Name: a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model
Uploaded: 2020-11-06T15:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

この研究は、LSUHSC財団(PLF)によって支援され、一部はルイジアナ臨床トランスレーショナルサイエンスセンターに資金を提供する国立衛生研究所の国立医学研究所のU54 GM104940によって支援されました。

尾静脈注射と温暖化/抑制装置の使用を含むすべての動物プロトコルは、地元の機関動物ケア委員会(IACUC)によって審査され、承認されました。
1. 準備
<ol><li>少なくとも1週間の住宅環境で動物を順応し、食品および水のアドリビタムを可能にする。 注:この注射技術のほとんどの新しいユーザーのために、尾静脈が皮膚を通して容易に見えるように白または明るい色の毛皮を有する動物株が好ましいかもしれません。マウス(例えば、C57BL/6)またはラット(例えば、ブラウンノルウェー)の暗色株は、深く色素化された尾を有し、静脈に対して弱い色コントラストをもたらす。新しいユーザーは、能力が得られるまで十分なトレーニングを受け入れるよう強くお勧めします。</li>
	<li>尾静脈注射用薬剤<ol>
<li>すべてのテスト エージェントとソリューションを無菌で準備します。生物や細胞材料を投与する場合は、熱物を含まない状態を維持するために、処理のすべてのステップで注意を要します。</li>
		<li>通常の生理食塩水(0.9%w/v塩化ナトリウム)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などのバランスの取れた塩溶液のみを尾静脈注入の車両として使用してください。 注意:血管損傷の潜在的なリスクのために水、油、または粘性溶液を使用しないでください。血液の緩衝効果とげっ歯類の速い血流率のために、幅広いpH(4.5-8.0)は許容範囲です。しかし、高酸性またはアルカリ性溶液は、注射部位で不必要な組織損傷を引き起こす可能性があり、避けるべきである。</li>
		<li>射出の量と頻度を最小限に抑えます。マウスとラットの推奨体積(それぞれ≤200 μLと≤500 μL)を射出前の体温で使用して、動物3へのストレスを最小限に抑えてください。</li>
		<li>注射器と針の各調製は、溶液中の気泡から解放されていることを確認します。気泡が存在する場合は、塞栓症のリスクを防ぐためにそれらを完全にパージします。 注:通常、27 Gの1mLの注射器は、ほとんどの尾静脈注射には1/2-in針が適しています。</li>
		<li>使い捨てまたは専用のガウンとラテックスまたはニトリル手袋の最小値と地元のIACUCによって必要とされる適切な個人的な保護具(PPE)を使用してください。尾静脈注射を行う場合は、安全メガネの使用を強くお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>温暖化と拘束装置<ol>
<li>使用前にすべてのコンポーネントを注意深く点検し、デバイスに欠陥がないことを確認します(図1)。</li>
		<li>ウォーミング・デバイスの初期化 (図 2A)<ol>
<li>暖かいユニットを清潔な平らなベンチトップに置き、デバイスの電源を入れ、電源を入れろ。サーモスタットの電源インジケータランプが緑色に点灯していることを確認します。寝具を温室の中に置き、エリアを乾燥させ、熱を保ちます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>拘束装置のセットアップ (図 2B)<ol>
<li>拘束単位を加温ユニットと並べて、動物に適したコーンサイズを決定します。必要に応じて、柔軟なアルミニウムコーンのベース幅を手動で調整して、動物に十分な拘束を提供します。あるいは、様々な体の大きさのマウスまたはラットを収容するために、コーンをカスタムフィットモデルに置き換えます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 尾静脈注射
<ol><li>装置の調整<ol>
<li>内部温度の設定<ol>
<li>コントロールダイヤルを使用して、サーモスタットを希望の温度に設定します。ヒーターインジケータが赤色に点灯していること、および電球が点灯していることを確認します。電球が点灯している間は、内部温度表示を注意深く監視します(加熱)。サーモスタットは、目標温度に達すると、約10〜15分で自動的に電球を不活性化します。 注:周囲温度よりも高い温度を設定すると、ヒーターがアクティブになります。一般に、標準的なビバリウム条件で推奨される収容温度は20〜26°Cの範囲で異なり、一方で、実験室用マウスの中性(すなわち、快適な)温度は30〜32°C42の間であると考えられる。したがって、温暖化チャンバの内部温度は、熱中性よりわずかに高く、およそ32〜36°Cで上昇することが推奨されます。 サーモスタットを体温より上に設定しないでください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>拘束プラットフォームの位置決め<ol>
