologisk kontekst. Den første delen av vår protokoll introduserer vår tilnærming til disseksjon av larvalhjerner. Som allerede nevnt13, er et kritisk aspekt av preparatet å unngå å skade hjernen. Det mest utfordrende aspektet ved dette er å skille hjernen fra de nærliggende imaginale diskene uten å trekke for mye på hjernen. Vår tilnærming til å "kutte uten å trekke" er å utføre enten en slipebevegelse med spissene på ett par tang, eller å skyve en tangspiss langs to andre tangspisser som holder forbindelsen mellom vev (Figur 1A), mens Lerit et al. beskriver saglignende bevegelser med en dissekeringspinne. Vi anbefaler eksperimentet å prøve alle tilnærminger og å vedta den best egnede for seg selv. Vi foreslår også at du bruker BSA- eller FCS-belagte pipettespisser i stedet for disseksjonsverktøy for å overføre isolerte hjerner. Belegget forhindrer vev i å holde seg til plasten og tillater sikker overføring av vev mens de alltid holder dem helt nedsenket, uten å utsette dem for en mulig forbigående deformasjon når de holder seg til disseksjonsverktøyet under overføringen. Belagte tips har andre fordeler for å tillate overføring av flere hjerner samtidig, noe som er spesielt nyttig når det er viktig å kontrollere oppholdstiden til prøvene innenfor et bestemt medium; de er egnet for overføring av andre vev, selv skjøre som for eksempel fettlegemer; De kan romme et bredt spekter av forskjellige prøvestørrelser ved å bruke større spisser eller kutte ekstremiteten til spissen.
Deretter beskriver denne protokollen bruken av Fibrinogen koagulering for å immobilisere larvalhjerner på forsiden av en kulturrett. En hjerne er orientert innenfor en dråpe kulturmedium + Fibrinogen, hvorpå koagulering induseres ved tilsetning av Trombin. Fibrinformasjonen er gradvis, noe som gir et tidsvindu der retningen på prøven kan finjusteres, om nødvendig (Figur 2C). Hvis det er nødvendig med en liten kompresjon av prøven - som vi fraråder når det gjelder larvalhjerner - kan den også finjusteres ved å trykke på blodpropp mer eller mindre nær prøven i trinn 3.4.4 og 3.5.2. Den største fordelen med denne Fibrinogen koagulering over protokollen beskrevet i Lerit et al., der hjerner er montert mellom en gassgjennomtrengelig membran og en coverlip, er evnen til å erstatte kulturmediet under levende avbildning. En mulig fordel ved å bruke en gassgjennomtrengelig membran over vår protokoll kan være at den gir en optimal oksygenering av prøvene, noe som kan være mer begrenset med vår tilnærming ettersom hjernen er skilt fra luften av blodpropp og noe medium. Av denne grunn, selv om vi ikke vurderte effekten av mengden kulturmedium i kulturretten, foreslår vi å begrense mengden kulturmedium på toppen av blodproppene mens du holder blodproppene helt nedsenket.
Siden manipuleringen av blodproppene kan være eksperimentelt vanskelig og tidkrevende, anbefaler vi at eksperimentatoren først praktiserer å manipulere blodpropper uten prøver. Modulering av volumet av dråpen av kultur medium + Fibrinogen på dekslenelip, konsentrasjonen av Fibrinogen eller volumet og konsentrasjonen av Trombin kan bidra til å gjøre preparatet enklere og kan være viktig når du tilpasser protokollen til andre typer vev. Med nok erfaring til å manipulere blodproppene, kan flere hjerner immobiliseres i en blodpropp om nødvendig, selv om det kompliserer finjusteringen av orienteringen. Flere blodpropper kan dannes på dekslene, slik at for eksempel bildeprøver av forskjellige genotyper. Det er også mulig å eksponere forskjellige blodpropper på samme coverlip til forskjellige kulturmedier, selv om det må tas hensyn til aldri å blande dråper kulturmedium som dekker de forskjellige blodproppene. Når larvalhjerner er immobilisert og klare for levende avbildning, anbefaler vi å følge anbefalingene fra Lerit et al.13 for å unngå overdreven fotodamage. Vi legger bare til disse anbefalingene for ikke bare å opprettholde hjernen ved 25 °C under levende avbildning med en sceneinkubator, men også for å forvarme dette stadiet i minst 30 minutter før starten av avbildningen. I våre hender resulterer det systematisk i en sterk fokusdrift å unnlate å gjøre det.
