Name: a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model
Uploaded: 2020-11-06T15:00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av LSUHSC Foundation (PLF), och delvis av U54 GM104940 från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health, som finansierar Louisiana Clinical and Translational Science Center.

Alla djurprotokoll som omfattar svansvektioner och användning av uppvärmnings-/fasthållningsanordningen granskades och godkändes av den lokala institutionella djurvårdskommittén (IACUC).
1. Förberedelse
<ol><li>Acklimatisera djur i bostadsmiljön i minst 1 vecka och tillåt mat och vatten ad libitum. OBS: För de flesta nya användare av denna injektionsteknik kan djurstammar med vit eller ljus päls vara att föredra eftersom svansvenerna är lätt synliga genom huden. Mörkfärgade stammar av möss (t.ex. C57BL/6) eller råttor (t.ex. Bruna Norge) har djupt pigmenterade svansar, vilket resulterar i en svag färgkontrast mot venen. Det rekommenderas starkt att nya användare får lämplig utbildning tills färdigheterna har uppnåtts.</li>
	<li>Medel för svansvektion<ol>
<li>Förbered alla testagenter och lösningar aseptiskt. Vid administrering av organismer eller cellulära material, vidta försiktighetsåtgärder under alla bearbetningssteg för att upprätthålla pyrogenfria förhållanden.</li>
		<li>Använd endast normal saltlösning (0,9% w/v natriumklorid) eller balanserade saltlösningar såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som fordon för svansvevinjektion. VARNING: Använd aldrig vatten, olja eller trögflytande lösningar på grund av den potentiella risken för kärlskador. Ett brett spektrum av pH (4,5–8,0) är acceptabelt på grund av blodets buffrande effekt och snabba blodflöden hos gnagare. Mycket sura eller alkaliska lösningar kan dock leda till onödiga vävnadsskador på injektionsstället och bör undvikas.</li>
		<li>Begränsa injektionsvolymen och injektionsfrekvensen till ett minimum. Använd de rekommenderade volymerna för möss och råttor (≤200 μL respektive ≤500 μL) vid kroppstemperatur före injektion för att minimera stressen för djuret3.</li>
		<li>Se till att varje beredning av sprutan och nålen är fri från luftbubblor i lösningen; Om bubblor finns, rensa dem helt för att förhindra risken för emboli. OBS: Vanligtvis är 1 ml sprutor med 27 G, 1/2-in nålar tillräckliga för de flesta svansveninjektioner.</li>
		<li>Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) som krävs av lokala IACUC med minst engångsklänningar eller särskilda klänningar och latex- eller nitrilhandskar. Användning av skyddsglasögon rekommenderas starkt vid injektion av svans ven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Värme- och fasthållningsanordningen<ol>
<li>Kontrollera noggrant alla komponenter före användning för att säkerställa att enheten är fri från defekter (figur 1).</li>
		<li>Initiering av uppvärmningsanordning (figur 2A)<ol>
<li>Placera värmeenheten på en ren platt bänkskiva och sätt på enheten. Se till att termostatens strömindikatorlampa är grön. Placera sängkläder i värmekammaren för att hålla området torrt och behålla värmen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inställning av fasthållningsanordningar( figur 2B)<ol>
<li>Placera fasthållningsanordningen bredvid värmeenheten och bestäm lämpliga konstorlekar för djuret. Vid behov justera manuellt basbredderna på den följsamma aluminiumkonen för att ge tillräcklig fasthållningsanordning för djuret. Alternativt kan du ersätta konen med specialmonterade modeller för att rymma möss eller råttor av varierande kroppsstorlek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Svans ven injektion
<ol><li>Justering av apparater<ol>
<li>Ställa in den interna temperaturen<ol>
<li>Ställ in termostaten vid önskad temperatur med hjälp av ratten. Se till att värmeindikatorn lyser rött och att glödlampan tänds. Övervaka den interna temperaturdisplayen noggrant medan glödlampan är tänd (uppvärmning). Termostaten inaktiverar glödlampan automatiskt när en måltemperatur har nåtts, ungefär på 10–15 minuter. OBS: Om du ställer in en temperatur som är högre än omgivningstemperaturen aktiveras värmaren. I allmänhet varierar den rekommenderade hustemperaturen under normala vivariumförhållanden, från 20 till 26 °C, medan den neutrala (dvs. behagliga) temperaturen för laboratoriemöss anses vara mellan 30 och 32 °C42. Därför rekommenderas att uppvärmningskammarens inre temperatur höjs något högre än termoneutraliteten, ungefär vid 32–36 °C. Ställ aldrig termostaten över kroppstemperaturen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placering av fasthållningsplattformen<ol>
<li>Justera konhöjden till den optimala nivån för användaren med hjälp av höjdjusteringsratten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Värmebehandling (figur 3A)<ol>
