Name: induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا غريغ سيلي وألان كونتي على المساعدة التقنية الممتازة والبروفيسور زوزسانا إزفاك من مركز ماكس دلبروك في برلين على التكرم بتوفير PSB100X و pT2-CAGGS-فينوس بلاميدز. وقد دعم هذا العمل كل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم والمفوضية الأوروبية في سياق البرنامج الإطاري السابع. تم تمويل Z.I من قبل مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742].

وقد وافقت اللجنة الأخلاقية للبحوث الكانتونية (رقم 2016-01726) على إجراءات جمع العين البشرية واستخدامها.
1. عزل الخلية وظروف الثقافة
<ol><li>خط الخلية ARPE-19 البشري<ol>
<li>الثقافة 5 × 105 خلايا ARPE-19، خط الخلية RPE الإنسان، في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة / المغذيات خليط F-12 لحم الخنزي?...

<ol>
	<li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures:+Do+melanosomes+confer+cytoprotection.">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li><li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li><li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy.">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li><li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration:+a+review.">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li><li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials.">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li><li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species.">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li><li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li><li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress.">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li><li>. National Institute of Health Available from: <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020)</li><li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li><li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress.">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li><li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium:+Oxidant+injury+and+replicative+senescence.">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li><li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells.">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li><li>Polato, F., Becerra, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Degenerative+Diseases:+Mechanisms+and+Experimental+Therapies.">Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies.</a> Retinal Degenerative Diseases. , 699-706 (2016).</li><li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+regulates+the+ERK1/2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death.">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li><li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins.">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li><li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids.">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li><li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery.">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li><li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+H2O2-,+HNE-,+or+tBH-treated+ARPE-19+cells.">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li><li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+gene+regulation.">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li><li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li><li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+in+the+human+body.">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li><li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor.">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li><li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells.">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin/angiostatin+for+macular+degeneration+(GEM)+study.">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li><li>Chen, X. -. D., Su, M. -. Y., Chen, T. -. T., Hong, H. -. Y., Han, A. -. D., Li, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor/AKT+signaling+pathway.">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li><li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species.">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li><li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating.">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li><li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells.">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress.">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li><li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells.">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li><li>M&#225;t&#233;s, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates.">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li><li>. Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020)</li><li>. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020)</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2^(-&#916;&#916;CT)+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-&#916;&#916;CT) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl.">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li><li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1.">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li><li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress.">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li><li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy.">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression.">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li><li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCP2,+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels.">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li></ol>

يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا لتحليل وظيفة مكافحة الأكسدة والحماية ل PEDF و GM-CSF التي تنتجها الخلايا المصابة ، والتي يمكن تطبيقها على الخلايا المصابة بأي جين مفيد مفترض. في الاستراتيجيات العلاجية الجينية التي تهدف إلى إيصال البروتينات إلى الأنسجة عن طريق زرع الخلايا المعدلة وراثيا، من ا...