Det kan være en fordel i noen sammenhenger å kunne utføre korrelert mikroskopi og fikse og immunostain en prøve etter levende avbildning. En begrensning ved bruk av Fibrin-blodpropper er imidlertid at det er nesten umulig å mekanisk isolere en hjerne fra en blodpropp uten å skade den. En mulig måte å overvinne denne begrensningen kan være å utvikle metoder for å forringe Fibrin-blodpropper med Plasmin eller å indusere blodpropp demontering ved å legge til et peptid som etterligner knottene som tillater Fibrin-polymerisering28. Vi bruker vanligvis Fibrin-blodpropper på prøver som spenner fra enkeltceller til 200 μM lange vev, men vi kan også lykkes med å immobilisere i blodpropper og bildehjerner fra voksne humle over 3 mm brede. Den øvre grensen for prøvestørrelsen som kan immobiliseres i blodpropper gjenstår å bestemme. På samme måte, selv om vi vanligvis ser for oss immobiliserte prøver i 4 til 5 timer, har vi med hell avbildet nevroblaster i primærkulturen i opptil 3 dager, noe som indikerer at blodpropp i det minste ikke forstyrrer langsiktig levedyktighet. Tvert imot kan blodpropper lette den vanlige utskiftingen av mediet, et krav om langsiktig avbildning, uten behov for enheter som peristaltiske pumper til dette formålet. Selv om vi ikke har målt permeabilitetsparametrene til fibrin-blodpropper, ser blodproppenes fibrøse gellignende natur ut til å være gjennomførbare av cellegjennomtrengelige molekyler. Vi fant ut at Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligander og andre standardfarger som brukes i cellebiologi, når cellene i fibrin-blodpropp uten problemer og har så langt ikke møtt molekyler som vil bli beholdt av blodpropp, som imidlertid er en mulighet som må testes empirisk.
Til slutt gir bruk av Fibrin-blodpropper en pålitelig og relativt enkel å implementere en måte å immobilisere levende vev for levende avbildning. Utover sin nytte i å begrense lateral drifting, evnen til å endre kulturmediet under levende avbildning har vist seg uvurderlig for vår kjemiske genetikk tilnærming til å studere asymmetrisk celledeling av D. melanogaster neuroblaster21. Vi forventer at denne teknikken vil være gunstig for studier i et bredt spekter av forskjellige vev, spesielt hvis de involverer kjemisk genetikk eller for eksempel protein selvmerking29.
Vår MultiHyperStackReg makro er avhengig av TurboReg ImageJ plugin, som justerer etterfølgende rammer eller skiver av en stabel, og MultiStackReg ImageJ plugin, som gjør det mulig å bruke transformasjoner til andre stabler. MultiHyperStackReg gjør det ganske enkelt mulig å bruke disse transformasjonene på hyperstakker (stabler med minst fire dimensjoner). Ettersom bruken av MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, krever mange handlinger og kan bli ganske tidkrevende, skrev vi også Makroen AutoHyperStackReg, som automatisk utfører alle trinnene som er beskrevet i trinn 6.2 og 6.3. Men i motsetning til MultiHyperStackReg mangler AutoHyperStackReg for øyeblikket muligheten til å beregne justeringen av en stabel basert på en underregion av denne stakken, et alternativ som vi fant noen ganger er avgjørende for en tilfredsstillende justering. En annen begrensning ved AutoHyperStackReg er at bruken er begrenset til oversettelser og ikke de andre transformasjonene foreslått av TurboReg og MultiStackReg, mens MultiHyperStackReg kan gjelde for en hyperstakk enhver transformasjonstype hvis brukeren trenger det. Fremtidige utgivelser vil implementere disse funksjonene og vil være