<li>高さ調整ノブを使用して、ユーザーに最適なレベルにコーンの高さを調整します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>熱処理(図3A)<ol>
<li>目標温度(32~36°C)に達したら、動物をハウジングケージから温暖化チャンバーに静かに移します。 注意:5~10分間の熱処理は、血管拡張を誘発し、尾静脈の視認性を高めるのに十分です。しかし、動物は、手順の間(通常、温熱の兆候のない20〜30分)の間、熱調節室に安全に保持することができます。温暖化室には、4~6匹のマウスまたは1匹のラットを安全に含めることができます。</li>
		<li>急性熱ストレスの兆候(例えば、急速な呼吸、無気力、ジャンプエスケープ挙動)の兆候を動物を監視します。 注意:温熱の徴候を示す動物は、再使用前に通常の活動を再開するまでケージに戻し、監視する必要があります。これが最適な範囲を超える内部温度が原因である場合は、ウォーミングデバイスの電源が切れていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>射出ステップ<ol>
<li>尾の基部で動物を持ち上げ、温暖化室から取り除きます。拘束ユニットのコーン開口部に動物を導入します。 注意: マウスを尾端から持ち上げないでください。これは、重傷につながる可能性があります。取り扱いの代替方法は、肥満または妊娠マウス28のために使用されるべきです。</li>
		<li>動物が前足でコーンの遠端をつかむと、尾を後ろ向きにそっと引っ張り、開いたスリットを通します。側面静脈が12時の位置に示されるように、コーンのベースで動物の後端をコーンから突き出して固定します。両側に1つずつ、2つの側面静脈があるので、いずれかの後ろ足を突き出すことができます(図3B)。</li>
		<li>親指と人差し指の間の非支配的な手で、尾の長さを3分の2に持ち、横静脈にわずかな張力を入れて尾の位置合わせと血管拡張を維持します。 注: 熱処理による拡張静脈の可視性の向上により、最良の結果を得るために注入部位を迅速に決定することができます(図4)。</li>
		<li>70%アルコールで湿らせたガーゼスポンジまたはパッドで注射部位の皮膚を拭きます。尾に刺激を避けるために、できるだけ穏やかに、迅速に清掃してください。 注: この手順は、機関 IACUC の裁量で省略できます。</li>
		<li>シリンジを支配的な手で持ち、針を尾に平行に置きます。針を血流の方向に挿入し、10~15°の角度(図5A–B)で傾斜し、2~4mmを貫通して静脈の内腔にさらに進みます(図5C-D)。ゆっくりと溶液を注入します。 注:注入が成功した場合、プランジャーの抵抗は感じるべきで、流体が静脈を通って動いているのが見えます。注射部位の上に抵抗や白い水疱がある場合は、針を取り外し、元の針の配置の上の場所で2回目の注射を試みます。液体が最初の部位を通して放出するので、最初の注射部位の下に注入しようとしないでください。1つの側静脈の注入が失敗した場合は、動物を反対側に再配置し、対側静脈でより多くの試みを行う。試行の最大数は、静脈に沿って試みられた注射を開始する場所と、試行を逃した場合に発生する可能性のある腫れによって異なります。誤注射および関連する傷害に関する機関のIACUC規制を参照してください。</li>
		<li>針を外し、親指をしっかりと押して、注入された溶液や血液の逆流を防ぎます。出血が止まるまで、清潔なガーゼ/ワイプまたはティッシュで穏やかな圧縮を続けます(図6)。</li>
		<li>動物をケージに戻し、少なくとも5分間監視します。動物がさらなる出血なしに正常な活動を再開することを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 真菌性血流感染と敗血症のマウスモデル
<ol><li>マウスの緊張<ol>
<li>アクライジテニオススイスウェブスターは、制度的に推奨されるガイドラインごとに6週齢でマウスを繁殖させた。あるいは、このプロトコルに対して近血/遺伝子組換え株(例えば、C57BL/6バックグラウンド)を使用して、改変されたインノキュラを使用することもできます(注参照)。 注 (詳細については、説明を参照): 暗いファーを持つマウスの尾静脈は、深く色素化された尾が原因で、薄い毛皮を持つものよりも見えないことが多い(図4)。異なるマウス株間で真菌敗血症/致死性に対する感受性が異なります。スイスウェブスター以外のマウス株の使用は、ホストの免疫状態に影響を与える可能性のある関連要因(例えば、遺伝的背景、年齢、性別、体の大きさ)を考慮することによって、追加のプロトコル最適化を必要とするかもしれない。例えば、C57BL/6マウスにおける致死的な挑戦は、典型的には、スイスのウェブスターマウスに見られる死亡率のレベルを達成するために、より高いイノキュラ(最大10倍)を必要とする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>微生物<ol>
<li>致命的な挑戦(敗血症)のために、 カンジダアルビカンス 株DAY185(または選択した株)のストリーク冷凍株は、サボローデキストロース寒天に、30°Cで2日間インキュベートします。</li>