النموذج الموصوف هنا، يقدم نهجا مفيدا لتقييم كفاءة العوامل الصيدلانية الحيوية للحد من الإجهاد التأكسدي في الخلايا. لقد استخدمنا النموذج للتحقيق في الآثار الوقائية ل PEDF و GM-CSF على الإجهاد التأكسدي H2O2- بوساطة على الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية ، والتي تتعرض لمستويات عالية من O2، والضوء المرئي ، وداء البلعومية لأغشية الجزء الخارجي مستقبلات ضوئية ، مما يولد مستويات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)1، 2. وهي تعتبر مساهما رئيسيا في الإمراض من الضمور البقعي المرتبط بالعمر الوعائي (aAMD)3،4،5،6،7،8. الى جانب ذلك ، هناك انخفاض في العوامل العصبية المركبة RPE ، وتحديدا عامل الصباغ المشتقة من الظهارة (PEDF) ، وعوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs) ، وعامل تحفيز مستعمرة الماكروفولسيتي الحبيبي (GM-CSF) مما يؤدي إلى خلل وفقدان خلايا RPE ، تليها خلية الشبكية والشبكية العقدية (RGC) وفاة3و4و5 . AMD هو مرض معقد ينتج عن التفاعل بين العوامل الأيضية والوظيفية والوراثية والبيئية4. عدم وجود علاجات لAMD هو السبب الرئيسي للعمى في المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 سنة في البلدان الصناعية9،10. إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية المنشأ عن طريق زرع تحت الشبكية من خلايا RPE المعدلة وراثيا الإفراط في التعبير PEDF وجنرال موتورز-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية عن طريق التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي, تثبيط التهاب ودعم بقاء الخلية11,12,13,14,15,16 . على الرغم من أن هناك العديد من المنهجيات لتسليم الجينات إلى الخلايا، اخترنا غير الفيروسية فرط النشاط الجمال النائم transposon نظام لتسليم PEDF والجنرال موتورز-CSF الجينات إلى خلايا RPE بسبب ملفها الشخصي السلامة، ودمج الجينات في جينوم الخلايا المضيفة، وميلها لدمج الجينات تسليمها في مواقع نشطة غير النسخ كما أظهرنا سابقا17، 18،19.
يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي الخلوي في الخلايا المستزرعة في المختبر من قبل العديد من العوامل التأكسدية، بما في ذلك بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)،4-هيدروينونال (HNE)، tertbutylhydroperoxide (tBH)، وارتفاع التوترات الأكسجين، والضوء المرئي (الطيف الكامل أو الأشعة فوق البنفسجية)20،21. تتطلب التوترات العالية للأوكسجين والضوء معدات وظروف خاصة، مما يحد من إمكانية النقل إلى أنظمة أخرى. عوامل مثل H2O2، HNE ، و tBH تحفز تداخل الإجهاد التأكسدي التغيرات الجزيئية والخلوية. اخترنا H2O2 لاختبار النشاط المضاد للأكسدة من PEDF و GM-CSF لأنه مناسب وذي صلة بيولوجيا لأنه يتم إنتاجه من قبل خلايا RPE كأوكسجين تفاعلي وسيط أثناء مستقبلات ضوئية الجزء الخارجي phagocytosis22 ويوجد في الأنسجة العينية في الجسم الحي23. منذ أكسدة الجلوتاثيون قد تكون مسؤولة جزئيا عن إنتاج H2O2 في العين، قمنا بتحليل مستويات GSH / الجلوتاثيون في دراساتنا، والتي ترتبط H2O2-الناجم عن الإجهاد التأكسدي والقدرة التجديدية للخلايا21،22. تحليل مستويات الجلوتاثيون ذات صلة خاصة لأنه يشارك في آليات الحماية المضادة للأكسدة في العين24. يستخدم التعرض ل H2O2 بشكل متكرر كنموذج لفحص قابلية الإجهاد التأكسدي والنشاط المضاد للأكسدة لخلايا RPE1و25و26و27و28و29و30، بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يظهر أوجه تشابه مع تلف الإجهاد التأكسدي الناجم عن الضوء ، وهو مصدر "فسيولوجي" للإجهاد التأكسدي21.
لتقييم وظائف وفعالية العوامل العصبية، قمنا بتطوير نموذج في المختبر يسمح للتحليل بتحديد التأثير المضاد للأكسدة لعوامل النمو التي تعبر عنها الخلايا المعدلة وراثيا للتعبير المفرط عن PEDF و GM-CSF. هنا، نظهر أن خلايا RPE المصابة بجينات PEDF و GM-CSF أكثر مقاومة للآثار الضارة ل H2O2 من خلايا التحكم غير المصابة، كما يتضح من مورفولوجيا الخلية، والكثافة، والبقاء، ومستوى داخل الخلايا من الجلوتاثيون، والتعبير عن الجين UCP2، الذي رموز للبروتين الميتوكوندريا فك 2 التي ثبت للحد من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)31.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate white with clear flat bottom&#160;</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3610</td>
			<td>Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamid 40%</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-05F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-GMCSF</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PA5-24184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-PEDF&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-390172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-penta-His&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-phospho-Akt</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rabbit IgG H&#38;L-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARPE-19 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber culture glass slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duo Set ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>DY215-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISAquant kit</td>
			<td>BioProducts MD</td>
			<td>PED613-10-Human</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyes (human)</td>
			<td>Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega plate reader&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (version 8.0)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Glo Glutathione Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software (image processing program)</td>
			<td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&#8211;2014</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazol&#160;</td>
			<td>Axonlab</td>
			<td>A1378.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI4000B microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II&#160;</td>
			<td>Roche Molecular Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 SW1.5.1 software</td>
			<td>Roche Molecular Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Axonlab</td>
			<td>3468.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-3197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Lum G Gel Imaging System</td>
			<td>Aplegen Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 in Supplementary Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant hGM-CSF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant hPEDF&#160;&#160;</td>
			<td>BioProductsMD</td>
			<td>004-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReliaPrep RNA Cell Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z6011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer system for WB&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix qScript</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95048-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline (TBS)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15504020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>AppliChem&#160;</td>
			<td>A1390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBright ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045-D50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman nitrocellulose membrane</td>
			<td>Chemie Brunschwig</td>
			<td>MNSC04530301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells

يلعب الإجهاد التأكسدي دورا حاسما في العديد من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض يصيب حوالي 30 مليون مريض في جميع أنحاء العالم. وهو يؤدي إلى انخفاض في ظهارة صبغ الشبكية (RPE) توليفها العوامل العصبية، على سبيل المثال، عامل مشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) وعامل تحفيز مستعمرة الحبيبية الضامة (GM-CSF)، تليها فقدان خلايا RPE، وفي نهاية المطاف مستقبلات ضوئية وخلية العقدة الشبكية (RGC) الموت. نحن نفترض أن إعادة تشكيل بيئة الشبكية العصبية والعصبية من خلال زرع تحت الشبكية لخلايا RPE المصابة التي تفرط في التعبير عن PEDF و GM-CSF لديه القدرة على منع انحطاط الشبكية من خلال التخفيف من آثار الإجهاد التأكسدي ، وتثبيط الالتهاب ، ودعم بقاء الخلية. باستخدام نظام الإرسال والاستقبال الجمال النائم (SB100X)وقد تم تحويل خلايا RPE الإنسان مع الجينات PEDF وجنرال موتورز-CSF وأظهرت التكامل الجيني مستقرة، والتعبير الجيني على المدى الطويل، وإفراز البروتين باستخدام qPCR، وصمة عار الغربية، ELISA، و immunofluorescence. لتأكيد وظائف وفعالية PEDF و GM-CSF التي تفرزها خلايا RPE المصابة ، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لتحديد الحد من الإجهاد التأكسدي H2O2- الناجم عن خلايا RPE في الثقافة. تم تقييم حماية الخلايا من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا والكثافة ومستوى الجلوتاثيون داخل الخلايا والتعبير الجيني UCP2 وقابلية بقاء الخلية. وأظهر كل من خلايا RPE المصابة التي تزيد من التعبير عن PEDF و / أو GM-CSF والخلايا غير المصابة ولكن المعالجة مع PEDF و / أو GM-CSF (المتاحة تجاريا أو النقية من الخلايا المصابة) حماية كبيرة للخلايا المضادة للأكسدة مقارنة بالضوابط غير المعالجة. النموذج الحالي H2O2هو نهج بسيط وفعال لتقييم التأثير المضاد للأكسدة للعوامل التي قد تكون فعالة لعلاج AMD أو الأمراض العصبية المماثلة.

تحريض الإجهاد التأكسدي في الخلايا الظهارية صبغ الشبكية البشرية تم التعامل مع ARPE-19 وخلايا hRPE الأولية بتركيزات متفاوتة من H2O2 لمدة 24 ساعة وتم قياس مستوى الجلوتاثيون المضاد للأكسدة داخل الخلايا كميا(الشكل 2A،B). H2O2 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

نقدم بروتوكول لتطوير واستخدام نموذج الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية مع H2O2، وتحليل مورفولوجيا الخلايا ، وقابلية البقاء ، والكثافة ، الجلوتاثيون ، ومستوى UCP-2. وهو نموذج مفيد للتحقيق في التأثير المضاد للأكسدة من البروتينات التي تفرزها الخلايا المتحولة جنسيا لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي.

تحريض وتحليل الإجهاد التأكسدي في الجمال النائم Transposon-Transfected الخلايا الظهارية صبغة الشبكية البشرية

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

تحديد<em&gt; الجمال النائم</em&gt; الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

أداء تحت الشبكية الحقن في القوارض لتسليم خلايا الظهارة الصبغية الشبكية في تعليق

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

خطوة بالبروتوكول الخطوة لجراحة تحت الشبكية في الأرانب

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

تحريض تصلب الشرايين المتسارع في الفئران: نموذج "الأسلاك- إصابة"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

الفوسفور 31 الرنين المغناطيسي الطيفي: أداة لقياس<em&gt; في فيفو</em&gt; القدرة الميتوكوندريا الفسفرة التأكسدية في العضلات الهيكلية البشرية

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...