tilgjengelige på GitHub30. Til slutt gir vår roterende linjer en enkel måte å raskt måle kortikale signaler i tidsforløp, selv om cortexen endrer sin posisjon eller orientering over tid. Hvorvidt sporingsmodusen eller ikke-sporingsmodusen er best egnet for analyse, avhenger av kvaliteten og konsistensen til det kortikale signalet. Sporingsmodusen er enklere å bruke, da brukeren ikke trenger å vurdere hvor cortex vil være for hvert tidspunkt og kan imøtekomme store endringer i posisjon og orientering over tid. Det er imidlertid bare egnet hvis det kortikale signalet forblir sterkt nok til deteksjon under hele filmen: manglende registrering av noe annet enn cortex (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom nær cortex) kan kompromittere deteksjonen for hvert følgende tidspunkt (f.eks. det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra cortex og de kortikale linjene kan følge det resten av tiden bortfall). Ikke-sporingsmodusen har ikke denne fallgruven, da deteksjonen er begrenset til linjen som opprinnelig ble tegnet av brukeren (f.eks. et lyst cytoplasmisk rom kan føre til at deteksjonen mislykkes i noen få tidspunkter, men ettersom det cytoplasmiske rommet beveger seg bort fra deteksjonsområdet, fortsetter riktig deteksjon av cortex), men oppfører seg ikke bra hvis cortex-posisjonen eller orienteringen endres mye over tid. Den neste funksjonen (som vil være tilgjengelig på GitHub30) som skal utvikles for sporingsmodus, vil være alternativet for å bare analysere angitte tidspunkter og definere et referansetidspunkt (i stedet for det første tidspunktet) før og etter hvilken deteksjonen vil bli utført, noe som gjør at brukeren i det minste kan unngå problematiske tidspunkter.

Drosophila er fortsatt et viktig modellsystem for å studere et stort spekter av biologiske spørsmål og har utmerket seg i å fremme kunnskap innen mange disipliner i flere tiår. En funksjon som gjør at den spesielt skiller seg ut, er at den er spesielt godt egnet for levende bildebehandling. Evnen til å overvåke subcellulære prosesser eller oppførselen til celler og vev i sanntid fortsetter å bidra til å generere nøkkelbegreper som er relevante for celle- og utviklingsbiologi. Mange vellykkede protokoller har blitt utviklet av forskjellige grupper for å opprettholde slike Drosophila-prøver levende og sunne for å studere oppførselen til prøven og fluorescerende molekyler lever. Organer og vev fra fluen som imaginale plater1,2, larvalhjernen3,4,5,6eller eggkamre av voksne kvinner7,8,9eller voksentarmen10 kan for eksempel ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikrokopi. En viktig utfordring for levende bildebehandling er å sikre at prøven holdes nær bildeflaten for optimal oppløsning og immobil uten at det går på bekostning av prøveintegritet som kan være følsom for mekaniske påvirkninger. For å studere nevrale stamceller, kalt nevroblaster eller nevroner i Drosophila larvalhjernen, for eksempel, kan du holde prøver nær bildeflaten ved å dekke dem med kulturmedier i forseglede bildekamre11,12,13. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke lett medieutveksling og begrenser dermed eksperimentelt handlingsrom. Alternativt kan prøver tilberedes og plasseres på coverlips som behandles for å øke vedheft av celler og tillate multi-point besøkende mikroskopi og utvidet live-celle avbildning i åpne kulturretter, som potensielt tillater medieutveksling, men gir ikke enkle midler for å forhindre prøvedrift eller tap under medieutveksling14,15.