		<li>1コロニーを10mL酵母エキスペプトンデキストローススープに移し、30°Cで18時間の静止した成長期に培養します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イノキュラムソリューション<ol>
<li>致死的な挑戦の日に、ブロス培養物を収集し、滅菌PBSで遠心分離(800×g)によってペレットを3回洗浄する。</li>
		<li>トリパンブルー染料除外により生菌細胞を同定し、ヘモサイトメーターを用いて列挙する。室温で滅菌PBSで細胞濃度を1 x 106 細胞/mLに調整します。 注:各動物は、接種液の100 μLを受け取ります。注入のプロシージャの間に潜在的な損失を可能にするためにイノキュラム(>500 μL)の余分な容積を準備する。最後の接種は、マウスあたり1 x 105 細胞です。接種量は、それに応じて細胞濃度を調整することで最大200μLまで増加させることができます。 注意:真菌の接種液は、注射前に室温で保管する必要があります。イノキュラム溶液を体温に温め、酵母細胞からヒファエへの形態変化を引き起こす可能性がある。逆に、冷たい溶液のボーラスi.v投与は、動物の体温を急速に低下させることができ、避けるべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>静脈内接種<ol>
<li>動物を温め、セクション2の手順に従って血管拡張を誘発する。</li>
		<li>27 G、1/2イン針を用いた1 mLシリンジを使用して、100 μLの接種液を尾静脈に注入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>接種後のモニタリング<ol>
<li>敗血症誘発性の次の徴候について動物を監視する:i)毛皮の側面(例えば、 滑らか、フリル)、ii)活動(例えば、自由に動く、無反応)、iii)姿勢(例えば、ハンチ、硬い)、行動(例えば、遅い、位置が遅い)、v)胸部の動き(例えば、正常呼吸、呼吸困難)、vi)まぶた(例えば、開いた、閉じた)43。</li>
	</ol>
</li>
	<li>敗血症スコアリング<ol>
<li>各カテゴリの0から3までの4ポイントグレーディングスケールで敗血症(M-CASS)の変更されたマウス臨床評価スコアに従って観察された罹患率をスコアします: 0、正常;1、軽度。2、中程度。3、重度43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>任意のプロトコル:真菌敗血症に対するワクチン接種<ol>
<li>致死的な挑戦の14日前に、Cの代わりにセクション3.2-3.4で説明されているように、カンジダ・ダブリンニエンシス株Wü284または減衰したC.アルビカン株(1匹あたり1x10 5細胞/マウス(1匹あたりマウス当たり1x10 5細胞)を有する接種マウス。</li>
		<li>3.2~3.4項に記載されているように、ワクチン接種を受けたマウスで致死的な挑戦を行い、3.5~3.6項に記載の敗血症誘発性罹患率の徴候を監視する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

一貫した正確なドージングは、動物モデルにおける実験信頼性の重要な要件です。これは、注射剤の全身生物学的利用能が他の投与経路3よりもかなり高い/速いi.v管理の場合に特に重要である。したがって、尾静脈注射のエラーは、研究結果に有害な影響を与える可能性があります。歴史的に、i.v.ではなく腹腔内(i.p.)注射は、技術的な簡便さと利便性のためにげっ歯類の全身アクセスのための最も一般的な方法であった。しかし、動物からの前臨床読み出しを臨床設定に変換する場合、投与ルートはより重要になります。したがって、成功した尾静脈注入を促進することができるげっ歯類のプロトコルの継続的な改善の必要性がある。
現在のプロトコルの重要な進歩は、げっ歯類の血管拡張の効果的な誘導を可能にする革新的な熱調節された温暖化装置であり、尾静脈および針のアライメントの可視性を劇的に改善する。熱調節が不十分な加熱方法(例えば、ランプ)、局所血管拡張剤または皮膚刺激物(例えば、キシレン)は、信頼性が低いだけでなく、動物にとっても安全でないため、44を避けるべきである。暖水中に尾を浸すなどの他の従来の方法とは対照的に、この装置の自動調節能力は、複数の動物を同時に安全に条件することができる。さらに、このプロトコルは最適に設計された抑制装置を使用し、側面尾静脈を最もよく表示する位置で動物の迅速かつ安全な固定化を可能にすることによってさらに強化される。
多くの現在の拘束剤に見られる透明な管状のフォーマットは、実質的にうまく設計されているが、各動物とのより多くの処理時間を必要とし、従って拘束プロセス45を延長する。これは、限られた協力46、47を提供する積極的な特性を持つげっ歯類株でより問題になる可能性があります。対照的に、拘束装置の半密閉コーン構造は、動物の迅速な位置を可能にし、拘束の持続時間を最小限に抑えるのに役立ちます。革新的で最適化された温暖化/抑制システムを使用した合理化されたプロトコルにより、注入手順が加速され、大きな動物群の迅速かつ効果的な投与が可能になります。当研究室では、通常、このプロトコルを使用して、熱処理から射出後モニタリングまで30匹のマウスの全注射手順を1時間以内に完了します。
