Name: cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology
Uploaded: 2021-01-23T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology at JoVE.com

Un ringraziamento speciale a Nat Johnston per la registrazione e l'editing del video.
Poonam Sharma è stata sostenuta dall'Università di Newcastle con borse di studio UNIPRS e UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050). Carmine Gentile è stato supportato da un UTS Seed Funding, dall'arcidiocesi cattolica di Sydney Grant for Adult Stem Cell Research e da una Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

NOTA: le macchine hiPSC-C utilizzate per questo protocollo sono disponibili in commercio. Si prega di chiedere l'approvazione del comitato etico umano istituzionale prima di iniziare questo lavoro, se necessario.
1. Fibroblasti cardiaci umani e placcatura e crescita della coltura cellulare endoteliale
<ol><li>Scongelare i crioviali contenenti HHCF e HCAEC in un bagno d'acqua a 37 °C per un minuto.</li>
	<li>Spostare i criooviali sotto un armadio sterile per la biosicurezza a flusso laminare classe 2.</li>
	<li>Raccogliere 1 ml di sospensione cellulare dai crioviali utilizzando una punta di pipetta da 1000 μL e aggiungere in un tubo da 15 ml contenente 7 ml di mezzo fibroblasto cardiaco umano per gli HTF e 7 ml di mezzo di crescita Endo meso umano per gli HCAEC. NOTA: Per raccogliere la maggior parte delle cellule da ogni crioviale, sciacquarle due volte con 1 ml di mezzo di coltura dallo stesso tubo da 15 ml.</li>
	<li>Mescolare delicatamente le sospensioni cellulari.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni cellulari in contenitori di coltura T75 separati utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo 18 ore, aspirare il mezzo da entrambi i contenitori di coltura e sciacquarli una volta con soluzione salina tamponata di fosfato sterile (PBS) per rimuovere le cellule congelate medie e morte.</li>
	<li>Sostituire pbs con 7 ml di mezzo di coltura appropriato per ogni pallone di coltura e incubare a 37 °C.</li>
	<li>Esaminare regolarmente l'espansione e la vitalità cellulare e sostituire i supporti a giorni dall'altro fino a quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza.</li>
</ol>2. placcatura e crescita della cultura iCM
<ol><li>Pre-ricoprire due contenitori di coltura T25 con 2 mL di PBS contenenti 40 μg/mL di fibronectina (FN) e incubare a 37 °C, 5% CO2 per almeno 4 ore.</li>
	<li>Dopo 4 ore, raccogliere un crioviale contenente iMM e posizionare in un bagno d'acqua a 37 °C per 4 minuti.</li>
	<li>Spostare il crioviale sotto un armadio sterile per la biosicurezza a flusso laminare classe 2.</li>
	<li>Trasferire delicatamente gli iMM dal crioviale a un tubo di centrifuga sterile da 50 ml utilizzando una punta di pipetta da 1 ml.</li>
	<li>Risciacquare gli iMM vuoti crioviali con 1 mL di mezzo di placcatura a temperatura ambiente per recuperare eventuali cellule residue. Trasferire l'1 ml di risciacquo medio placcante dal tubo di centrifuga crioviale di 90 secondi al tubo di centrifuga da 50 ml contenente la sospensione cellulare iCM. NOTA: Ruotare delicatamente il tubo aggiungendo il mezzo per mescolare completamente la soluzione e diminuire lo shock osmotico sulle celle scongelate.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 8 ml di mezzo di placcatura a temperatura ambiente al tubo di centrifuga da 50 ml. Aggiungere i primi 1 mL dropwise su 30 - 60 s. Quindi, aggiungere il volume rimanente nei successivi 30 s. Ruotare delicatamente il tubo di centrifuga aggiungendo il mezzo di placcatura. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo di centrifuga da 50 ml invertendo 2 - 3 volte (evitando scosse o vortici vigorosi).</li>
	<li>Eseguire immediatamente il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro e determinare la densità cellulare vitale (in cellule/ mL).</li>
