Name: plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (KJQN202060)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31900907)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20190528)، والمركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (CRP/CHN20-04_EC) إلى M.C، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (LGZD202004) إلى X.L.

1 نمو النبات وجمع المواد
<ol><li>تأكد من تعقيم بذور الأرابيدوس في الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 10 دقائق وزرعها على أطباق أجار ، والتي تم إعدادها مع نصف قوة موراشيج والمواد المغذية سكوغ.</li>
	<li>احتضان لوحات تحتوي على بذور Arabidopsis تحت الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، ومن ثم نقلها إلى غرفة الن...

<ol>
	<li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Gro&#223;hans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control.">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li><li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants.">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li><li>Witte, C. -. P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+metabolism+in+plants.">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li><li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis,+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo.">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells.">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li><li>Chen, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation.">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li><li>Dahncke, K., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis.">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li><li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis.">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li><li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines.">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li><li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation.">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li><li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis.">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+nucleosides,+nucleobases,+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry.">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li><li>Zong, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS/MS.">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li><li>Moravcov&#225;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+nucleobases,+nucleosides,+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides,+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants.">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li><li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li><li>Baccolini, C., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine,+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex.">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li></ol>

تحتوي الكائنات الحية على العديد من النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات ، بما في ذلك تلك الكنسية والانحرافات. ومع ذلك ، فإن أصلها ونقاط النهاية الأيضية منها ، وخاصة النيوكليوسيدات المعدلة ، لا تزال غامضة. وعلاوة على ذلك، فإن الفهم الحالي لوظيفة وهوتوستاسيس من التمثيل الغذائي للنيوكليوسيدات/ا...

النيوكليوسيدات/ النيوكليوتيدات هي مكونات التمثيل الغذائي المركزية في جميع الكائنات الحية، والتي هي سلائف للأحماض النووية والعديد من الأنزيمات، مثل النيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD)، ومهمة في تركيب الجزيئات الكبيرة مثل فوسفوليبيدس، الجليكوليبيدات، والسكريات. هيكليا، النيوكليوسيد يحتوي على نواة، والتي يمكن أن تكون أدينين، جوانين، أوراسيل، السيتوزين، أو الثيمين، وموسيتي السكر، والتي يمكن أن تكون الريبوز أو ديوكسيريبوز1،2. النيوكليوتيدات لديها ما يصل إلى ثلاث مجموعات فوسفات ملزمة لموقف 5 الكربون من moiety السكر من النيوكليوسيدات3. التمثيل الغذائي للنيوكليوتيدات في النباتات أمر ضروري لإنبات البذور ونمو الأوراق4،5،6. لفهم أفضل أدوارها الفسيولوجية في تطوير النبات، ينبغي أن تنشأ أساليب القياس الكمي المطلق للنيوكليوسيدات المختلفة / النيوكليوتيدات في الجسم الحي.
واحدة من النهج الأكثر استخداما لقياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات توظف الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى جانب الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية-VIS) كاشف4،7،8،9،10،11. في عام 2013، باستخدام HPLC، Dahncke وويت كميا عدة أنواع من النيوكليوسيدات في Arabidopsis thaliana7. وحددوا محتوى معززا من الجوانوزين في عملية استهداف متحولة لإدراج الحمض النووي في جين جوانوسين ديموناسي مقارنة بالنبات البري. كما تم الكشف عن نواة بيريميدين أخرى، وهي السيتيدين، كميا في النباتات التي تستخدم هذه الطريقة، مما أدى إلى تحديد جين الدياميناسي السيتيدين حسن النية 4. واستنادا إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية، لا يمكن لهذه الطريقة أن تميز بسهولة بين النيوكليوسيدات التي لها أطياف وأوقات استبقاء مماثلة، مثل الجوانوزين أو زانثوسين. الحد الأقصى للكشف عن طريقة HPLC مرتفع نسبيا ، لذلك ، فإنه يستخدم بشكل متكرر لقياس المحتوى العالي من النيوكليوسيدات في الجسم الحي ، مثل السيتيدين ، أوريدين ، وغوانوزين.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS) في قياس النيوكليوسيد. الاستفادة منه، هاك وآخرون. al. اكتشف بنجاح uridine وحمض اليوريك، وهو المستقلب المصب من مسار تقويضي نيوكليوسيد، في بذور A. الثاليانا12. ومع ذلك، يستخدم عادة GC لفصل المركبات المتطايرة ولكن ليست مناسبة للمواد labile حراريا. لذلك ، فإن الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) هي على الأرجح تقنية تحليلية أكثر ملاءمة ودقة لتحديد النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات13،14. وأفادت عدة دراسات سابقة أن عمود HILIC يمكن استخدامها لفصل النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات15،16 والمعايير الداخلية وصفت نظائرها استخدمت للقياس الكمي المركب17. ومع ذلك، فإن كلا العنصرين مكلفان نسبيا، ولا سيما المعايير التجارية المسماة بالنظائر. هنا، نبلغ عن نهج LC-MS/MS القابل للتطبيق اقتصاديا لقياس النيوكليوسيدات/النيوكليوتيدات. وقد تم بالفعل استخدام هذه الطريقة بنجاح لكمية من النيوكليوسيدات المتنوعة / النيوكليوتيدات، بما في ذلك ATP، N6-ميثيل أمبير، AMP، GMP، uridine، السيتيدين، وswswuridine1،5،6،18، في النباتات وDrosophila. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطريقة التي نبلغ عنها هنا في كائنات حية أخرى أيضا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73594-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>01930-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C122106-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6752-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>35005-054630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4125-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methyladenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM03697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O6-methylguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM02922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Medium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0255.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18A column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>A2000050X046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudouridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NP11297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms

النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات هي لبنات بناء الأحماض النووية ، وأجزاء من الكوسوبسترات والإنزيمات ، وجزيئات إشارات الخلايا ، وحاملات الطاقة ، والتي تشارك في العديد من أنشطة الخلايا. هنا، ونحن نصف طريقة سريعة وموثوق بها للتأهيل المطلق لمحتويات النيوكليوسيد / النيوكليوتيدات في النباتات. لفترة وجيزة، تم استخراج 100 ملغ من المواد النباتية المتجانسة مع 1 مل من العازلة استخراج (الميثانول، أسيتونيتريل، والمياه بنسبة 2:2:1). وفي وقت لاحق، تركزت العينة خمس مرات في مجفف تجميد ثم حقنت في أحد أعمدة النيوكليوتيدات HPLC-MS/MS. وتم فصلها على عمود كربون جرافيتي مسامي (PGC) وتم فصل النيوكليوسيدات على عمود C18. ورصدت التحولات الجماعية لكل نيوكليوسيد ونوكليوتيد عن طريق قياس الطيف الكتلي. تم قياس محتويات النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات كميا وفقا لمعاييرها الخارجية (ESTDs). باستخدام هذه الطريقة، لذلك، يمكن للباحثين بسهولة قياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات في النباتات المختلفة.

هنا، نعرض تحديد وتحديد كمي من N1-methyladenosine، وهو نوكليوسيد معدلة معروفة، في نوع البرية Arabidopsis 2-old (كول-0) الشتلات كمثال. يشير ملف قياس الطيف الكتلي إلى أن أيونات المنتج المتولدة من معيار N1-methyladenosine هي 150 م/ض و 133 م/ض(الشكل 2A)،ويلاحظ نفس الملف الشخص...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS at JoVE.com

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

ويرد هنا وصف لطريقة دقيقة وقابلة للاستنساخ في النيوكليوسيدات الحية/النيوكليوتيدات في النباتات. يستخدم هذا الأسلوب HPLC-MS/MS.