高度な機能にもかかわらず、このデバイスはいくつかの明らかな欠点を持っています:最初のは、デバイスのコストと温暖化室での日常的な電球の交換です。しかし、注入の効率および速度に加えて、装置は繰り返し使用するために耐久、ほとんどの一般的な消毒剤と互換性があり、使用間の装置の徹底的なクリーニングを可能にする。これにより、初期投資が相殺されます。Secondは、限られたワークスペースを有する状況において、このプロトコルの欠点は、注入を行っている間に2つのユニットを並べて配置するのに十分な大きさの専用ベンチ領域の要件である可能性がある。しかし、i.v.インジェクションを含むいくつかのげっ歯類プロトコル全体で広く利用できるため、イオブルラン気化器などの他の共同ビバリウム装置と同様のコア機器として機能する可能性があります。関係なく、2つの単位は容易に携帯可能であり、使用中でない間に束ねられ、収納することができる。
このプロトコルに記載されているマウス真菌敗血症のi.v.致死的な挑戦モデルは、ヒトにおけるC.アルビカンス血流感染を密接に模倣し、真菌性毒性の研究、抗真菌療法の有効性の試験、および感染37、39、48に対する宿主免疫応答を特徴付けるために広く使用されてきた。再現性のある感染を達成するために、尾静脈注射による接種は、血流中への生物の正確な送達を確実にするプロトコルの最も重要なステップである。実際、動物はカンジダi.vの課題の様々なレベルに非常に異なる反応を示します。あまりにも少量の接種量の投与は望ましくない自発的な回復をもたらすが、高用量を受け取り過ぎる動物は早期に屈する。特定の生物が一貫したレベルの敗血症/死亡率を誘導するための接種サイズの特定のウィンドウは、真菌株とマウス株の両方に大きく依存する。
1 x 105野生型C.アルビカンスの接種でスイスウェブスターマウスを使用した現在のプロトコルは、1日以内に敗血症罹患率の発症を再現的に誘発し、その後進行性死亡率は5〜7日で100%致死性をもたらした。一方、1 x 105より高いイノキュラは、通常、1 x 106で1-2日、5 x 105で3〜4日の1-2日の死亡を加速させ、1 x 10 5未満の人は致死性を持つ。文献の多数の報告に沿って、C.アルビカンスの代わりに非アルビカンスカンディダ種を使用すると、致死性が40、49に有意に減少する。さらに、マウス株、あるいはコロニーの起源の選択は、他の39、40、41、50、51、51、52、53、54、55によって報告されるように、マウス株間の様々な感受性による感染結果にかなりの影響を与える可能性があります。したがって、実験を設計する際には、両方を考慮する必要があります。
致死的なi.v.の挑戦に続いて、真菌細胞は血流を通して急速に広がり、複数の器官に侵入し始め、その中で最も影響を受けるのが腎臓41である。影響を受ける他の器官は、脳、脾臓、および骨髄48、56である。いずれにせよ、急性敗血症は早期の時点での最終的な死因である37.代表的な結果に示すように、敗血症の重症度は、挑戦動物43、57における敗血症状態の示された徴候に基づいて敗血症のマウス臨床評価スコア(M-CASS)によって定量的に評価することができる。致死性敗血症のいくつかの代理マーカーの中で、低体温症は、臨床的および実験的敗血症43、58、59の両方で差し迫った死亡の重要な予測変数として示唆されている。
このモデルでは近親交配マウスと外来マウスを直接比較する正式な研究は行われていないが、アウトブレッドのスイスウェブスターマウスを用いて現在のプロトコルから得られたデータは、遺伝的不均一性と推定されるにもかかわらず、様々な敗血症パラメータで非常に再現可能である。一般的に、3〜5日以内に当たる死亡率のパターンは、致死後の挑戦50、51の数時間以内に敗血症罹患率および炎症性マーカーのレベルの急速な上昇によって証明されるように、急性敗血症の確固たるモデルである。生存期間が長い(7~10日間)、死亡率は、標的臓器や中枢神経系における致死的な組織損傷につながる微生物の負担の結果である可能性が高い。敗血症または微生物の負担の選択は、使用される接種によって決定される抗炎症レジメンまたは抗真菌療法/ワクチンに対する免疫機能または応答を評価するために必要に応じて適用することができる。
i.v. 致死的なチャレンジモデルに加えて、i.p.チャレンジを介したマウスにおけるC.アルビカンスによる腹腔内感染は、細菌病原体、黄色ブドウ球菌との共接種、相乗的にCと比較して死亡率を増強するが、カンジダ症とその後の敗血症を広めることも可能である。i.p. 致死的なチャレンジモデルでは、実質的に高い微生物のイノキュラ(1.75 x 107C. アルビカン/8 x 107S.アウレウス1マウス)は、多微生物腹膜炎を引き起こし、腹腔から血流への生物の播種を引き起こす必要がある。同様に、免疫抑制性および/または粘膜損傷剤で治療されたマウスにおけるC.アルビカンスによる胃腸感染は、真菌細胞を血流中に転座させ、真菌敗血症62、63をもたらす。特徴的な接種経路にもかかわらず、真菌敗血症を引き起こすメカニズムは、3つの疾患モデル間で大部分が類似性であり、カンジダに対する制御されていない全身炎症反応を伴い、臓器不全37、51、61を引き起こす。同様に、ヒトにおいて、単にカンジデミアではなく、宿主応答のこの過程が、医療設定64,65で取得した血腫的に播種されたカンジダ症に関連する高い罹患率/死亡率を引き起こす。