<li>När måltemperaturen har uppnåtts (32–36 °C) överför du försiktigt djuren från husburen till uppvärmningskammaren. OBS: Värmebehandling i 5–10 min är tillräcklig för att inducera vasodilatation och förbättra synligheten hos svansvener. Djur kan dock hållas säkert i den termoreglerade kammaren under hela proceduren (vanligtvis 20-30 min utan tecken på hypertermi). Värmekammaren kan säkert innehålla 4–6 möss eller en råtta.</li>
		<li>Övervaka djuret för tecken på akut värmestress (t.ex. snabb andning, letargi, hoppande flyktbeteende). VARNING: Djur som uppvisar tecken på hypertermi bör återföras till sin bur och övervakas tills de återupptar normal aktivitet före återanvändning. Om detta beror på att den inre temperaturen överskrider det optimala intervallet, se till att värmeanordningen är avstängd.</li>
	</ol></li>
	<li>Steg för injektion<ol>
<li>Lyft djuret vid svansens botten och ta bort det från uppvärmningskammaren. För in djuret på konöppningen på fasthållningsenheten. VARNING: Lyft aldrig möss från svansen; detta kan leda till allvarliga skador. Alternativa hanteringsmetoder bör användas för överviktiga eller gravida möss28.</li>
		<li>När djuret griper tag i konens bortre kant med sina framben, dra försiktigt svansen bakåt och passera svansen genom den öppna slitsen. Säkra djurets bak ände vid konens botten med ett bakben som sticker ut från konen så att sido venen visas i ett läge av 12 klockan. Båda bakbenen kan stickas ut eftersom det finns två laterala vener, en på varje sida (figur 3B).</li>
		<li>Greppa svansen i mitten till två tredjedelars längd med den icke-dominerande handen mellan tummen och pekfingret, vilket sätter liten spänning på sidovenen för att bibehålla svanspositionering och vasodilatation. OBS: Ökad synlighet av de dilaterade venerna genom värmebehandling gör det möjligt för användaren att snabbt bestämma ett injektionsställe för bästa resultat (figur 4).</li>
		<li>Torka av injektionsställets hud med en gasvävssvamp eller platta fuktad med 70% alkohol. Rengör så försiktigt och snabbt som möjligt för att undvika irritation i svansen. OBS: Detta förfarande kan utelämnas efter den institutionella IACUC:s gottfinnande.</li>
		<li>Håll sprutan med den dominerande handen och placera nålen parallellt med svansen. För in nålen mot blodflödets riktning, vrid upp i 10–15° vinkel(figur 5A–B)och för vidare in i venens lumen genom att penetrera 2–4 mm (figur 5C–D). Injicera långsamt lösningen. OBS: Om injektionen lyckas ska inget motstånd på kolven kännas och vätskan kan ses röra sig genom venen. Vid motstånd eller vita blåsor ovanför injektionsstället, ta bort nålen och försök med en andra injektion på en plats ovanför den ursprungliga nålplaceringen. Försök inte injicera under det första injektionsstället eftersom vätskan kommer att frigöras genom det ursprungligastället. Om injektionen av en lateral ven misslyckas, flytta djuret till motsatt sida och gör fler försök på kontralateral venen. Det maximala antalet försök beror på var man startar injektionsförsöket längs venen och svullnaden som kan uppstå vid missade försök. Konsultera de institutionella IACUC-reglerna för felinjektioner och tillhörande skador.</li>
		<li>Ta bort nålen och tryck hårt med tummen för att förhindra återflöde av den injicerade lösningen och/eller blodet. Fortsätt att applicera skonsam kompression med ren gasväv/våtservett eller vävnad tills blödningen har upphört (bild 6).</li>
		<li>Sätt tillbaka djuret i buret och övervaka i minst 5 minuter. Se till att djuret återupptar normal aktivitet utan ytterligare blödning.</li>
	</ol></li>
</ol>3. En murinmodell av svampblodomloppsinfektion och sepsis
<ol><li>Musstammar<ol>
<li>Acklimatisera kvinnliga schweiziska Webster utraslade möss vid 6 veckors ålder enligt institutionellt rekommenderade riktlinjer. Alternativt kan du använda inavlade/genetiskt modifierade stammar (t.ex. C57BL/6-bakgrund) för detta protokoll med modifierad inokula (se ANMÄRKNING). OBS (se Diskussion för detaljer): Svansvener av möss med mörk päls är ofta mindre synliga än de med ljusare päls på grund av den djupt pigmenterade svansen (Figur 4). Det finns varierande mottaglighet för svamp sepsis/dödlighet bland olika musstammar. Användning av andra musstammar än schweiziska Webster kan kräva ytterligare protokolloptimering genom att överväga relevanta faktorer (t.ex. genetisk bakgrund, ålder, kön, kroppsstorlek) som kan påverka värd immunstatus. Till exempel kräver en dödlig utmaning hos C57BL/6 möss vanligtvis högre inokula (upp till 10x) för att uppnå den dödlighetsnivå som ses hos schweiziska Webster-möss.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroorganismer<ol>
<li>För en dödlig utmaning (sepsis), dra frysta lager av Candida albicans stam DAY185 (eller stammar av val) på Sabouraud dextrose agar och inkubera vid 30 °C i 2 dagar.</li>
		<li>Överför en enda koloni till 10 ml jästextrakt-pepton-dextrosbuljong och kultur till den stationära tillväxtfasen i 18 timmar vid 30 °C med skakningar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculum-lösningar<ol>
<li>På dagen för en dödlig utmaning, samla buljongkulturen och tvätta pelleten 3 gånger genom centrifugering (800 × g) i steril PBS.</li>
