Name: plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (KJQN202060), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900907), a Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20190528), o Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia (CRP/CHN20-04_EC) para M.C., e os Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (LGZD202004) para X.L.

1 Crescimento de plantas e coleta de materiais
<ol><li>Certifique-se de que as sementes arabidopsis sejam esterilizadas em 70% de etanol por 10 minutos e semeadas nas placas de ágar, que foram preparadas com nutrientes Murashige e Skoog de meia-resistência.</li>
	<li>Incubar as placas contendo sementes arabidopsis sob escuras a 4 °C por 48 h, e depois transferi-las para uma câmara de crescimento controlada sob luz de 16 h de luz de 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C e 8h escuras a 20 ...

<ol>
	<li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Gro&#223;hans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control.">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li><li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants.">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li><li>Witte, C. -. P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+metabolism+in+plants.">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li><li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis,+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo.">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells.">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li><li>Chen, M., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation.">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li><li>Dahncke, K., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis.">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li><li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis.">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li><li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines.">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li><li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation.">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li><li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis.">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li><li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance.">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li><li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+nucleosides,+nucleobases,+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry.">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li><li>Zong, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS/MS.">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li><li>Moravcov&#225;, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+nucleobases,+nucleosides,+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry.">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides,+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants.">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li><li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li><li>Baccolini, C., Witte, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine,+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex.">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li></ol>

Os organismos contêm vários nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo os canônicos e aberrantes. No entanto, a origem e os pontos finais metabólicos deles, especialmente os nucleosídeos modificados, ainda são obscuros. Além disso, o entendimento atual da função e da homeostase do metabolismo nucleosídeos/nucleotídeos continua a ser explorado e expandido. Para investigá-los, é necessário utilizar um método preciso e padrão-ouro para esses metabólitos de identificação e quantificação. Aqui, descrevemos um...

Nucleosídeos/Nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos, que são os precursores de ácidos nucleicos e muitos coenzymes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), e importante na síntese de macromoléculas como fosfolipídios, glicólipídios e polissacarídeos. Estruturalmente, o nucleosídeo contém uma nucleobase, que pode ser uma adenina, guanina, uracil, citosina ou timina, e um moiety de açúcar, que pode ser uma ribose ou uma desoxiribose1,2. Os nucleotídeos têm até três grupos fosfatos ligados à posição de 5 carbonos da moiety açucarada dos nucleosídeos3. O metabolismo dos nucleotídeos nas plantas é essencial para a germinação de sementes e o crescimento da folha4,5,6. Para entender melhor seus papéis fisiológicos no desenvolvimento das plantas, devem ser estabelecidos os métodos para a quantificação absoluta de diferentes nucleosídeos/nucleotídeos in vivo.
Uma das abordagens mais utilizadas para medir nucleosídeos/nucleotídeos emprega uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) juntamente com um detector ultravioleta visível (UV-VIS)detector 4,7,8,9,10,11. Em 2013, usando HPLC, Dahncke e Witte quantificaram vários tipos de nucleosídeos em Arabidopsis thaliana7. Eles identificaram um conteúdo melhorado de guanosina em um mutante de inserção T-DNA no gene guanosina deaminase em comparação com a planta do tipo selvagem. Outro nucleosídeo pirimidina, o citidina, também foi detectado quantitativamente nas plantas que empregam esse método, o que resultou na identificação de um gene deaminase de citidina de boa fé 4. Com base no detector UV, este método, no entanto, não pode distinguir facilmente os nucleosídeos que têm espectros e tempos de retenção semelhantes, por exemplo, guanosina ou xanthosina. O limite de detecção do método HPLC é relativamente alto, portanto, é frequentemente utilizado para a medição de alto teor de nucleosídeos in vivo, como citidina, uridina e guanosina.
Além disso, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) também pode ser usada na medição nucleosídea. Beneficiando-se disso, Hauck et. al. detectou com sucesso uridina e ácido úrico, que é um metabólito a jusante da via catabólica nucleosídeo, nas sementes de A. thaliana12. No entanto, o GC é normalmente usado para separar compostos voláteis, mas não é adequado para as substâncias termicamente labile. Portanto, uma cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) é provavelmente uma técnica analítica mais adequada e precisa para a identificação in vivo, separação e quantificação dos nucleosídeos/nucleotídeos13,14. Vários estudos anteriores relataram que uma coluna HILIC pode ser usada para a separação de nucleosídeos e nucleotídeos15,16 e padrões internos isotopicamente rotulados foram empregados para a quantificação composta17. No entanto, ambos os componentes são relativamente caros, especialmente os padrões comerciais rotulados de isótopos. Aqui, relatamos uma abordagem LC-MS/MS economicamente aplicável para medição de nucleosídeos/nucleotídeos. Este método já foi utilizado com sucesso para a quantitação de diversos nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, em plantas e Drosophila. Além disso, o método que relatamos aqui também pode ser usado em outros organismos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1000291000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9251-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73594-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>01930-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1006-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C122106-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8377-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6752-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>35005-054630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4125-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methyladenosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM03697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O6-methylguanosine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NM02922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Medium</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0255.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaris 5 C18A column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>A2000050X046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudouridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NP11297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant sample preparation for nucleoside/nucleotide content measurement with an hplc-ms/ms