現在の真菌敗血症モデルを用いて、致死的なC.アルビカンス感染に対する保護は、C.ダブリンニエンシス(アビラマン)または減衰したC.アルビカンス変異体によるi.v.v.免疫/ワクチン接種によって達成できることをここで実証する。この保護は、訓練を受けた先天性免疫66,67の形態として骨髄に誘導されているように見える先天的なGr-1+骨髄由来のサプレッサー細胞によって媒介される。C.アルビカンス血流感染に対する自然免疫媒介保護のこの新しい形態の理解を拡張するための努力が進行中である。
結論として、革新的なげっ歯類の温暖化/抑制装置は、効率的かつ効果的な方法で大規模な多群動物実験のi.v.注射を行う能力を高めるのに役立っています。したがって、我々はデバイスのための用語、マウス分を造りました。デバイス仕様は、類似のデバイスの調達の要求に応じて、対応する作成者から入手できます。ここで示した技術は、幅広い研究分野で尾静脈注射を採用するげっ歯類モデルで有用なツールとして役立つ可能性があります。

げっ歯類を含む動物モデルの使用は、生物医学研究の定番となっています。多数の近親交配および外交株、ならびに遺伝子組換えラインが利用可能であり、世界中の研究室で日常的に使用されています。尾静脈注射は、実験剤の静脈内(i.v.)投与を必要とするげっ歯類モデルにおいて不可欠な方法の1つである。一般的に、i.v. 注射は、局所組織や消化管をバイパスして高吸光度率や、広範囲の濃度または非生理学的pH1、2、3、4の溶液に対する耐性が高いなど、他の投与経路に対して大きな利点を有する。他の実行可能なi.v.ルート(例えば、伏在静脈、レトロ軌道静脈静脈)の中で、尾静脈はげっ歯類2、3、5、6において最も安全で最も容易にアクセス可能な血管と考えられている。したがって、尾静脈注射は、感染症モデル7、8、9、生物学的材料10、11の移植、前臨床治療薬12、13、および毒物学的分析14、15を含むげっ歯類モデルの配列で広く採用されている。
一貫性と投与の精度は成功した尾静脈注射の重要な要件です。.驚くべきことに、文献中の尾静脈注射の定量的および定性的評価は、頻繁な誤注射16、17に関係する。ある研究では、訓練を受けたインジェクターによって行われた30回の注射のうち12回が、尾部18内に注射された用量の10%以上を残したと報告されている。さらに、尾静脈注射を受ける動物の安全性と快適さは、手順中の主な関心事であるべきです。不適切な拘束は、傷害およびストレス関連病理の範囲(例えば、体重減少、免疫応答障害)を引き起こし、サンプルの質19、20に相当な変数を導入する可能性がある。これらのエラーは、データの変動性の増加と再現性の低下を引き起こし、結果に悪影響を及ぼす可能性があります。
動物における血管拡張の誘導は、血管の小径に起因する尾静脈注射を行う場合にしばしば必要であり、マウス21では300μmと推定される。血管拡張は、尾静脈の可視性を高め、静脈内の最適な針静脈アライメントを達成するのに役立ちます。暖かい水22に尾を浸し、暖かいドレープ、ランプ、またはヘアドライヤー23、24を使用して尾部に熱を加える、または加熱パッド、インキュベーター、またはこれらの熱源の1つと組み合わせた箱を使用して暖かい環境に動物を置くなどの様々な方法が研究室によって報告されている。デバイスは、特定の目的のために自作または商業サプライヤーから入手可能です。しかし、多くは温度調節能力を欠き、もしある場合、デバイスの温度は十分に維持されず、しばしば室温の変動の影響を受けます。同様に、麻酔の使用は推奨されないので、尾静脈注射のために抑制装置の使用が必要である26、27。いくつかのタイプの実験室特有または商業的な抑制装置が開発された。典型的には、動物は使い捨て50ml円錐管4、スロットプレキシガラス壁、トンネル、または円錐28に配置され、そのすべてが、動物の動きを制限しながら尾部の十分な露出を可能にする。しかし、ほとんどの拘束剤は、材料の剛性のためにサイズ制限があります。さらに、現代の高複雑性デバイスは、実用的かつ洗練された設計にもかかわらず、動物22の大群を含む注射には実現可能ではないようだ。
血流感染および関連敗血症のマウスモデルは、この技術の使用を必要とする状況の典型的な例である。重度の臨床敗血症のすべての微生物病因の中で、真菌敗血症は、多くの場合、抗真菌療法29にもかかわらず>40%の死亡率を有する致命的な状態である。実際、カンディダ・アルビカンスによる感染は、病院で獲得した血流感染(カンディダミア)30,31の第4位の原因として報告されている。腹腔内カンジダ症では、胃腸管内の微生物が血流を介して播体化し、さらに大きな死亡率32、33、34で多微生物敗血症を引き起こす可能性がある。ほとんどの結院性カンジダ血症症例は、汚染された中央線カテーテルまたは内在性医療機器から出てくるように35,36,i.v. 尾静脈注射によるC.アルビカンによる接種は、ヒト敗血症の発症を密接に反映することができ、血球化カンジダ症37,38のマウスモデルにおける主な方法であった。このモデルでは、C.アルビカンズi.v.inoculum39、40、41を調整することによって、数日で発生する死亡率を延長または短縮することができる。