		<li>Identifiera livskraftiga jästceller genom trypan blå färg exkludering och räkna upp med hjälp av en hemocytometer. Justera cellkoncentrationen till 1 x 106 celler/ml i steril PBS vid rumstemperatur. OBS: Varje djur kommer att få 100 μL av inokulatlösningen. Förbered en övervolym av inokulat (>500 μL) för att möjliggöra potentiell förlust under injektionsproceduren. Det slutliga inokulatet är 1 x 105 celler per mus. Inokulatvolymen kan ökas upp till 200 μL genom att cellkoncentrationen justeras i enlighet därmed. VARNING: Svampinokulatlösningen måste förvaras i rumstemperatur före injektion. Uppvärmning av inokulatlösningen till kroppstemperaturen kan inducera en morfologisk förändring från jästceller till hyphae. Kontrarily, bolus i.v administrering av kalla lösningar kan snabbt sänka kroppstemperaturen hos djuret och bör undvikas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intravenös inokulering<ol>
<li>Värm djuren och framkalla vasodilatation genom att följa procedurerna i avsnitt 2.</li>
		<li>Injicera 100 μL av inokulatlösningen i svansvenen med en 1 ml spruta med en 27 G, 1/2-in nål.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Övervakning efter inokulering<ol>
<li>Övervaka djuren för följande tecken på sepsisinducerad sjuklighet: i) pälsaspekt (t.ex. slät, ruffled), ii) aktivitet (t.ex. rörelse fritt, svarar ej), iii) hållning (t.ex. hunched, styv), iv) beteende (t.ex. långsam, ingen omlokalisering), v) bröströrelser (t.ex. normal andning, dyspné), vi) ögonlock (t.ex. öppna, stängda)43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sepsis poängsättning<ol>
<li>Poängsätta den observerade sjukligheten enligt en modifierad mus klinisk bedömningspoäng för sepsis (M-CASS) i en fyragradigt graderingsskala från 0 till 3 i varje kategori: 0, normal; 1, mild; 2, måttlig; 3, svår43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valfritt protokoll: Vaccination mot svamps sepsis<ol>
<li>Fjorton dagar före en dödlig utmaning, inokulera möss med Candida dubliniensis stam Wü284 eller försvagade C. albicans stammar, såsom Δefg1/Δcph1 mutant (1x105 celler per mus), som beskrivs i avsnitt 3.2-3.4 i stället för C. albicans DAG185.</li>
		<li>Genomföra en dödlig utmaning hos de vaccinerade mössen, enligt beskrivningen i avsnitten 3.2–3.4, och övervaka tecken på sepsisinducerad sjuklighet som beskrivs i avsnitten 3.5–3.6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Konsekvent och exakt dosering är nyckelkrav för experimentell tillförlitlighet i djurmodeller. Detta är särskilt viktigt vid i.v. administrering där systemisk biotillgänglighet av injicerade medel är betydligt högre/snabbare än med andra administreringsvägar3. Således kan fel i svansveininjektion ha en skadlig inverkan på studieresultaten. Historiskt sett har intraperitoneal (dvs. injektion), snarare än i.v., varit den vanligaste metoden för systemisk åtkomst hos gnagare på grund av teknisk enkelhet och bekvämlighet. Administreringsvägar blir dock mer avgörande när man översätter prekliniska avläsningar från djur till kliniska miljöer. Därför finns det ett behov av kontinuerlig förbättring av gnagareprotokoll som kan underlätta framgångsrik svansveinjektion.
Den viktigaste utvecklingen i det nuvarande protokollet är den innovativa termoreglerade uppvärmningsanordningen som möjliggör effektiv induktion av vasodilatation hos gnagare, vilket dramatiskt förbättrar synligheten för svansvener och nåljustering. Uppvärmningsmetoder som är dåligt termoreglerade (t.ex. lampor), tokiska vasodilatatorer eller hudirriterande ämnen (t.ex. xylener) är inte bara opålitliga, utan är också osäkra för djuret och börundvikas 44. I motsats till andra konventionella metoder, såsom att fördjupa svansen i varmt vatten, kan autoregleringsförmågan hos denna enhet säkert konditionera flera djur samtidigt. Dessutom förstärks detta protokoll ytterligare genom att använda den optimalt utformade fasthållningsanordningen och möjliggöra snabb och säker immobilisering av djuret i ett läge som bäst visar den laterala svans venen.
De transparenta tubalformaten som ses i många nuvarande fasthållningshållare, även om de är praktiskt väl utformade, kräver mer hanteringstid med varje djur, vilket förlänger fasthållningsprocessen45. Detta kan vara mer problematiskt hos gnagarestammar med aggressiva egenskaper som erbjuder begränsat samarbete46,47. Däremot tillåter fasthållningsanordningens halvslutna konstruktur snabb positionering av djuret och hjälper till att minimera fasthållningstiden. Tillsammans påskyndar det strömlinjeformade protokollet med hjälp av det innovativa, mycket optimerade uppvärmnings-/återhållsamhetssystemet injektionsproceduren, vilket möjliggör snabb och effektiv dosering av stora grupper av djur. I vårt laboratorium slutför vi vanligtvis en hel injektionsprocedur på 30 möss från värmebehandling till övervakning efter injektion inom 1 timme med detta protokoll.