Fibrin-blodproppmetoden som opprinnelig ble utviklet for å studere meiosis i levende kranflue spermatocytter16, er spesielt egnet til å overvinne disse problemene. Fibrinogen er oppløst i relevant kulturmedium, prøvene plassert og orientert i en dråpe av denne løsningen på et tilstrekkelig glassoverflate bildekammer før Trombin tilsetts, noe som resulterer i rask dannelse av en uoppløselig Fibrin-blodpropp, et klebrig fibrøst nett som fester seg til glassoverflaten og prøvene samtidig som de sikrer tilgang til prøven til kulturmediet. Mediet kan deretter byttes uten å fortrenge blodpropp eller prøveposisjon. Kulturmediumutveksling under avbildning er for eksempel ønskelig når inhibitorer skal tilsettes som i den opprinnelige metoden eller for utvasking eller pulsjakteksperimenter eller når fluorescerende fargestoffer skal tilsettes under levende celleavbildning mens celler og vev holdes på plass. Fibrin blodpropper er egnet for avbildning av Drosophila vev samt individuelle celler13,17. Fibrin-blodpropper kan videre brukes til å orientere prøver, som på grunn av deres form eller andre egenskaper normalt ikke ville være orientert på ønsket måte ved å modulere prøveposisjon i Fibrin-blodpropp og formen på blodpropp selv.
Her gir vi en oppdatering om våre nåværende Fibrin-blodproppbaserte avbildningsmetoder og gir verktøy for segmenteringsbasert bildeanalyse og fokus på bruk av denne metoden for å studere nevroblastomdivisjoner i den utviklende fluehjernen. Vi bruker rutinemessig Fibrin-blodproppmetoden til å følge flere prøver i forskjellige blodpropper i samme kulturrett. Dette tillater i) avbildning av subcellulære hendelser som sentrosom atferd eller mRNA lokalisering live18,19, ii) overvåking av oppførselen til prøver ved farmakologisk behandling av forskjellige genotyper under samme bildebehandlingsinnstillinger ved hjelp av flerpunktsbesøk mikroskopi20, iii) studere effekten av akutt inhibering av enzymer21 og iv) minimere drifting for å studere endringer i orienteringen av celledeling av celler i deres fysiologiske miljø ved målrettet laser-ablasjon22. Mens uønskede effekter av Trombin og Fibrinogen og Fibrin-blodpropp må testes empirisk for hver prøve, denne metoden er i prinsippet egnet til å immobilisere enhver type prøve som skal analyseres av levende celleavbildning og i Drosophila har blitt brukt til å studere flere aspekter av nevroblasterbiologi5,19,20, men også dynamikken i cytosensorprojeksjoner av kvinnelige bakterielinje stamceller23 og endringer i polaritet ved akutt aPKC-hemming av follikkelceller av Drosophila kvinnelige eggkamre21.
Tidsforløp fluorescerende avbildning resulterer i generering av komplekse tidsavklarte 3D-datasett som krever metoder for å trekke ut denne kvantitative informasjonen. Her beskriver vi vår videre utvikling av ImageJ-baserte24 makroer som kan brukes til å korrigere for drifting i hyperstakker og skreddersydde ImageJ-makroer som tillater halvautomatisk kvantifisering av flerkanals fluorescens ved cellebarken utviklet for å kvantifisere kortikale proteiner i nevroblaster av Drosophila larvalhjerner eller av individuelle nevroblaster i primærcellekultur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila er et viktig modellsystem for å studere et stort utvalg av biologiske spørsmål. Ulike organer og vev fra ulike utviklingsstadier av flyet som imaginale plater, larvalhjernen eller eggkamrene til voksne kvinner eller voksentarmen kan ekstraheres og holdes i kultur for avbildning med tidsforløpmikroskopi, noe som gir verdifull innsikt i celle- og utviklingsbiologi. Her beskriver vi i detalj vår nåværende protokoll for disseksjon av Drosophila larvalhjerner, og presenterer deretter vår nåværende tilnærming for immobilisering og orientering av larvalhjerner og andre vev på en glassdekslelip ved hjelp av Fibrin-blodpropper. Denne immobiliseringsmetoden krever bare tilsetning av Fibrinogen og Trombin til kulturmediet. Den er egnet for høyoppløselig tidsforløpavbildning på inverterte mikroskoper av flere prøver i samme kulturfat, minimerer lateraldriften ofte forårsaket av bevegelser av mikroskopstadiet i multipunktsbesøkende mikroskopi og tillater tilsetning og fjerning av reagenser i løpet av avbildning. Vi presenterer også skreddersydde makroer som vi rutinemessig bruker til å korrigere for drifting og for å trekke ut og behandle spesifikk kvantitativ informasjon fra tidsforløpanalyse.