最近、当社の研究室では、調節可能な抑制ユニットと組み合わせた、調節可能な抑制ユニットを備えた革新的な装置を使用して、最適に合理化された尾静脈注入のための革新的なプロトコルを1つの便利なシステムで開発しました。このプロトコルは、研究者が正確かつタイムリーに尾静脈注射を行うことを可能にし、動物は安全に条件付けされ、最小限の苦痛で処置のために拘束することができる。高度な温暖化と抑制装置を使用して、ここで実証された技術は、げっ歯類モデルを採用する様々な研究分野で有用なツールとして役立つ可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain DAY185</td>
			<td>Carnegie Melon University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Aaron Mitchell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain efg1&#916;/&#916; cph1&#916;/&#916;</td>
			<td>University of Tennessee Health Sciences Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Glen Palmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida dubliniensis strain W&#252;284</td>
			<td>Trinity College, Dublin, Ireland</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Gary Moran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>551NCICr:SW</td>
			<td>Female Swiss Webster; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>556NCIC57BL/6</td>
			<td>Female C57BL/6; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 27G, &#189;-in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute)</td>
			<td>LSU Health</td>
			<td>custom order</td>
			<td>Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211584</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2469</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model

げっ歯類モデルでは、尾静脈注射は、実験剤の静脈内投与のための重要な方法である。尾静脈注射は通常、血管拡張を促進するために動物の温暖化を伴い、血管の同定と、動物をしっかりと拘束しながら血管内腔への針の位置の両方を助ける。尾静脈注射は多くのプロトコルで一般的な手順であり、正しく実行された場合は非常に技術的とは見なされませんが、正確で一貫した注射は、再現性のある結果を得て変動を最小限に抑えるために重要です。尾静脈注射前に血管拡張を誘導する従来の方法は、一般的に、37°Cでの熱源(ヒートランプ、電気/充電式ヒートパッド、または予熱水)の使用に依存します。 標準的な実験室の設定で容易にアクセス可能であるにもかかわらず、これらの用具は明らかに貧しい/限られた熱調節能力に苦しむ。同様に、様々な形態の拘束装置が市販されているが、動物への外傷を避けるために慎重に使用しなければならない。現在の方法のこれらの制限は、実験で不要な変数を作成したり、実験や実験室間で様々な結果をもたらす。
本稿では、独立した熱的に規制された温暖化装置と調節可能な抑制ユニットを1つのシステムに組み合わせ、効率的に合理化された尾静脈注入を行う革新的な装置を用いて、改良されたプロトコルを実証します。私たちが使用する例は、敗血症を引き起こす真菌血流感染の静脈内モデルです。加温装置は、内部温度を事前設定された閾値で維持するために調節可能な自動サーモスタットを取り付けた熱反射アクリルボックスで構成されています。同様に、コーン拘束装置の幅および高さは、さまざまなげっ歯類のサイズを安全に収容するように調節することができる。デバイスの高度で汎用性の高い機能により、ここに示す技術は、尾静脈注射を採用するげっ歯類モデルを含むさまざまな研究分野で有用なツールになる可能性があります。