Trots de avancerade funktionerna har denna enhet några uppenbara nackdelar: den första är kostnaden för enheten och rutinmässigt utbyte av glödlampa i uppvärmningskammaren. Förutom injektionernas effektivitet och hastighet är dock enheten hållbar för upprepad användning och kompatibel med de vanligaste desinfektionsmedel, vilket möjliggör noggrann rengöring av enheten mellan användningarna. Tillsammans kompenserar detta den ursprungliga investeringen. Isituationer med begränsad arbetsyta kan en nackdel med detta protokoll vara kravet på en dedikerad bänkyta som är tillräckligt stor för att placera de två enheterna, sida vid sida, medan injektionen utförs. Men eftersom enheten kan användas brett över flera gnagareprotokoll som involverar i.v. injektioner, är det möjligt att enheten kan fungera som ett kärninstrument som liknar annan gemensam vivariumutrustning som isofluranförångare. Oavsett är de två enheterna lätt bärbara och kan buntas och stuvas undan utan användning.
Den i.v. dödliga utmaningsmodellen av murin svamp sepsis beskrivs i detta protokoll efterliknar nära C. albicans blodomlopp infektioner hos människor och har använts i stor utsträckning för att studera svamp virulens, testa effekten av svampdödande terapier och karakterisera värd immunsvar mot infektion37,39,48. För att uppnå en reproducerbar infektion är inokulering via svansvevinjektion det viktigaste steget i protokollet för att säkerställa korrekt leverans av organismerna i blodomloppet. Faktum är att djur reagerar mycket olika på olika nivåer av Candida, dvs. utmaningar; administrering av för låga mängder inokulat kommer att leda till oönskade spontana återhämtningar, medan djur som får för höga doser kommer att duka under i förtid. Det specifika fönstret av inokulatstorlekar för en given organism för att inducera en konsekvent nivå av sepsis/dödlighet beror till stor del på både svampstammar och musstammar.
Det nuvarande protokollet med schweiziska Webster möss vid inokulat av 1 x 105 vilda typ C. albicans reproducibly inducerad uppkomsten av sepsis sjuklighet inom 1 dag, följt av progressiv dödlighet som resulterar i 100% dödlighet med 5-7 dagar. Däremot leder inokula högre än 1 x 105 vanligtvis till accelererade dödsfall (dvs. 1-2 dagar vid 1 x 106, 3-4 dagar vid 5 x 105), och de som är lägre än 1 x 105 är subletala. I linje med många rapporter i litteraturen resulterar användningen avicke-albicans Candida arter i stället för C. albicans i avsevärt minskad dödlighet40,49. Dessutom kan valet av musstammar, eller till och med koloniernas ursprung, ha en betydande inverkan på infektionsutfall på grund av varierande känslighet mellan musstammar, som rapporterats avandra 39,40,41,50,51,52,53,54,55. Därför bör båda beaktas vid utformningen av experiment.
Efter en dödlig i.v. utmaning sprider sig svampceller snabbt genom blodomloppet och börjar invadera flera organ, bland vilka de mest drabbade är njurarna41. Andra organ som påverkas är hjärnan, mjälten och benmärgen48,56. Oavsett, akut sepsis är den ultimata dödsorsaken i tidig tid punkterna37. Som visas i de representativa resultaten kan sepsis svårighetsgrad kvantitativt bedömas av Mus klinisk bedömning poäng för sepsis (M-CASS) baserat på uppvisade tecken på ett sepsis villkor i utmanade djur43,57. Bland de flera surrogatmarkörerna för dödlig sepsis har hypotermi föreslagits som en kritisk prediktor för överhängande död i både klinisk och experimentell sepsis43,58,59.
Även om inga formella studier har utförts för att direkt jämföra inavlade jämfört med utraslade möss i denna modell, är data som erhållits från det nuvarande protokollet med hjälp av outbred schweiziska Webster möss exceptionellt reproducerbara i olika sepsisparametrar, trots den förmodade genetiska heterogeniteten. I allmänhet är ett mönster av dödlighet som faller inom 3-5 dagar en fast modell av akut sepsis, vilket framgår av snabb ökning av sepsis sjuklighet och nivåer av inflammatoriska markörer inom timmar efter post-lethal utmaning50,51. Under längre överlevnadstider (7–10 dagar) är dödligheten sannolikt resultatet av mikrobiell börda som leder till dödliga vävnadsskador i målorganen och centrala nervsystemet. Valet av sepsis eller mikrobiell börda kan vid behov tillämpas för att utvärdera immunfunktioner eller svar på antiinflammatoriska regimer eller svampdödande behandlingar/vacciner, som bestäms av det inokulat som används.
