Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

O trabalho no laboratório Januschke é apoiado pelas bolsas de confiança Wellcome 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. A instalação de imagem tecidual é apoiada pela concessão WT101468 da Wellcome.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Imagens ao vivo de cérebros larvais de montagem d. melanogaster fornecem a oportunidade de observar divisões de células-tronco neurais assimétricas em condições próximas a um contexto fisiológico. A primeira parte do nosso protocolo introduz nossa abordagem sobre a dissecação de cérebros larvais. Como já dito13, um aspecto crítico da preparação é evitar danificar o cérebro. O aspecto mais desafiador disso é separar o cérebro dos discos imagináveis vizinhos sem puxar excessivamente o cérebro. Nossa abordagem para "cortar sem puxar" é realizar um movimento de moagem com as pontas de um par de fórceps, ou deslizar uma ponta de fórceps ao longo de duas outras pontas de fórceps segurando a conexão entre tecidos(Figura 1A) enquanto Lerit et al. descrevem movimentos semelhantes a serras com um pino dissecando. Aconselhamos o experimentador a tentar todas as abordagens e a adotar a mais adequada para si. Também sugerimos o uso de pontas de pipeta revestidas de BSA ou FCS em vez de ferramentas de dissecção para transferir cérebros isolados. O revestimento impede que os tecidos grudem no plástico e permite a transferência segura de tecidos, mantendo-os sempre completamente imersos, sem submá-los a uma possível deformação transitória, pois se apegam à ferramenta de dissecção durante a transferência. As pontas revestidas têm outras vantagens para permitir a transferência de vários cérebros ao mesmo tempo, o que é particularmente útil quando é fundamental controlar o tempo de residência das amostras dentro de um determinado meio; são adequados para a transferência de outros tecidos, mesmo os frágeis como, por exemplo, corpos de gordura; eles podem acomodar uma ampla gama de diferentes tamanhos de amostra usando pontas maiores ou cortando a extremidade da ponta.
Em seguida, este protocolo descreve o uso de coagulação de fibrinogênio para imobilizar cérebros larvais na tampa de um prato de cultura. Um cérebro é orientado dentro de uma gota de cultura média + Fibrinogen, após o qual a coagulação é induzida pela adição de Trombina. A formação de fibrina é gradual, proporcionando uma janela de tempo durante a qual a orientação da amostra pode ser ajustada, se necessário(Figura 2C). Se for necessária uma leve compressão da amostra - que aconselhamos no caso de cérebros larvais - ela também pode ser ajustada bem pressionando o coágulo mais ou menos perto da amostra durante as etapas 3.4.4 e 3.5.2. A principal vantagem deste fibrinogênio coagulando sobre o protocolo descrito em Lerit et al., em que os cérebros são montados entre uma membrana permeável a gás e uma mancha de cobertura, é a capacidade de substituir o meio de cultura durante a imagem ao vivo. Uma possível vantagem de usar uma membrana permeável a gás sobre nosso protocolo pode ser que ele fornece uma oxigenação ideal das amostras, que poderia ser mais limitada com nossa abordagem à medida que os cérebros são separados do ar pelo coágulo e algum meio. Por essa razão, embora não tenhamos avaliado o efeito da quantidade de cultura média dentro do prato de cultura, sugerimos limitar a quantidade de cultura média em cima dos coágulos, mantendo os coágulos completamente imersos.
Como a manipulação dos coágulos pode ser experimentalmente difícil e demorada, recomendamos que o experimentador primeiro pratique manipular coágulos sem amostras. Modulando o volume da queda do meio de cultura + Fibrinogênio na tampa, a concentração de Fibrinogen ou o volume e concentração de Trombina poderia ajudar a facilitar a preparação e poderia ser importante ao adaptar o protocolo a outros tipos de tecidos. Com experiência suficiente manipulando os coágulos, vários cérebros podem ser imobilizados em um coágulo, se necessário, embora complica o ajuste fino da orientação. Vários coágulos podem ser formados no deslizamento de tampas, permitindo, por exemplo, imagens de amostras de diferentes genótipos. Também é possível expor diferentes coágulos na mesma cobertura para diferentes meios culturais, embora tenha que ser tomado cuidado para nunca misturar as gotas do meio cultural que cobre os diferentes coágulos. Uma vez que os cérebros larvais estejam imobilizados e prontos para imagens ao vivo, aconselhamos seguir as recomendações de Lerit et al.13 para evitar fotodamagem excessiva. Só adicionamos a essas recomendações para não apenas manter os cérebros a 25 °C durante a imagem ao vivo com uma incubadora de estágio, mas também para pré-aqueça esta etapa por pelo menos 30 minutos antes do início da imagem. Em nossas mãos, não fazê-lo sistematicamente resulta em um forte foco à deriva.