加温室内部の温度は、内部センサによって連続的に検出され、サーモスタットによって自動調節されます。まず、サーモスタットの制御ダイヤルを78、85、90、または95°F(26、29、32、または95°C)に配置し、設定温度を選択した。ヒーターが作動すると(図7、黄色の点)、設定温度に応じて、電球による熱放射が急速に最初の5〜15分の間に内部温度を上昇させた。検出された内部温度が設定温度(灰色の点)を超えた場合、ヒーターは電球を不活性化しました。最初のピーク温度は、動物の移動中の温度損失を相殺するために、すべてのグループで設定された温度より5〜7 °Cに上昇する必要があります。その後、装置は自動的に熱サイクルを繰り返し続け、設定された温度で温まる部屋を維持する。
現在のプロトコルを使用して成功した尾静脈注入によって得られた実験データの例を図8に示す。敗血症を引き起こす血流カンジダ症のマウスモデルでは、スイスウェブスターマウスのカンジダ・アルビカンス(1匹あたり1匹のマウス1 x 105細胞)に対するi.v.チャレンジが、敗血症の急速な発症と生物の播種の迅速な発流を引き起こし、3〜4日以内に高い死亡率を引き起こした(図8A)。対照的に、動物は、アビリマン酵母株、カンジダ・ダブリニエンシスによる以前のi.v.事前免疫/ワクチン接種によって敗血症から保護され、有害なC.アルビカン(固体ドット)による致死的なi.v.チャレンジに続いて>95%の生存を達成することができた。これらの結果は、4つの独立した実験で、ワクチン媒介性保護と対進行性の死亡率を再現的に得た(補足図1)。同様の保護は、減衰したC.アルビカンス変異体(Δefg1/Δcph1)などの他のアビルール酵母株(図示しないデータ)を用いて達成することができる。敗血症は同様に監視され、死亡率と相関することができる。致死性感染を伴う予防接種を受けていない動物は敗血症による罹患率が有意に増加したのに対し、ワクチン接種されたグループは致死的な挑戦に続いて最小限の症状を示した(図8B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig01.jpg"> 図1:げっ歯類の温暖化と抑制装置の説明(A) は 、次の要素から構成される、温暖化装置の外部図を示します。
<ol><li>サーモスタットカバー - サーモスタットを露出させるためにハンドルで上に持ち上げます</li>
	<li>電気エンクロージャー - 保護のために永久に密封される</li>
	<li>チャンバー蓋 - 動物の移動中に上向きに持ち上げる/</li>
	<li>温暖化室 - 取り外し可能で、使用前に寝具で床を覆う</li>
	<li>拘束装置 - 使用中の加熱装置でストワブル</li>
	<li>電源スイッチ - メインオン/オフ機能用インラインロッカースイッチ</li>
	<li>電源コード - 電圧/電流:120V/ 10A</li>
</ol>(B)は 、加温装置の内部を示す:
<ol><li>白熱電球 - 100ワットで光出力</li>
	<li>電球保護シールド - 電球交換用取り外し可能</li>
	<li>温度センサープローブ - チャンバー内に位置</li>
	<li>内部温度計 - 温度を監視するためにチャンバー内に置く</li>
</ol>(C)は 、加温装置サーモスタットの成分を示す:
<ol><li>内部温度温度計</li>
	<li>サーモスタット - ヒーターを自動調節する</li>
	<li>セットポイントコントロールレバー - 最小/最大:78 °F/ 108 °F(25 °C/42 °C)</li>
	<li>サーモスタットの電源インジケータ - 緑色の光は、通常の動作を示します</li>
	<li>サーモスタットヒーターインジケータ - 加熱サイクル中に赤色に点灯</li>
</ol>(D)は 、拘束装置のコンポーネントを示しています。
<ol><li>コーン - げっ歯類の拘束のために設計された柔軟なアルミニウムシート</li>
	<li>テールチャネル - 尾の滑らかな位置を可能にする形</li>
	<li>コーンリフトプラットフォーム - コーンベースの頑丈なリフトを提供します</li>
	<li>高さ調整ノブ - 手動高さ調整用に設計</li>
	<li>シザージャック - 高さの範囲 45-140 mm (1.77-5.52")</li>
	<li>サポートプレート - 安定性を提供するためにゴム製の足でインストールされた <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig02.jpg"> 図2:げっ歯類の温暖化と拘束装置。(A)使用前に、装置の2つの部分はクリーンベンチトップに並んで配置されます。(B)加温装置の電源が入ると、サーモスタットがヒータを作動させます。電球は点灯したままで、温度が設定されるまで熱を発します。加温装置は、内部温度を維持するために自動的に熱サイクルを繰り返します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig03.jpg"> 図3:マウス(C57BL/6)を加温・抑制装置に配置。(A) 血管拡張のための熱処理を受けているマウス。動物(治療ごとに4〜6匹のマウス)は、ハウジングケージからデバイスの温暖化室に移され、最低5〜10分間熱処理されます。マウスは、その尾が開いたスリットを通過して、拘束装置のコーン開口部に温暖化室から転送されます。