Förutom den i.v. dödliga utmaningsmodellen kan intra-abdominal infektion med C. albicans hos möss via en i.p. utmaning också leda till spridad candidiasis och efterföljande sepsis, även om ko-inympning med bakteriella patogenen, Staphylococcus aureus, synergistiskt ökar dödligheten jämfört med C. albicans monoinfektion51,60,61. I den i.p. dödliga utmaningsmodellen krävs betydligt högre mikrobiell inokula (1,75 x 107C. albicaner/8 x 107S. aureus per mus) för att orsaka polymikrobiell peritonit och spridning av organismerna från bukhålan i blodomloppet. På samma sätt leder gastrointestinal infektion med C. albicans hos möss som behandlats med immunsuppressiva och/eller slemhinnor till flyttning av svampcellerna till blodomloppet och resulterar i svamp sepsis62,63. Trots de distinkta inokuleringsvägarna är mekanismen för efterföljande svamp sepsis till stor del analog mellan de tre sjukdomsmodellerna, vilket innebär ett okontrollerat systemiskt proinflammatoriskt svar på Candida som leder till organsvikt37,51,61. På samma sätt, hos människor, är det denna process av värdsvaret, inte bara candidemia, som orsakar den höga sjuklighet / dödlighet i samband med hematogent spridd candidiasis förvärvad i hälso- ochsjukvårdsinställningar 64,65.
Med hjälp av den nuvarande svamp sepsis modellen visar vi här att skydd mot dödliga C. albicans infektion kan uppnås genom i.v. pre-immunization/vaccination med C. dubliniensis (avirulent) eller försvagade C. albicans mutanter, samtidig med betydande minskning av sepsis sjuklighet. Skyddet förmedlas av medfödda Gr-1+ myeloisk-härledda suppressorceller som verkar induceras i benmärgen som en form av utbildad medfödd immunitet66,67. Ansträngningar pågår för att utöka förståelsen av denna nya form av medfödda immunmedmerade skydd mot C. albicans blodomloppsinfektioner.
Sammanfattningsvis har den innovativa gnagareuppvärmnings-/fasthållningsanordningen bidragit till att främja vår förmåga att utföra i.v. injektioner av storskaliga flergruppsdjurstudier på ett effektivt och ändamålsenligt sätt. Som sådan har vi myntat termen, Mus en minut, för enheten. Enhetsspecifikationerna är tillgängliga från motsvarande författare på begäran för upphandling av en liknande enhet. De tekniker som demonstreras här kan fungera som ett användbart verktyg i gnagaremodeller som använder svansveinjektioner inom ett brett spektrum av forskningsområden.

Användningen av djurmodeller som involverar gnagare har varit en stapelvara i biomedicinsk forskning. Många inavlade och utraslade stammar, liksom genetiskt modifierade linjer, finns tillgängliga och används rutinmässigt i laboratorier över hela världen. Svansveninjektion är en av de viktigaste metoderna i gnagaremodeller som kräver intravenös (dvs. administrering av experimentella medel). I allmänhet har injektioner stora fördelar jämfört med andra administreringsvägar, såsom höga absorbanshastigheter genom att kringgå lokala vävnader och mag-tarmkanalen och hög tolerans mot lösningar av ett brett spektrum av koncentrationer eller icke-fysiologiska pH1,2,3,4. Bland andra livskraftiga i.v. rutter (t.ex. saphenous vener, retro-orbital venous sinus), anses svansvener vara det säkraste och mest lättillgängliga blodkärlet hos gnagare2,3,5,6. Därför har svans veninjektion använts i stor utsträckning i en rad gnagaremodeller inklusive infektionssjukdomarmodeller 7,8,9,transplantation av biologiska material10,11,utvärdering av prekliniska terapier12,13, och toxikologiska analyser14,15.
Konsistens och noggrannhet i dosering är ett kritiskt krav vid framgångsrika svansvesinjektioner. Överraskande, kvantitativ och kvalitativ utvärdering av svans ven injektioner i litteraturen innebär frekventa felinjektioner16,17. En studie rapporterade att tolv av trettio injektioner utförda av utbildade injektorer lämnade mer än 10% av injicerade doser i svansen18. Dessutom bör säkerheten och komforten hos det djur som får svansvesinjektioner vara ett primärt problem under proceduren. Felaktig återhållsamhet kan leda till skador och en rad stressrelaterade patologier (t.ex. viktminskning, nedsatt immunsvar) som kan införa betydande variabler i provkvalitet19,20. Dessa fel kan orsaka ökad variation i data och dålig reproducerbarhet, vilket påverkar studieresultaten negativt.
Induktion av vaskulär dilatation hos djuret är ofta nödvändigt vid utförande svansvevinjektioner på grund av kärlets lilla diameter, uppskattad till 300 μm hos möss21. Vasodilatation förbättrar synligheten av svansvener och hjälper till att uppnå optimal nål-venin justering inom venous lumen. En mängd olika metoder har rapporterats av laboratorier som att doppa svansen i varmtvatten 22, applicera värme på svansen med ett varmt draperi, lampa eller hårtork23,24, eller placera djuret i en varm miljö med en värmeplatta, inkubator eller låda i kombination med en av dessa värmekällor25. Enheterna kan antingen vara självtillverkade för specifika ändamål eller tillgängliga från kommersiella leverantörer. Många saknar dock termoregulatorisk kapacitet och om någon är enhetens temperatur dåligt underhållen och utsätts ofta för variationer i rumstemperaturen. På samma sätt är användningen av en fasthållningsanordning nödvändig för svansvesinjektioner eftersom användningen av anestesi inte rekommenderas26,27. Flera typer av laboratoriespecifika eller kommersiella fasthållningsanordningar har utvecklats. Vanligtvis placeras djuret i ett engångsrör på 50 mlkoniskt rör 4, slitsade plexiglasväggar, en tunnel eller kon28, som alla tillåter riklig exponering av svansen samtidigt som djurets rörelser begränsars. De flesta återhållsamma har dock storleksbegränsningar på grund av materialens styvhet. Dessutom verkar moderna högkomplexa anordningar, trots de praktiska och sofistikerade designerna, inte vara genomförbara för injektioner som involverar stora grupper av djur22.
