Name: plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS at JoVE.com

이 작품은 중앙 대학 (KJQN202060), 중국 국립 자연 과학 재단 (31900907), 장쑤성의 자연 과학 재단 (BK20190528), 유전자 공학 및 생명 공학 국제 센터 (CRP / CHN20-04_EC.C) 및 중앙 대학 (LZ20)의 기초 연구 기금 (LZ20)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

1 식물 성장 및 재료 수집
<ol><li>아라비도시스 씨앗을 70% 에탄올로 살균하고 1반강도 무라시게와 스쿠그 영양소로 제조된 한천 접시에 뿌려야 합니다.</li>
	<li>48h에 대해 4°C에서 어둡게 아라비도시스 씨앗을 함유한 플레이트를 배양한 다음, 22°C에서 55 μmolm-2 s-1의 16h 빛 아래 제어된 성장 챔버로 옮기고 20°C에서 8시간 어둡게 옮깁니다.</li>
	<li>2주 묘목 100mg(신선한 ?...

<ol>
	<li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Gro&#223;hans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control.">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li><li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants.">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li><li>Witte, C. -. P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+metabolism+in+plants.">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li><li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis,+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo.">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells.">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li><li>Chen, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation.">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li><li>Dahncke, K., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis.">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li><li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis.">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li><li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines.">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li><li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation.">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li><li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis.">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+nucleosides,+nucleobases,+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry.">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li><li>Zong, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS/MS.">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li><li>Moravcov&#225;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+nucleobases,+nucleosides,+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides,+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants.">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li><li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li><li>Baccolini, C., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine,+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex.">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li></ol>

유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법?...

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기4,7,8,9,10,11과결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.
또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드분리(15,16) 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73594-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>01930-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C122106-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6752-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>35005-054630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4125-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methyladenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM03697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O6-methylguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM02922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Medium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0255.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18A column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>A2000050X046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudouridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NP11297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

여기서, 우리는 2주 된 아라비도시스 야생 형 (Col-0) 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N1-메틸라데로신의 식별 및 정량화를 예로 들 수 있습니다. 질량 분석 프로파일은 N 1-메틸라데로신 표준으로부터 생성된 제품 이온이 150m/z 및 133m/z(도2A)이며동일한 프로파일도 Col-0 추출(도2B)에서관찰된다는 것을 나타?...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS at JoVE.com

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.

HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

뉴클레오시드와 뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 구성 요소입니다. 그(것)들의 물질 대사는 세포 발달을 위해 요구됩니다. 이 방법은 이러한 대사 산물의 정량화를 위한 강력한 도구를 제공합니다.이 방법은 식물에서 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 신속하고 정확한 정량화를 허용한다. 완전한 샘플 사전 처리 및 LC-MS/MS 분석은 10~20개의 샘플 세트에 약 2일이 소요됩니다. 이 방법은 모든 식물과 다른 유기체에도 적용 될 수있다.절차를 시연하는 것은 첸 연구소의 부교수인 창화 주(Changhua Zhu)가 될 것입니다. 식물을 재배하려면 아라비도시스 씨앗을 70%에탄올로 살균하여 1/2 강도의 무라시게와 스쿠그 영양소로 한천 접시에 뿌려야 합니다. 48시간 동안 어둠 속에서 판을 배양한 다음 섭씨 22도에서 16시간 이하의 통제된 성장챔버로 옮기고, 섭씨 20도에서 8시간 동안 어두워집니다.2주 모종의 100밀리그램을 수확하고 대사산물 추출을 위해 액체 질소로 동결하십시오. 60 Hertz의 주파수에서 5 분 동안 사전 냉각 믹서 밀에 7 ~ 8 개의 강철 구슬로 냉동 식물 조직의 100 밀리그램을 분쇄하십시오. 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 2대 2대 1의 비율로 포함하는 추출 용액을 준비합니다.추출 용액의 1 밀리리터로 균질화된 물질을 다시 중단합니다. 결과용 액액을 섭씨 4도에서 12, 000 XG에서 15분 동안 원심분리한 다음, 서스펜션0.5 밀리리터를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 액체 질소로 동결합니다. 냉동 건조기에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 %의 아세토나이트와 95 %의 물로 0.5 밀리리터로 재보힙합니다.4, 000 XG에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 바이알에 적재합니다. 10 밀리머라 암모늄 아세테이트 버퍼를 2리터의 이중 분해수에 1.5그램의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 준비합니다.10%의 암모늄과 아세테이트산으로 pH를 9.5로 조정합니다. 뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올 2리터를 준비한 다음 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 아세토나이트 2리터를 준비합니다. 이전에 준비된 각 시료의 전처리된 대사산물 추출에 대해 0.02 밀리리터를 트리플 쿼드러플 질량 분광계와 결합한 이진 펌프를 HPLC 시스템에 주입합니다.표준 교정 곡선을 생성하려면 6개의 샘플 추출을 함께 풀링하고 혼합물을 소용돌이쳐 낸 다음, 각 배경을 얻기 위해 6개의 추출에 다시 알리쿼트합니다. 각 표준의 6가지 농도를 각각 6개의 추출에 추가하고 HPLC 시스템에 하나씩 주입합니다. 질량 전환을 통해 각 표준의 피크 영역을 서로 다른 농도로 기록합니다.이 프로토콜은 2주 된 아라비도시스 야생 형 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N1-메틸라데로신을 식별하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 질량 분석 프로파일은 N1-메틸라데로신 표준에서 생성된 제품 이온이 150 및 133 MZ 비율임을 나타냈다. 그리고 콜롬비아 제로 추출에서 동일한 프로파일이 관찰되었습니다.150MZ의 제품 이온이 풍부하기 때문에 N1-메틸라데노사인 식별을 위해 282.1에서 150의 대량 전환이 선택되었습니다. 목표 피크의 보존 시간은 7.05분이었습니다. N1-메틸라데노신 표준의 보존 시간과 동일합니다.N1-메틸라데노신 표준의 농도 시리즈는 6개의 견본 추출에 추가되었습니다. 표준 샘플은 LC-MS/MS에 주입되었고 N1-메틸라데로신의 피크 영역이 증가하여 표준의 명목 농도에 대해 플롯되었습니다. 6개의 동일한 배경 추출은 정량화를 위해 정확하고 반복 가능한 교정 곡선을 만드는 데 중요합니다.우리의 방법은 식물의 신진 대사 경로를 탐구하기 위해 적용 할 수 있습니다. 야생 형 과 기능 상실 돌연변이 사이의 대사 산물 프로파일을 비교함으로써 신진 대사 플럭스를 그릴 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Cyanobacterium Synechocystis 에서 Phycobiliprotein 콘텐츠 결정

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...