Immobilisering av Drosophila vev med Fibrin blodpropper og kultur medium utveksling under levende bildebehandling. Etter å ha blitt dissekert etter prosedyren presentert i trinn 2 (Figur 1) og immobilisert i Fibrin-blodpropper på samme deksle etter prosedyren presentert i trinn 3 (Figur 2), ble larvalhjerner som uttrykker GFP-merket Bazooka (Baz::GFP), flyorthologen til polaritetsproteinet Par-3, avbildet i 30 minutter i tidsforløp multiposisjonocal imaging. Baz::GFP er kombinert med apkcas4, et smug som tillater akutt hemming av atypisk protein kinase C (aPKC) gjennom tilsetning av den lille ATP analog 1-NAPP120. 1-NAPP1 ble derfor lagt til kulturmediet etter prosedyren som ble presentert i trinn 4 og levende bildebehandling ble gjenopptatt i 2,5 timer. Kontrollhjerner som bærer en villtypeversjon av kinase aPKC reagerte ikke på ATP-analogen, mens hjerner som i tillegg bærer en analog-sensitiv mutasjon av aPKC (apkcas4) viste en sammentrekning av nevroepithelium og lyse klynger av Baz i nevroblaster og deres avkom ( Figur6, Video 1). Nevroblaster fortsetter å dele seg gjennom hele tidsforløpet, noe som indikerer at vevet forblir sunt, og hjernene viser liten drift til tross for kulturmedieendringen, noe som indikerer at de er godt immobilisert. På samme måte, etter å ha blitt dissekert etter prosedyren presentert i27, ble ovarioles som uttrykker Baz::GFP immobilisert i Fibrin-blodpropper på samme dekslelip og avbildet i 8 min, hvoretter anvendelsen av 1-NAPP1 induserte sammentrekningen av apkcas4 mutant follikulære celler, men ikke av kontroller (Figur 7, Video 2).
Korreksjon av lateral og fokus drift ved hjelp av MultiHyperstackReg. En hyperstakk som viser både lateral og fokusdrift (Video 3, venstre panel) ble først korrigert for lateral drift (trinn 6.2, Figur 3, Video 3, midtpanel), deretter fokusdrift (trinn 6.3, Figur 4, Video 3, høyre panel) ved hjelp av MultiStackReg-pluginen og MultiHyperstackReg-makroen, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av bevegelsene som observeres i den opprinnelige hyperstacken.
Kortikale signalmålinger ved hjelp av roterende linecans En nevroblast som uttrykker Baz::GFP (grønn) og transmembranproteinet CD4 merket med et infrarødt fluorescerende protein (CD4::mIFP, rød) ble avbildet under en mitose. CD4::mIFP-signalet ble brukt som referanse for å oppdage cortex på ulike deler av nevroblastomet med linecans (trinn 7, figur 5, figur 8A–C) og Baz::GFP-signalet ble målt ved de oppdagede posisjonene Figur 8D). Under deres divisjon polariserte nevroblaster forbigående ved å etablere distinkte og motsatte kortikale domener: den apikale polen og basalpolen. Baz definerer den apikale polen, og konsekvent økte Baz::GFP-signalet ved nevroblasterets apikale pol og reduserte ved basalpolen under divisjonen (Figur 8C,D). Cortexens posisjon ble tilfredsstillende sporet gjennom hele tidsforløpet (Figur 8C, Video 4). Det refereres til Drosophila-linjene og genotypene i Supplerende tabell 1–2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figur 6: Påføring av en ATP-analog på immobiliserte larvalhjerner under levende avbildning. (A) Live bildebehandling av to larvalhjerner som uttrykker Baz::GFP immobilisert på samme coverlip. Kulturmediet endres til en konsentrasjon på 10 μM av ATP-analogen 1-NAPP1 ved 0 min. Kontrollhjerner reagerer ikke synlig på ATP-analogen, mens hjerner som bærer en analog sensitiv mutasjon av aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrekning av nevroepithelium (pilspisser) og lyse klynger av Baz i nevroblaster og deres avkom. Maksimal intensitetsprojeksjon på 33 skiver for en dybde på 23 μM. Skalastang: 20 μM. (B) Forstørrelse av nevroepitheliet. Skalalinje: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figur 7: Påføring av en ATP-analog på immobiliserte eggkamre under levende bildebehandling. Levende bilde av to ovarioles som uttrykker Baz::GFP immobilisert på samme