Musmodeller av blodomloppsinfektion och tillhörande sepsis är ett utmärkt exempel på situationer som kräver användning av denna teknik. Bland alla mikrobiella etiologi av allvarliga kliniska sepsis, svamp sepsis är ofta ett dödligt tillstånd med dödlighet på >40% trots svampdödande terapi29. Faktum är att infektion av Candida albicans har rapporterats som den fjärde ledande orsaken till sjukhusförvärvad blodomloppsinfektion (candidemia)30,31. Vid candidiasis inom buken kan mikroorganismer i mag-tarmkanalen spridas via blodomloppet och orsaka polymikrobiell sepsis med en ännu störredödlighet 32,33,34. Som de flesta nosokomial candidemia fall framträder från förorenade centrala linjen katetrar eller indwelling medicintekniskaprodukter 35,36, dvs inympning med C. albicans genom svans ven injektion kan nära spegla mänsklig sepsis utveckling och har varit en häftklammer metod i en mus modell av hematogenly spridas candidiasis37,38. I denna modell kan dödligheten som inträffar i dagar förlängas eller förkortas genom att justera C. albicans i.v. inokulat39,40,41.
Nyligen har vårt laboratorium utvecklat ett innovativt protokoll för en optimalt strömlinjeformad svansvenadsinjektion med hjälp av en innovativ enhet utrustad med en termoreglerad uppvärmningsenhet, i kombination med en justerbar fasthållningsenhet, i ett bekvämt system. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att utföra svansvektioner på ett korrekt och i rätt tid, medan djur kan konditioneras säkert och hållas fast för proceduren med minimal nöd. De tekniker som demonstreras här, med hjälp av den avancerade uppvärmnings- och fasthållningsanordningen, skulle kunna fungera som ett användbart verktyg inom olika forskningsområden som använder gnagaremodeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain DAY185</td>
			<td>Carnegie Melon University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Aaron Mitchell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain efg1&#916;/&#916; cph1&#916;/&#916;</td>
			<td>University of Tennessee Health Sciences Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Glen Palmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida dubliniensis strain W&#252;284</td>
			<td>Trinity College, Dublin, Ireland</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Gary Moran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>551NCICr:SW</td>
			<td>Female Swiss Webster; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>556NCIC57BL/6</td>
			<td>Female C57BL/6; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 27G, &#189;-in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute)</td>
			<td>LSU Health</td>
			<td>custom order</td>
			<td>Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211584</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2469</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model

I gnagarmodeller är svansveninjektioner viktiga metoder för intravenös administrering av experimentella medel. Svansveninjektioner innebär vanligtvis uppvärmning av djuret för att främja vasodilatation, vilket hjälper till att både identifiera blodkärlen och placera nålen i kärllummen samtidigt som djuret hålls fast ordentligt. Även om svans ven injektioner är vanliga förfaranden i många protokoll och anses inte vara mycket tekniska om utförs korrekt, exakta och konsekventa injektioner är avgörande för att erhålla reproducerbara resultat och minimera variabilitet. Konventionella metoder för att inducera vasodilatation före svansveninjektioner beror i allmänhet på användningen av en värmekälla som värmelampa, elektriska/uppladdningsbara värmedynor eller förvärmt vatten vid 37 °C. Trots att dessa verktyg är lättillgängliga i en standardlaboratoriumsinställning lider de uppenbarligen av dålig/begränsad termoreglerande kapacitet. På samma sätt, även om olika former av fasthållningsanordningar är kommersiellt tillgängliga, måste de användas noggrant för att undvika trauma för djuren. Dessa begränsningar av de nuvarande metoderna skapar onödiga variabler i experiment eller resulterar i varierande resultat mellan experiment och/eller laboratorier.
I den här artikeln demonstrerar vi ett förbättrat protokoll med hjälp av en innovativ enhet som kombinerar en oberoende, termiskt reglerad, värmande enhet med en justerbar fasthållningsenhet i ett system för effektiv strömlinjeformad svansveinjektion. Exemplet vi använder är en intravenös modell av svamp blodomlopp infektion som resulterar i sepsis. Uppvärmningsapparaten består av en värmereflekterad akryllåda installerad med en justerbar automatisk termostat för att bibehålla den inre temperaturen vid en förinställningströskel. På samma sätt kan bredden och höjden på konhållarapparaten justeras för att säkert rymma olika gnagarestorlekar. Med enhetens avancerade och mångsidiga egenskaper kan tekniken som visas här bli ett användbart verktyg inom en rad forskningsområden som involverar gnagaremodeller som använder svansveinjektioner.