Pode ser vantajoso em alguns contextos ser capaz de realizar microscopia correlacionada e corrigir e imunossuir uma amostra após a imagem viva. No entanto, uma limitação do uso de coágulos fibrinas é que é quase impossível isolar mecanicamente um cérebro de um coágulo sem danificá-lo. Uma possível maneira de superar essa limitação poderia ser desenvolver métodos para degradar coágulos fibrinas com Plasmin ou induzir a desmontagem do coágulo por adição de um peptídeo imitando os botões permitindo a polimerização fibrina28. Normalmente usamos coágulos fibrinos em amostras que variam de células únicas a tecidos longos de 200 μM, mas também poderíamos imobilizar com sucesso em coágulos e cérebros de imagem de abelhas adultas com mais de 3 mm de largura. O limite superior do tamanho da amostra que pode ser imobilizado em coágulos permanece a ser determinado. Da mesma forma, embora normalmente imagem amostras imobilizadas por 4 a 5 h, nós visualizamos com sucesso neuroblastos na cultura primária por até 3 dias, indicando que o coágulo pelo menos não interfere com a viabilidade a longo prazo. Pelo contrário, os coágulos podem facilitar a substituição regular do meio, requisito para imagens de longo prazo, sem a necessidade de dispositivos como bombas peristálticas para este fim. Embora não tenhamos medido os parâmetros de permeabilidade dos coágulos fibrinos, a natureza fibrosa em gel dos coágulos parece ser penetrável por moléculas permeáveis celulares. Descobrimos que Latrunculin A, Colcemid ou 1-NAPP1, ligantes HALO-tag e outros corantes padrão usados na biologia celular atingem as células no coágulo fibrina sem qualquer problema e até agora não encontraram moléculas que seriam retidas pelo coágulo, o que, no entanto, é uma possibilidade que precisa ser testada empiricamente.
Em conclusão, o uso de coágulos fibrinas fornece uma maneira confiável e relativamente fácil de implementar uma maneira de imobilizar tecidos vivos para imagens vivas. Além de sua utilidade em limitar a deriva lateral, a capacidade de mudar o meio cultural durante a imagem ao vivo tem se mostrado inestimável para nossa abordagem genética química para estudar a divisão celular assimétrica dos neuroblastos de D. melanogaster 21. Prevemos que essa técnica será benéfica para estudos em uma ampla gama de tecidos diferentes, particularmente se envolvem genética química ou, por exemplo, auto-rotulagem deproteínas 29.
Nossa macro MultiHyperStackReg conta com o plugin TurboReg ImageJ, que alinha quadros sucessivos ou fatias de uma pilha, e o plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar as transformações a outras pilhas. O MultiHyperStackReg simplesmente permite aplicar essas transformações a hiperséscimos (pilhas com pelo menos quatro dimensões). Como o uso do MultiHyperStackReg, como o descrevemos, requer muitas ações e pode ficar bastante demorado, também escrevemos a macro AutoHyperStackReg, que executa automaticamente todas as etapas descritas nas etapas 6.2 e 6.3. No entanto, ao contrário do MultiHyperStackReg, o AutoHyperStackReg atualmente não tem a possibilidade de calcular o alinhamento de uma pilha com base em uma sub-região desta pilha, uma opção que encontramos às vezes é crucial para um alinhamento satisfatório. Outra limitação do AutoHyperStackReg é que seu uso está restrito a traduções e não às outras transformações propostas pelo TurboReg e MultiStackReg, enquanto o MultiHyperStackReg pode se aplicar a um hiperstruo qualquer tipo de transformação caso o usuário precise. Futuras versões implementarão essas funções e estarão disponíveis no GitHub30. Finalmente, nossa macro de linhas rotativas fornece uma maneira fácil de medir rapidamente sinais corticais em lapsos de tempo, mesmo que o córtex mude sua posição ou orientação ao longo do tempo. Se seu modo de rastreamento ou seu modo de não rastreamento é mais adequado para análise depende da qualidade e consistência do sinal cortical. O modo de rastreamento é mais fácil de usar, pois o usuário não precisa considerar onde o córtex estará para cada ponto de tempo e pode acomodar grandes mudanças de posição e orientação ao longo do tempo. No entanto, só é adequado se o sinal cortical permanecer forte o suficiente para ser detectado durante todo o filme: uma falha em detectar qualquer outra coisa que não seja o córtex (por exemplo, um