coverlip. Kulturmediet endres til en konsentrasjon på 10 μM av ATP-analogen 1-NAPP1 ved 0 min. Kontroll eggkamre reagerer ikke synlig på ATP-analogen, mens eggkamre som bærer en analog sensitiv mutasjon av aPKC (aPKCAS4) viser en sammentrekning av epitelet (pilspisser) som til slutt fører til tilsynelatende sammenbrudd av festekryss. Maksimal intensitetsprojeksjon på 33 skiver for en dybde på 27 μM. Skalalinje: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figur 8: Måling av kortikale signaler ved hjelp av roterende linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast uttrykker Baz::GFP (grønn) og CD4::mIFP (rød). Cyan linjer: innledende skannelinjer sporet vinkelrett til ulike kortikale soner for å måle. Skalalinje: 5 μM. (B) Identifikasjon av cortex (mørk blå linje) ved hjelp av kortikale linjer og CD4::mIFP (rød) som referansekanal. Cyan linje: område definert av parameteren "Measure around" (her, 2 piksler), hvor signalet måles etter cortex deteksjon. Skalalinje: 2 μm. (C) Cyan: kortikale områder identifisert under en nevroblastdeling ved den roterende linescans-metoden fra de første skannelinjene som vises i (A), ved hjelp av CD4: : mIFP (rød) som referansekanal. Skalastang: 5 μM. Pil: apical pole. Pilspiss: basal stang. (D) Måling av Baz::GFP-signalintensiteten over tid i de to tilsvarende sonene identifisert av roterende linjekannere som vises i (C). Under mitose blir Baz::GFP forbigående beriket på nevroblåsens apikale pol og er utarmet fra motsatt basalstang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: Anvendelse av medieutveksling på immobiliserte larvalhjerner under live bildebehandling for å legge til en inhibitor, presentert i figur 6, skalalinje: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 2: Påføring av medieutveksling på immobiliserte eggkamre under live bildebehandling for å legge til en inhibitor, presentert i figur 7, skalalinje: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 3: Korrigering av lateral og fokusdrift ved hjelp av MultiHyperStackReg. Levende avbildning av en nevroblaster som uttrykker membransonden PH::GFP. Xy: enkelt fokusplan. Xz: ortogonal reslice. Venstre: før korreksjon av driften. Midten: etter korreksjon av lateral drift. Høyre: etter korreksjon side- og fokusdriften, skalalinje: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 4: Deteksjon av cortex ved hjelp av roterende linecans, presentert i Figur 8, skalalinje: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Supplerende tabell 1: Genotyper av avbildet Drosophila vev. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Supplerende tabell 2: Opprinnelsen til transgenes som brukes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Ekstra kodefil 1: Opprinnelsen til transgenes som brukes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Ekstra kodefil 2: Opprinnelsen til transgenes som brukes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Ekstra kodefil 3: Opprinnelsen til transgenes som brukes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Denne protokollen beskriver anvendelser av prøve immobilisering ved hjelp av Fibrin-blodpropper, begrense drifting, og tillate tilsetning og utvasking av reagenser under levende avbildning. Prøver overføres til en dråpe Fibrinogen som inneholder kulturmedium på overflaten av en deksler, hvorpå polymerisasjon induserer ved å legge til trombin.

Anvendelser av Immobilisering av Drosophila Tissues med Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsiktig live Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranukleære Actin stenger i Live Heat Stresset Drosophila Embryoer

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Disseksjon og live-imaging av sen embryonal drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Visualisere effekten av oksidativ skade på Drosophila Egg Chambers ved hjelp av Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...