Temperaturen inuti värmekammaren detekteras kontinuerligt av den inre sensorn och regleras automatiskt av termostaten. Först placerades termostatens manöverrat vid 78, 85, 90 eller 95 °F (26, 29, 32 eller 95 °C) för att välja inställda temperaturer. När värmaren aktiverades (Figur 7, gula prickar), ökade värmeutsläppet från glödlampan snabbt den inre temperaturen under de första 5-15 min, beroende på den inställda temperaturen. Värmaren inaktiverade glödlampan om den detekterade inre temperaturen överskred den inställda temperaturen (grå prickar). De ursprungliga topptemperaturerna bör stiga till 5–7 °C över de inställda temperaturerna i alla grupper för att kompensera temperaturförlusten under djuröverföringen. Därefter fortsätter enheten att upprepa värmecykeln automatiskt och håller värmekammaren vid den inställda temperaturen.
Ett exempel på experimentella data som erhållits genom framgångsrika svansvesinjektioner med det aktuella protokollet visas i figur 8. I en musmodell av candidiasis i blodomloppet som resulterade i sepsis orsakade en i.v. utmaning med Candida albicans (1 x 105 celler per mus) hos schweiziska Webster-möss en snabb sepsis och spridning av organismerna, vilket ledde till hög dödlighet inom 3-4 dagar (öppna punkter) (Figur 8A). Däremot kan djur skyddas från sepsis genom tidigare i.v. pre-immunisering/vaccination med en avirulent jäststam, Candida dubliniensis, uppnå >95% överlevnad efter den dödliga i.v. utmaningen med virulent C. albicans (fasta prickar). Dessa resultat i progressiv dödlighet jämfört med vaccinmedierat skydd erhölls reproducerbart i fyra oberoende experiment (kompletterande figur 1). Liknande skydd skulle kunna uppnås med andra avirulent jäststammar såsom försvagade C. albicansmutanter (Δefg1/Δcph1) (data som inte visas). Sepsis kan också övervakas och korreleras till dödlighet; De ovaccinerade djuren med dödlig infektion hade en signifikant ökning av sepsisinducerad sjuklighet, medan den vaccinerade gruppen uppvisade minimala symtom efter den dödliga utmaningen (figur 8B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig01.jpg"> Figur 1: Beskrivning av gnagaruppvärmnings- och fasthållningsanordningen. a) visar värmeanordningens yttre sikt, som består av
<ol><li>Termostatskydd – lyft uppåt vid handtaget för att exponera termostaten</li>
	<li>Elektriskt hölje – förseglas permanent för skydd</li>
	<li>Kammarlock – lyft uppåt under djuröverföring till/från</li>
	<li>Värmekammare – avtagbar, täck golvet med sängkläder före användning</li>
	<li>Fasthållningsanordning – förvaringsbar med värmeanordningen utan användning</li>
	<li>Strömbrytare – inline vippbrytare för huvud på/av-funktioner</li>
	<li>Nätsladd – spänning/ström: 120V/10A</li>
</ol>B) visar uppvärmningsanordningens inre
<ol><li>Glödlampa – ljuseffekt vid 100 watt</li>
	<li>Glödlampans skyddssköld – avtagbar för utbyte av glödlampa</li>
	<li>Temperatursensorsond – placerad inuti kammaren</li>
	<li>Intern temperaturtermometer – placera inuti kammaren för övervakning av temperaturen</li>
</ol>C) visar komponenter i värmeanordningens termostat:
<ol><li>Termometer för intern temperatur</li>
	<li>Termostat – reglerar värmaren automatiskt</li>
	<li>Manöverspak för börvärde – minimum/maximum: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)</li>
	<li>Termostateffektindikator – grönt ljus indikerar normal drift</li>
	<li>Termostatvärmare indikator – lyser rött under uppvärmningscykeln</li>
</ol>D) visar komponenter i fasthållningsanordningen
<ol><li>Kon – följsam aluminiumplåt avsedd för fasthållningsanordning för gnagare</li>
	<li>Svanskanal – formad för att möjliggöra jämn positionering av svansen</li>
	<li>Konlyftplattform – ger robust lyft av konbasen</li>
	<li>Höjdjusteringsratt – utformad för manuell höjdjustering</li>
	<li>Saxuttag – höjdintervall från 45–140 mm (1,77–5,52 tum)</li>
	<li>Stödplatta – installerad med gummifötter för att ge <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig01large.jpg" target="_blank">stabilitet Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig02.jpg"> Figur 2: Gnagaruppvärmnings- och fasthållningsanordningen. A)Före användning placeras de två delarna av anordningen sida vid sida på en ren bänkskiva. (B) När värmeanordningen är påslagen aktiverar termostaten värmaren. Glödlampan förblir tänd och avger värme tills värmekammaren har nått den inställda temperaturen. Värmeanordningen upprepar automatiskt värmecykeln för att bibehålla den inre temperaturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig03.jpg"> Figur 3: Möss (C57BL/6) placerade i värme- och fasthållningsanordningen. A)Möss som får värmebehandling för vasodilatation. Djuren (4–6 möss per behandling) överförs från sin inhysningsbur till enhetens värmekammare och värmebehandlas i minst 5–10 min. (B) En mus som hålls fast för svansvevinjektion. Musen överförs från värmekammaren till konöppningen på fasthållningsanordningen med svansen som passerar genom den öppna slitsen. Musen dras försiktigt bakåt till konens bortre kant tills svansens botten når spetsen på konen. När djuret dras mot konens botten med en mild sidorotation placeras ett bakben uppåt så att det sticker ut från den öppna slitsen så att sidosvans venen kan placeras klockan 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig04.jpg"> Figur 