compartimento citoplasmático brilhante perto do córtex) pode comprometer a detecção para cada ponto de tempo seguinte (por exemplo, o compartimento citoplasmático se afasta do córtex e as linhas corticais podem segui-lo para o resto do lapso de tempo). O modo de não rastreamento não tem essa armadilha, pois a detecção é limitada à linha originalmente desenhada pelo usuário (por exemplo, um compartimento citoplasmônico brilhante pode fazer com que a detecção falhe por alguns pontos de tempo, mas à medida que o compartimento citoplasmônico se afasta da zona de detecção, a detecção adequada do córtex retoma), mas não se comporta bem se a posição córtex ou orientação mudar muito ao longo do tempo. O próximo recurso (que estará disponível no GitHub30) a ser desenvolvido para o modo de rastreamento será a opção de analisar apenas os pontos de tempo especificados e definir um ponto de tempo de referência (em vez do primeiro ponto de tempo) antes do qual e depois da qual a detecção será realizada, o que permitirá ao usuário pelo menos evitar pontos de tempo problemáticos.

A drosophila continua sendo um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas e tem se destacado no avanço do conhecimento em muitas disciplinas por décadas. Uma característica que o faz particularmente se destacar é que ele é especialmente adequado para imagens ao vivo. A capacidade de monitorar processos subcelulares ou o comportamento de células e tecidos em tempo real continua contribuindo para gerar conceitos-chave relevantes para a biologia celular e de desenvolvimento. Muitos protocolos bem sucedidos foram desenvolvidos por diferentes grupos para manter tais amostras de Drosophila vivas e saudáveis para estudar o comportamento do espécime e moléculas fluorescentes vivas. Órgãos e tecidos da mosca, como discos imagináveis1,2, o cérebro larval3,4,5,6, ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas7,8,9, ou o intestino adulto10, por exemplo, podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo. Um desafio fundamental para a imagem ao vivo é garantir que a amostra seja mantida perto da superfície de imagem para uma resolução ideal e imóvel sem comprometer a integridade da amostra que pode ser sensível a impactos mecânicos. Estudar células-tronco neurais, chamadas neuroblastos ou neurônios no cérebro larval de Drosophila, por exemplo, manter amostras próximas à superfície de imagem pode ser alcançada cobrindo-as com mídia cultural em câmaras de imagem seladas11,12,13. No entanto, essa abordagem não permite facilmente a troca de mídia, limitando assim o espaço experimental para manobras. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas e colocadas em tampas tratadas para aumentar a adesão das células e permitir microscopia de visitação de vários pontos e imagens estendidas de células vivas em pratos de cultura aberta, que potencialmente permitem a troca de mídia, mas não fornecem meios fáceis para evitar a deriva ou perda de amostras durante a troca de mídia14,15.
O método de coágulo fibrin originalmente desenvolvido para estudar a meiose em espermatos vivos de mosca-de-guindaste16 é especificamente adequado para superar esses problemas. O fibrinogênio é dissolvido em meio de cultura relevante, as amostras colocadas e orientadas em uma gota desta solução em uma câmara de imagem adequada de superfície de vidro antes da adição da Trombina, resultando na rápida formação de um coágulo fibrin insolúvel, uma malha fibrosa pegajosa que adere à superfície do vidro e às amostras, garantindo o acesso da amostra ao meio da cultura. O meio pode então ser trocado sem perturbar o coágulo ou a posição da amostra. A troca média de cultura durante a imagem é, por exemplo, desejável quando os inibidores devem ser adicionados como no método original ou para experimentos de lavagem ou perseguição de pulso ou quando corantes fluorescentes devem ser adicionados durante a imagem de células vivas, mantendo células e tecidos no lugar. Coágulos fibrinos são adequados para a imagem de tecidos drosophila, bem como células individuais13,17. Coágulos fibrinos podem ainda ser usados para ajudar a orientar amostras, que devido à sua forma ou outras propriedades normalmente não seriam orientadas da maneira desejada, modulando a posição da amostra dentro do coágulo fibrina e a forma do próprio coágulo.