إعداد عينة النبات لقياس محتوى النيوكليوسيد/النيوكليوتيدات باستخدام جهاز HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات هي المكونات الأيضية المركزية في جميع الكائنات الحية. عملية التمثيل الغذائي لهم مطلوب لتطوير الخلايا. يوفر هذا النهج أداة قوية لهذه الأيض 'كمي.تسمح هذه الطريقة بالتحديد الكمي السريع والدقيق للنيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات في النباتات. تستغرق عمليات المعالجة المسبقة الكاملة للعينات وتحليلات LC-MS/MS حوالي يومين لمجموعة من 10 إلى 20 عينة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على جميع النباتات وحتى الكائنات الحية الأخرى.وسوف يظهر هذا الاجراء تشانغهوا تشو الاستاذ المشارك من مختبر تشن . لزراعة النباتات، تأكد من أن بذور أرابيدوسي يتم تعقيمها في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقائق وزرعها على لوحات أجار مع 1/2 قوة موراشيج والمواد المغذية سكوغ. احتضان لوحات في الظلام في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة، ثم نقلها إلى غرفة النمو التي تسيطر عليها تحت 16 ساعة من الضوء في 22 درجة مئوية وثماني ساعات من الظلام في 20 درجة مئوية.حصاد 100 ملليغرام من الشتلات لمدة أسبوعين وتجميدها في النيتروجين السائل لاستخراج المستقلب. طحن 100 ملليغرام من الأنسجة النباتية المجمدة مع سبعة إلى ثمانية حبات الصلب في مطحنة خلاط المبردة مسبقا لمدة خمس دقائق على تردد 60 هيرتز. إعداد محلول الاستخراج، الذي يحتوي على الميثانول، أستونيتريل، والماء بنسبة اثنين إلى اثنين إلى واحد.إعادة إنفاق المواد المتجانسة مع ملليلتر واحد من محلول الاستخراج. الطرد المركزي الحل الناتج في 12,000 XG لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية, ثم نقل 0.5 ملليلتر من تعليق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وتجميده في النيتروجين السائل. تتبخر العينة المجمدة في مجفف تجميد وإعادة إنفاقه في 0.5 ملليلتر من 5٪ أسيتونيتريل و 95٪ماء.الطرد المركزي الحل الناتج في 4، 000 XG لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تحميل supernatant في قارورة لقياس LC-MS / MS. إعداد خلات الأمونيوم 10 ملليمولار العازلة عن طريق حل 1.5 غرام من خلات الأمونيوم في لترين من الماء المزدوج deionized.ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع 10٪ من حمض الأمونيوم وخلات. إعداد لترين من الميثانول فائقة 100٪ لقياس النيوكليوسيدات، ثم إعداد لترين من أستونيتريل فائقة البوري لقياس النيوكليوتيدات. حقن 0.02 ملليلتر من استخراج المستقلب المعالجة مسبقا من كل عينة أعدت سابقا في نظام HPLC مع مضخات ثنائية مقرونة مطياف الكتلة رباعية ثلاثية.لتوليد منحنيات المعايرة القياسية، تجمع ستة استخراج عينة معا ودوامة الخليط، ثم aliquot إلى ستة استخراج مرة أخرى للحصول على كل خلفية. إضافة ستة تركيزات مختلفة من كل معيار لهذه الاستخراجات الستة على التوالي وحقنها واحدا تلو الآخر في نظام HPLC. سجل مناطق الذروة لكل معيار بتركيزات مختلفة عبر التحولات الجماعية.وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد وتحديد كميا N1-ميثيلادينوسين، وهو نواة معدلة معروفة، في شتلات من نوع أرابيدوسيس عمرها أسبوعان. وأشار ملف قياس الطيف الكتلي إلى أن أيونات المنتجات المتولدة من معيار N1-methyladenosine هي في نسب 150 و 133 MZ. ولوحظ نفس الملف في استخراج صفر كولومبيا.ونظرا لارتفاع وفرة أيون المنتج من 150 MZ، تم اختيار الانتقال الشامل من 282.1 إلى 150 لتحديد N1-ميثيلادنوسين. وكان وقت الاحتفاظ بالذروة المستهدفة 7.05 دقيقة. نفس وقت الاحتفاظ بمعيار N1-ميثيلادينوسين.وأضيفت سلسلة تركيز من معايير N1-methyladenosine إلى ستة استخراج عينة. وقد حقنت العينات المعيارية في ال LC-MS/MS، ورسمت مناطق الذروة المتزايدة من N1-methyladenosine مقابل التركيزات الاسمية للمعايير. تعتبر عمليات استخراج الخلفية الستة المتساوية مهمة لصنع منحنى معايرة دقيق وقابل للتكرار للقياس الكمي.يمكن تطبيق طريقتنا لاستكشاف مسارات التمثيل الغذائي في النباتات. من خلال مقارنة ملامح المستقلب بين البرية من نوع وفقدان وظيفة المسوخ، يمكن رسمها تدفق الأيض.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

دراسات الارتباط واسعة النطاق متعددة الأوميكس على نطاق الجينوم (Mo-GWAS): مبادئ توجيهية لإعداد العينات وتطبيعها

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...