4: Identifiering av laterala svansvener hos möss. A)Svansen på en obehandlad schweizisk Webster-mus. Musen placeras i fasthållningsanordningen utan föregående värmebehandling för vasodilatation. Den laterala svans venen kan identifieras som ett tunt mörkt kärl som rör sig under huden. (B) Svansen på en schweizisk Webster-mus som behandlats med uppvärmningsanordningen i 10 minuter. Den värmebehandlade musen är fasthållen för svansvektion. Den laterala svansvenen är lätt synlig genom huden på grund av den förstorade kärlets diameter inducerad genom vasodilatation. C)Svansen på en C57BL/6-mus som behandlats med värmeanordningen i 10 minuter och som hålls fast för injektion av svans ven. Vasodilatation förbättrar synligheten av svansvenen genom den djupt pigmenterade huden även om venen inte är lika lätt synlig som hos de ljusa schweiziska Webster-mössen på grund av en svag färgkontrast mot venen. Röda pilar betecknar platsen för den laterala svans venen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig05.jpg"> Figur 5: Svansvektion utförd hos värmebehandlade möss (Swiss Webster). (A–B) Nålinsättning i laterala svans venen på injektionsstället. Nålen (27 G, 1/2-in) är placerad parallellt med svansvenen med avfasningen upp och riktad mot blodflödet och insatt. (C–D) Nålplacering i svans ven och injektion. Nålens spets är ytterligare avancerad 2-4 mm in i venens lumen. Tummen är placerad på sprutans kolv, och önskad volym avs lämnas med långsamt och stadigt tryck. Ovala cirklar indikerar injektionsställen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig06.jpg"> Figur 6: Förfarande efter injektion. A)Ett blödningsområde på injektionsstället. Blödning och återflöde av den injicerade lösningen sker omedelbart efter borttagning av nålar. Detta kan minimeras genom att applicera fast komprimering på injektionsstället med tummen. B)Blodproppsbildning på injektionsstället. Skonsam kompression med ren gasväv/våtservett underlättar blodkoagulering på injektionssåret. Pilar betecknar injektionsställen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig07.jpg"> Figur 7: Värmekammarens inre temperatur under användning. Uppvärmningsanordningen aktiverades för uppvärmning vid de angivna inställda temperaturerna. Enhetens uppvärmningskammare övervakades för den inre lufttemperaturen och värmecykler (glödlampa på / gula prickar, av / grå prickar) registrerades över 45 min. Det orangea området anger det optimala temperaturområdet för induktion av vasodilatation hos gnagare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig08.jpg"> Figur 8: Sepsisdödlighet kontra vaccinmedierat skydd efter en dödlig utmaning med Candida albicans. Möss (8 veckor gamla schweiziska Webster honor) vaccinerades intravenöst med avirulent levande Candida dubliniensis Wü284 (Cd), följt av en dödlig intravenös utmaning med vilda typ C. albicans DAG 185 (1 x 105 celler per mus) 14 dagar senare. A)Dödligheten bedömdes under 10 dagar efter den dödliga utmaningen. (B) Djur övervakades för sepsis sjuklighet och poäng enligt en modifierad mus klinisk bedömning poäng för Sepsis (M-CASS)43. Data är kumulativa av 4 oberoende experiment med 10 möss per grupp och analyseras med hjälp av Mantel-Cox log-rank test. p < 0.0001. SEM, standardfel av medelvärdet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande figur 1: Reproducerbarhet av sepsisdödlighet och vaccinmedierad överlevnad från en candida albicanutmaning i blodomloppet. Varje panel representerar data från fyra oberoende experiment som ingår i ett kumulativt resultat som visas i figur 8A. Varje experiment utfördes med 10 möss per grupp och analyserades med hjälp av Mantel-Cox log-rank test. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. p < 0.0001. p < 0,01. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61961/supfig01.jpg" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här siffran.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Här presenterar vi en effektiv och effektiv metod för gnagare svans ven injektioner med hjälp av en unikt utformad uppvärmning / fasthållningsanordning. Genom att effektivisera initieringen av vasodilatation och fasthållningsprocesser tillåter detta protokoll exakta och i rätt tid intravenösa injektioner av stora grupper av djur med minimal nöd.

En modern uppvärmnings- / fasthållningsanordning för effektiva svansvetinjektioner i en murin svamp sepsis modell

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon ascendens Stent peritonit (Casp) - en standardiserad modell för polymikrobiella buken Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal Ligation och Punktering-inducerad Sepsis som en modell för att studera Autophagy i möss

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

En musmodell av grupp B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Stenos av Inferior Vena Cava: en murin modell av djup ventrombos

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Djup ventrombos som induceras av Stasis hos möss som övervakas av högfrekvent ultraljud

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Avbildning av reaktiva syreradikaler i en murin sår modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

En kontrollerad musmodell för Neonatal polymikrobiella Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...