Nucleosídeos/nucleotídeos são blocos de construção de ácidos nucleicos, partes de cosubstrates e coenzimas, moléculas de sinalização celular e portadores de energia, que estão envolvidos em muitas atividades celulares. Aqui, descrevemos um método rápido e confiável para a qualificação absoluta do conteúdo nucleosídeo/nucleotídeo nas plantas. Resumidamente, 100 mg de material vegetal homogeneizado foram extraídos com 1 mL de tampão de extração (metanol, acetonitrilo e água a uma razão de 2:2:1). Mais tarde, a amostra foi concentrada cinco vezes em um secador congelado e, em seguida, injetada em um HPLC-MS/MS. Nucleotídeos foram separados em uma coluna de carbono grafitado poroso (PGC) e nucleosídeos foram separados em uma coluna C18. As transições em massa de cada nucleosídeo e nucleotídeo foram monitoradas pela espectrometria de massa. O conteúdo dos nucleosídeos e nucleotídeos foram quantificados em relação aos seus padrões externos (ESTDs). Usando este método, portanto, os pesquisadores podem facilmente quantificar nucleosídeos/nucleotídeos em diferentes plantas.

Aqui, mostramos a identificação e quantificação da N1-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas silvestres arabidopsis de 2 semanas de idade (Col-0) como exemplo. O perfil de espectrometria de massa indica que os íons do produto gerados a partir do padrão N1-metiladenosina são de 150 m/z e 133 m/z (Figura 2A),e o mesmo perfil também é observado na extração Col-0(Figura 2B</str...

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Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.

Preparação da amostra de plantas para medição de conteúdo nucleoídeo/nucleotídeo com hplc-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nucleosídeos e nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos. O metabolismo deles é necessário para o desenvolvimento celular. Esta abordagem fornece uma ferramenta poderosa para a quantificação desses metabólitos.Este método permite quantificação rápida e precisa de nucleosídeos e nucleotídeos nas plantas. Os pré-tratamentos completos da amostra e as análises de LC-MS/MS levam cerca de dois dias para um conjunto de 10 a 20 amostras. Este método pode ser aplicado a todas as plantas e até mesmo a outros organismos.Demonstrando o procedimento estará Changhua Zhu, professor associado do Laboratório de Chen. Para cultivar as plantas, certifique-se de que as sementes arabidopsis sejam esterilizadas em 70% de etanol por 10 minutos e semeadas em placas de ágar com 1/2 de resistência murashige e nutrientes Skoog. Incubar as placas no escuro a quatro graus Celsius por 48 horas, depois transferi-las para uma câmara de crescimento controlada sob 16 horas de luz a 22 graus Celsius e oito horas de escuridão a 20 graus Celsius.Colher 100 miligramas de mudas de duas semanas e congelá-las em nitrogênio líquido para extração metabólito. Triture 100 miligramas de tecidos vegetais congelados com sete a oito contas de aço em um moinho de mistura pré-resfriado por cinco minutos em uma frequência de 60 Hertz. Prepare a solução de extração, que contém metanol, acetonitrilo e água em uma proporção de dois para dois para um.Resuspense os materiais homogeneizados com um mililitro da solução de extração. Centrifugar a solução resultante a 12.000 XG por 15 minutos a quatro graus Celsius, em seguida, transferir 0,5 mililitros da suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro e congelá-lo em nitrogênio líquido. Evaporar a amostra congelada em um secador congelado e resuspensá-la em 0,5 mililitro de 5% de acetonitrilo e 95% de água.Centrifugar a solução resultante a 4.000 XG por 10 minutos a quatro graus Celsius. Carregue o supernatante em um frasco para a medição LC-MS/MS. Prepare um tampão de acetato de amônio de 10 milimônios dissolvendo 1,5 gramas de acetato de amônio em dois litros de água desionizada dupla.Ajuste o pH para 9,5 com 10% de amônio e ácido acetato. Prepare dois litros de ultrapure 100% metanol para medição de nucleosídeos e prepare dois litros de acetonitrilo ultrapura para medição de nucleotídeos. Injete 0,02 mililitros da extração metabólito pré-tratada de cada amostra previamente preparada em um sistema HPLC com bombas binárias acopladas a um espectrômetro de massa quádruplo triplo.Para gerar as curvas de calibração padrão, acumule seis extrações de amostra juntas e o vórtice da mistura, em seguida, aliquot-lo para seis extrações novamente para obter cada fundo. Adicione seis concentrações diferentes de cada padrão a essas seis extrações, respectivamente, e injete-as uma a uma no sistema HPLC. Regisso das áreas de pico de cada padrão em diferentes concentrações através das transições em massa.Este protocolo foi usado para identificar e quantificar n1-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas de dois dias de idade arabidopsis tipo selvagem. O perfil de espectrometria de massa indicou que os íons do produto gerados a partir do padrão N1-metiladenosina estão em 150 e 133 MZ ratios. E o mesmo perfil foi observado na extração zero da Colômbia.Devido à alta abundância do íon do produto de 150 MZ, foi selecionada a transição em massa de 282,1 para 150 para a identificação de N1-metiladenosina. O tempo de retenção do pico alvo foi de 7,05 minutos. O mesmo que o tempo de retenção do padrão N1-metiladenosina.Uma série de concentrações de n1-metiladenosina foi adicionada em seis extrações amostrais. As amostras padrão foram injetadas no LC-MS/MS e as áreas de pico aumentadas de N1-metiladenosina foram traçadas contra as concentrações nominais das normas. As seis extrações de fundo iguais são importantes para fazer uma curva de calibração precisa e repetível para a quantificação.Nosso método pode ser aplicado para explorar caminhos metabólicos em plantas. Comparando os perfis metabólitos entre mutantes do tipo selvagem e perda de função, o fluxo metabólico poderia ser desenhado.

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