Name: plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00
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この研究は、中央大学基礎研究基金(KJQN202060)、中国国立自然科学財団(31900907)、江蘇省自然科学財団(BK20190528)、国際遺伝子工学・バイオテクノロジーセンター(CRP/CHN20-04_EC)によって財政的に支援されました.C。 中央大学のための基礎研究資金 (LGZD202004) X.L.

1 植物の成長と材料の収集
<ol><li>シロイヌナズナの種子を70%エタノールで10分間殺菌し、半強のムラシゲとスクーグの栄養素で調製した寒天プレートに播種することを確認してください。</li>
	<li>4°Cで48時間暗い下で シロイヌナズナの 種子を含むプレートをインキュベートし、22°Cで55 μmolm-2 s-1 の16時間光の下で制御された成長室に移し、20°Cで8時間暗くします...

<ol>
	<li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Gro&#223;hans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control.">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li><li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants.">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li><li>Witte, C. -. P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+metabolism+in+plants.">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li><li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis,+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo.">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells.">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li><li>Chen, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation.">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li><li>Dahncke, K., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis.">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li><li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis.">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li><li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines.">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li><li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation.">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li><li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis.">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+nucleosides,+nucleobases,+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry.">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li><li>Zong, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS/MS.">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li><li>Moravcov&#225;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+nucleobases,+nucleosides,+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides,+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants.">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li><li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li><li>Baccolini, C., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine,+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex.">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li></ol>

生物には、カノニカルおよび異常なものを含む様々なヌクレオシド/ヌクレオチドが含まれています。しかし、それらの起源および代謝エンドポイント、特に修飾されたヌクレオシドは、依然として不明瞭である。さらに、ヌクレオシド/ヌクレオチド代謝の機能とホメオスタシスの現在の理解は、探求され、拡大する必要があります。それらを調査するには、これらの代謝産物の同定と定量?...

ヌクレオシド/ヌクレオチドは、すべての生物の中心的な代謝成分であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)などの核酸および多くの補酵素の前駆体であり、リン脂質、糖脂質、多糖類などの高分子の合成において重要です。構造的には、ヌクレオシドは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、またはチミンであり得るヌクレオベースと、リボースまたはデオキシリボース1、2であり得る糖部分を含む。ヌクレオチドは、ヌクレオシド3の糖部分の5炭素位に結合する最大3つのリン酸基を有する。植物のヌクレオチドの代謝は、種子の発芽と葉の成長4、5、6に不可欠です。植物の開発における生理学的役割をよりよく理解するために、生体内の異なるヌクレオシド/ヌクレオチドの絶対定量化方法を確立する必要があります。
ヌクレオシド/ヌクレオチドを測定するための最も一般的に使用されるアプローチの1つは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、紫外線可視(UV-VIS)検出器4、7、8、9、10、11を用いる。2013年、HPLCを用いて、ダーンケとウィッテは、シロイヌナズナのヌクレオシドの数種類を定量化した7.彼らは、野生型植物と比較して、グアノシン・デアミネーゼ遺伝子におけるT-DNA挿入変異体標的化におけるグアノシン含有量の増強を同定した。別のピリミジンヌクレオシド、シチジン、また、この方法を採用した植物において定量的に検出され、その結果、ボナフィデスシチジンデアミネーザーゼ遺伝子4の同定を行った。しかし、UV検出器に基づいて、この方法は、類似スペクトルおよび保持時間を有するヌクレオシドを容易に区別することができない、例えば、グアノシンまたはキサントシン。HPLC法の検出限界は比較的高く、従って、シチジン、ウリジン、グアノシンなどの生体内のヌクレオシドの高含量の測定に頻繁に使用される。
また、質量分析(GC-MS)に結合したガスクロマトグラフィーもヌクレオシド測定に使用できる。それから恩恵を受け、ハウクら。Al. A. thaliana12の種子中で、ヌクレオシドの同化経路の下流代謝産物であるウリジンおよび尿酸を正常に検出した。しかし、GCは通常、揮発性化合物を分離するために使用されるが、熱不安定な物質には適していない。したがって、質量分析(LC-MS/MS)に結合した液体クロマトグラフィーは、ヌクレオシド/ヌクレオチド13,14のインビボ同定、分離、定量化に対して、より適した正確な分析技術である可能性が高い。いくつかの以前の研究では、HILICカラムがヌクレオシドおよびヌクレオチド分離に使用され得る、15、16および同位体標識内部標準が化合物定量17のために採用されたことを報告した。しかし、両方のコンポーネントは比較的高価であり、特に商業的同位体標識規格である。ここでは、ヌクレオシド/ヌクレオチド測定に経済的に適用可能なLC-MS/MSアプローチについて報告する。この方法は、ATP、N6-メチル AMP、AMP、GMP、ウリジン、シチジン、および植物およびショウジョウバエにおけるシュードリジン1、5、6、18を含む多様なヌクレオシド/ヌクレオチドの定量に既に成功して使用されています。また、ここで報告する方法は、他の生物でも使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73594-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>01930-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C122106-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6752-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>35005-054630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4125-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methyladenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM03697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O6-methylguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM02922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Medium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0255.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18A column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>A2000050X046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudouridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NP11297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms

ヌクレオシド/ヌクレオチドは、核酸、共基質および補酵素の一部、細胞シグナル伝達分子、およびエネルギーキャリアの構成要素であり、多くの細胞活動に関与している。ここでは、植物におけるヌクレオシド/ヌクレオチド含量の絶対修飾のための迅速かつ信頼性の高い方法について述べます。簡単に言えば、100mgの均質化植物材料を1mLの抽出緩衝液(メタノール、アセトニトリル、及び水の比率2:2:1)で抽出した。その後、試料を凍結乾燥機に5回濃縮し、HPLC-MS/MSに注入し、多孔質黒鉛炭素(PGC)カラム上でヌクレオチドを分離し、ヌクレオシドをC18カラム上で分離した。各ヌクレオシドおよびヌクレオチドの質量遷移を質量分析法によりモニタリングした。ヌクレオシドおよびヌクレオチドの内容物を、その外部標準(ESTD)に対して定量した。したがって、この方法を使用すると、研究者は異なる植物のヌクレオシド/ヌクレオチドを簡単に定量することができます。

ここでは、2週齢のシロイヌナズナ科野生型(Col-0)の苗木における既知の修飾ヌクレオシドであるN1-メチルアデノシンの同定と定量を例に示す。質量分析プロファイルは、N1-メチルアデノシン標準から生成された生成イオンが150 m/zおよび133 m/z(図2A)であり、Col-0抽出においても同じプロファイルが観察されることを示す(<strong...

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Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

インビボヌクレオシド/ヌクレオチドの植物定量の正確かつ再現可能な方法をここに記載する。この方法では、HPLC-MS/MS を採用しています。

HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

ヌクレオシドとヌクレオチドは、すべての生物の中心的な代謝成分です。それらの代謝は細胞の発達に必要です。このアプローチは、これらの代謝産物の定量化のための強力なツールを提供します。この方法は、植物のヌクレオシドおよびヌクレオチドの迅速かつ正確な定量を可能にする。完全なサンプル前処理とLC-MS/MS分析は、10〜20サンプルのセットに約2日かかります。この方法は、すべての植物および他の生物にも適用することができる。この手順のデモンストレーションは、陳研究室のチャンフア・ジュー准教授です。植物を育てるには、シロイヌナズナの種子を10分間エタノールで殺菌し、1/2の強度の村重とスクーグの栄養素を含む寒天プレートに播種することを確認してください。48時間摂氏4度で暗闇の中でプレートをインキュベートし、摂氏22度で16時間光、摂氏20度で8時間暗い下の制御された成長室に移します。2週間の苗の100ミリグラムを収穫し、代謝物抽出のために液体窒素でそれらを凍結します。冷却済みのミキサーミルで7~8個のスチールビーズを使用して、冷凍植物組織の100ミリグラムを60ヘルツの頻度で5分間粉砕します。メタノール、アセトニトリル、水を含む抽出液を2対2対1の比率で調製します。均質化した材料を1ミリリットルの抽出液で再懸濁する。得られた溶液を摂氏4度で15分間15分間12,000 XGで遠心分離し、懸濁液の0.5ミリリットルを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、液体窒素で凍結します。凍結したサンプルを凍結乾燥機で蒸発させ、0.5ミリリットルの5%アセトニトリルと95%水で再懸濁します。得られた溶液を摂氏4度で10分間4,000 XGで遠心分離する。上清をバイアルにロードしてLC-MS/MS測定を行います。酢酸アンモニウム10ミリモルを2リットルの二重脱イオン水に溶解して、酢酸アンモニウムバッファーを調製します。10%アンモニウムと酢酸でpHを9.5に調整してください。ヌクレオシド測定用に2リットルの超純粋な100%メタノールを調製し、次いでヌクレオチド測定用に2リットルの超純粋アセトニトリルを調製する。前に調製した各サンプルの前処理された代謝物抽出の0.02ミリリットルを、3倍の質量分析計と結合したバイナリポンプを備えたHPLCシステムに注入します。標準のキャリブレーション曲線を生成するには、6つのサンプル抽出を一緒にプールし、混合物を渦に入れ、それを再び6回抽出して各背景を得る。これらの6つの抽出にそれぞれ6つの異なる濃度の各標準を加え、それらをHPLCシステムに1つずつ注入します。質量遷移を介して異なる濃度で各標準のピーク領域を記録します。このプロトコルは、2週間前のシロイヌナズナの野生型苗のN1-メチルデノシン(既知の修飾ヌクレオシド)を同定し、定量化するために使用された。質量分析プロファイルは、N1-メチルアデノシン標準から生成された生成イオンが150および133MZ比であることを示した。そして、同じプロファイルは、コロンビアのゼロ抽出で観察されました.150MZの生成イオンの豊富さにより、N1-メチルアデノシン同定のために282.1から150の質量転移が選択された。目標ピークの保持時間は7.05分であった。N1-メチルデノシン標準の保持時間と同じ.濃度シリーズのN1-メチルアデノシン標準は、6つのサンプル抽出に追加されました.標準サンプルをLC-MS/MSに注入し、N1-メチルアデノシンのピーク領域の増加を公称濃度に対してプロットした。6つの等しい背景抽出は、定量化のために正確で再現可能な較正曲線を作る上で重要です。我々の方法は、植物の代謝経路を探索するために適用することができる。野生型と機能喪失変異体の代謝産物プロファイルを比較することで、代謝フラックスを引き出すことができた。

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