Aqui fornecemos uma atualização sobre nossos métodos atuais de imagem baseados em coágulos fibrinas e fornecemos ferramentas para análise de imagem baseada em segmentação e focamos no uso deste método para estudar divisões de neuroblastos no cérebro de mosca em desenvolvimento. Usamos rotineiramente o método de coágulos fibrinas para seguir várias amostras em diferentes coágulos no mesmo prato de cultura. Isso permite i) imagens de eventos subcelulares como comportamento central ou localização mRNA ao vivo18,19, ii) monitorando o comportamento das amostras após o tratamento farmacológico de diferentes genótipos sob as mesmas configurações de imagem usando micros visitantes multipontos20, iii) estudar os efeitos da inibição aguda das enzimas21 e iv) minimizando a deriva para estudar mudanças na orientação da divisão celular das células dentro de seu ambiente fisiológico sobre a ablação alaser-alvo 22. Enquanto efeitos indesejados de Trombina e Fibrinogênio e o coágulo fibrinão precisam ser testados empiricamente para cada amostra, este método é, em princípio, adequado para imobilizar qualquer tipo de amostra que deve ser analisada por imagens de células vivas e em Drosophila tem sido usada com sucesso para estudar múltiplos aspectos da biologia dos neuroblastos5,19,20, mas também a dinâmica das projeções citosensoras das células-tronco da linha germina feminina23 e mudanças na polaridade sobre a inibição aguda de células folículos de Drosophila
A imagem fluorescente de lapso de tempo resulta na geração de complexos conjuntos de dados 3D resolvidos pelo tempo que requerem métodos para extrair essas informações quantitativas. Aqui descrevemos nosso desenvolvimento adicional de24 macros baseadas em ImageJ que podem ser usadas para corrigir para deriva em hipersobras e macros ImageJ personalizadas que permitem quantificação semi-automatizada de fluorescência multicanal no córtex celular desenvolvido para quantificar proteínas corticais em neuroblastos de cérebros larvais Drosophila ou de neuroblastos individuais na cultura celular primária.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
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applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

A drosophila é um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas. Vários órgãos e tecidos de diferentes estágios de desenvolvimento da mosca, como discos imagináveis, o cérebro larval ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas ou o intestino adulto podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo, fornecendo insights valiosos sobre a biologia celular e de desenvolvimento. Aqui, descrevemos em detalhes nosso protocolo atual para a dissecção de cérebros larvais de Drosophila, e então apresentamos nossa abordagem atual para imobilizar e orientar cérebros larvais e outros tecidos em uma mancha de vidro usando coágulos fibrinos. Este método de imobilização requer apenas a adição de Fibrinogen e Trombina ao meio da cultura. É adequado para imagens de lapso de tempo de alta resolução em microscópios invertidos de múltiplas amostras no mesmo prato de cultura, minimiza a deriva lateral frequentemente causada por movimentos do estágio microscópio em microscopia visitante de vários pontos e permite a adição e remoção de reagentes durante o curso da imagem. Também apresentamos macros personalizadas que usamos rotineiramente para corrigir para deriva e para extrair e processar informações quantitativas específicas a partir da análise de lapso de tempo.

Imobilização de tecidos de Drosophila com coágulos fibrinas e média de cultura de troca durante a imagem ao vivo. Após ser dissecado após o procedimento apresentado na etapa 2 (Figura 1) e imobilizado em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de cobertura após o procedimento apresentado na etapa 3 (Figura 2),cérebros larvais expressando Bazooka marcada por GFP (Baz::GFP), o ortolog de mosca da proteína polaridade Par-3, foram imageados por 30 minutos em imagens multi-posicionais de lapso de tempo. Baz::GFP é combinado com apkcas4, um alelo que permite a inibição aguda da proteína atípica quinase C (aPKC) através da adição do pequeno ATP analógico 1-NAPP120. 1-NAPP1 foi, portanto, adicionado ao meio cultural após o procedimento apresentado na etapa 4 e a imagem viva foi retomada por 2,5 h. Cérebros de controle que carregam uma versão selvagem do aPKC quinase não reagiram ao análogo ATP, enquanto cérebros portadores adicionalmente de uma mutação sensível a analógica de aPKC (apkcas4) exibiram uma contração do neuroepithelium e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua prole ( Figura6, Vídeo 1). Os neuroblastos continuam se dividindo ao longo do lapso de tempo, indicando que o tecido permanece saudável, e os cérebros mostram pouca deriva apesar da mudança média cultural, indicando que eles estão bem imobilizados. Da mesma forma, após serem dissecadas após o procedimento apresentado em27,os ovários expressando Baz::GFP foram imobilizados em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de tampas e imageados por 8 min, após o qual a aplicação de 1-NAPP1 induziu a contração de células foliculares mutantes apkcas4, mas não de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperstackReg. Um hipersoante exibindo deriva lateral e de foco(Vídeo 3, painel esquerdo) foi primeiro corrigido para deriva lateral (passo 6.2, Figura 3, Vídeo 3, painel médio), depois o drift de foco (passo 6.3, Figura 4, Vídeo 3, painel direito) usando o plugin MultiStRegack e a macro MultiHyperstackReg, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados no hiperstack original.