マウスは、尾の基部がコーンの先端に到達するまで、コーンの先端にそっと引き戻されます。動物が穏やかな横方向の回転でコーンのベースに向かって描かれると、後ろ足が開いたスリットから突き出るように上向きに配置され、横方向の尾部静脈を12時に配置します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig04.jpg"> 図4:マウスの側面尾静脈の同定(A) 未治療のスイスウェブスターマウスの尾。マウスは、血管拡張のための事前の熱処理なしで抑制装置に置かれます。横尾静脈は、皮膚の下を進む薄い暗い血管として識別することができる。(B)スイスウェブスターマウスの尾部を、10分間の加温装置で処理した。熱処理マウスは尾静脈注入のために拘束される。横尾翼静脈は、血管拡張によって引き起こされる血管径の拡大により、皮膚を通して容易に見える。(C)C57BL/6マウスの尾部を10分間温め装置で処理し、尾静脈注射のために拘束した。血管拡張は深く色素化された皮膚を通して尾静脈の可視性を高めるが、静脈は静脈に対する弱い色コントラストのために明るい色のスイスのウェブスターマウスのように容易に見えない。赤い矢印は、側面の尾の静脈の位置を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig05.jpg"> 図5:熱処理マウス(スイスウェブスター)で行われた尾静脈注入。(A –B)注射部位の横尾静脈への針挿入。針(27G、1/2イン)は、ベベルを上げて尾静脈に平行に配置され、血流に向かって向き、挿入される。(C–D)尾静脈と注射の針の配置。針の先端はさらに静脈の内腔に2〜4ミリメートル進む。親指はシリンジのプランジャーの上に置かれ、所望の容積はゆっくりと安定した圧力で分配される。楕円形は射出部位を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig06.jpg"> 図6:射出後の手順。(A) 注射部位の出血領域。注射液の出血および逆流は、針の除去の直後に起こる。これは、親指で注射部位にしっかりと圧縮を適用することによって最小限に抑えることができます。(B)注射部位における血栓形成。きれいなガーゼ/ワイプと穏やかな圧縮は注入の傷の血行を促進する。矢印は注射部位を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig07.jpg"> 図7:使用時の温室の内部温度。指定された設定温度での温暖化のために、加温装置が作動した。装置の暖室は内部の空気温度および熱周期(電球の上/黄色の点、オフ/灰色の点)を45分以上記録した監視した。オレンジ色の領域はげっ歯類の血管拡張の誘導のための最適な温度範囲を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig08.jpg"> 図8:カンディダ・アルビカンスの致死的な挑戦に続く敗血症死亡率とワクチン媒介性保護.マウス(8週齢のスイスウェブスターメス)は、アビリレント生きたカンジダ・ダブリンニエンシスWü284(Cd)で静脈内ワクチン接種を行い、14日後に野生型C.アルビカンズ185日目(1匹あたり1x10細胞)で致死的な静脈内チャレンジを行った。(A) 致死的な挑戦の後10日間にわたって死亡率を評価した。(B) 動物は敗血症の罹患率を監視し、変性されたマウスの敗血症の臨床評価スコア(M-CASS)43に従って採点した。データは、グループあたり10匹のマウスを用いた4つの独立した実験の累積であり、マンテルコックスのログランク検定を使用して分析される。p < 0.0001.SEM、平均の標準誤差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:血液中のカンディダ・アルビカンスの挑戦による敗血症死亡率およびワクチン媒介生存の再現性。各パネルは、図8Aに示す累積結果に含まれる4つの独立した実験のデータを表します。各実験は、1群につき10匹のマウスを用いて行い、マンテル・コックスのログランク検定を用いて分析した。カ、カンディダ・アルビカンス。Cd、カンジダ・ダブリンンシス。p < 0.0001.p < 0.01 です。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61961/supfig01.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。</a>

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A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

ここでは、独自に設計された加温/抑制装置を用いたげっ歯類の尾静脈注射に対する効果的かつ効率的な方法を提示します。血管拡張の開始を合理化し、プロセスを抑制することによって、このプロトコルは、最小限の苦痛を伴う動物の大規模なグループの正確かつタイムリーな静脈注射を可能にする。

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