Medição de sinal cortical usando linhas rotativas Um neuroblasto expressando Baz::GFP (verde) e a proteína transmembrana CD4 marcada com uma proteína fluorescente infravermelha (CD4::mIFP, vermelho) foi imageado durante uma mitose. O sinal CD4::mIFP foi usado como referência para detectar o córtex em várias partes do neuroblasto com tubos de linha (etapa 7, Figura 5, Figura 8A-C) e o sinal Baz::GFP foi medido nas posições detectadas Figura 8D). Durante sua divisão, os neuroblastos se polarizaram transitoriamente estabelecendo domínios corticais distintos e opostos: o polo apical e o polo basal. Baz define o polo apical e, consistentemente, o sinal baz::GFP aumentou no polo apical do neuroblasto e diminuiu no polo basal durante a divisão (Figura 8C,D). A posição do córtex foi rastreada satisfatoriamente ao longo do lapso de tempo (Figura 8C, Vídeo 4). As linhas e genótipos de Drosophila são referenciados na Tabela Suplementar 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicação de um análogo ATP em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo. (A) Imagem ao vivo de dois cérebros larvais expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. Os cérebros de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do neuroepithelium (pontas de flecha) e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua descendência. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliação do neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicação de um análogo ATP em câmaras de ovos imobilizadas durante a imagem ao vivo. Imagem ao vivo de dois ovários expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. As câmaras de ovos de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto as câmaras de ovos que carregam uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do epitélio (pontas de flecha) eventualmente levando à aparente quebra das junções de aderentes. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 27 μM. Barra de escala: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medição do sinal cortical utilizando linhas rotativas. (A) Neuroblasto de D. melanogaster ao vivo expressando Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (vermelho). Linhas de ciano: linhas de varredura iniciais traçadas perpendicularmente para várias zonas corticais para medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificação do córtex (linha azul escuro) utilizando linhas corticais e CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Linha ciano: área definida pelo parâmetro "Medir ao redor" (aqui, 2 pixels), onde o sinal é medido após a detecção do córtex. Barra de escala: 2 μm. (C) Cyan: áreas corticais identificadas durante uma divisão de neuroblasto pelo método de linha rotativa das linhas de varredura iniciais exibidas em (A), usando CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Barra de escala: 5 μM. Seta: polo apical. Ponta de flecha: polo basal. (D) Medição da intensidade do sinal Baz::GFP ao longo do tempo nas duas zonas correspondentes identificadas por linhas rotativas exibidas em(C). Durante a mitose, Baz::GFP é transitoriamente enriquecido no polo apical do neuroblasto e é esgotado do polo basal oposto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicação de troca de mídia em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 6, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Aplicação de troca de mídia em câmaras de óvulos imobilizadas durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 7, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperStackReg. Imagem ao vivo de um neuroblasto expressando a sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Esquerda: antes da correção da deriva. Meio: após a correção da deriva lateral. Direito: após a correção lateral e o drift de foco, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 4: Detecção do córtex usando linhas rotativas, apresentadas na Figura 8, barra de escala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Tabela Suplementar 1: Genótipos de tecidos Drosophila imaged. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela Suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 3: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Este protocolo descreve aplicações de imobilização de amostras usando coágulos fibrinas, limitando a deriva e permitindo a adição e lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo. As amostras são transferidas para uma gota de Fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de um deslizamento de cobertura, após o qual a polimerização é induzida pela adição de trombina.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

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Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

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