	<li>Prendere i contenitori T25 pre-rivestiti FN e aspirare la soluzione FN-PBS senza lasciare asciugare i contenitori. A ciò si aggiunge il volume di semina degli iMM (1,6 x 106 iMM vitali in mezzo di placcatura a temperatura ambiente da 8 mL).</li>
	<li>IMM della cultura nell'incubatore per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Scongelare il mezzo di manutenzione durante la notte a 4 °C al giorno prima dell'uso.</li>
	<li>Equilibrare il mezzo di manutenzione in un bagno d'acqua a 37 °C e utilizzarlo immediatamente.</li>
	<li>Dopo 2 giorni, spostare i contenitori IMM T25 sotto l'armadio per la biosicurezza.</li>
	<li>Lavare delicatamente le cellule morte e i detriti tubazionando delicatamente il mezzo di placcatura su e giù 5 volte.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di placcatura e sostituirlo con gli 8 mL del mezzo di manutenzione preri warmed. Riposizionare i contenitori T25 nell'incubatrice. Sostituire il mezzo di manutenzione a giorni diversi ed esaminare regolarmente la confluenza.</li>
</ol>3. Isolamento e conteggio delle cellule
<ol><li>Iniziare raccogliendo prima HCAEC e HTF, quindi iCM seguendo i passaggi 3.2-3.12.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura CS mescolando 10 mL di mezzo di manutenzione iMM, 5 mL di mezzo fibroblasto cardiaco umano e 5 mL di meso endo growth medium.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di coltura da ogni pallone di tessuto contenente HHCF e HCAHC e risciacquare una volta con 5 mL PBS per i contenitori T75. Rimuovere PBS.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di soluzione EDTA di tripside allo 0,25% in ogni pallone T75 e incubare per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Una volta staccate le cellule, neutralizzare immediatamente la soluzione DI EDTA di tripina con 5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni cellulari su un tubo da 15 ml e celle di centrifuga a 300 x g per 4 min.</li>
	<li>Rimuovere accuratamente il supernatante da ogni tubo. Aggiungere 1 mL di mezzo CS a ogni pellet di cella e riprerne. Tenere il tubo sul ghiaccio e contare le cellule usando Trypan Blue e un emocitometro.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di manutenzione dai contenitori di tessuto contenenti iMM e risciacquare una volta con 3 mL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di soluzione EDTA di tripside allo 0,25% a ciascun pallone T75 e incubare a 37 °C, 5% CO2. Controllare le celle ogni minuto fino a staccarsi.</li>
	<li>Una volta che le cellule si staccano, neutralizzare immediatamente la soluzione DI EDTA di tripina con 4 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni cellulari su un tubo da 15 ml e centrifugarle a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere accuratamente il supernatante da ogni tubo. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura al pellet cellulare e riprenosirlo. Tenere il tubo sul ghiaccio e contare le cellule usando Trypan Blue e un emocitometro.</li>
</ol>4.CS generazione e crescita
<ol><li>Mescolare iCM, HTF e HCAEC in rapporto 2:1:1 placcando 10.000 iCM, 5.000 HTF e 5.000 HCAEC per coltura di caduta sospesa contenente 20 μL di mezzo CS. Regolare il volume finale per il numero totale di CS.</li>
	<li>Pipetta 20 μL di sospensione cellulare in ogni pozzo della piastra HDC a 384 pozza, manualmente o utilizzando una pipetta robotica multicanale per la movimentazione automatica dei liquidi.</li>
	<li>Pipetta 1,5 mL di PBS sterile in ciascun lato del canale attorno alla piastra di caduta sospesa per evitare l'essiccazione dei CS. Incubare la piastra HDC a 37 °C.</li>
	<li>Esaminare la formazione di CS su base giornaliera fino a quando non si osserva uno sferoide completamente formato nella maggior parte dei pozzi. Aggiungere 7,5 μL di mezzo CS a ogni bene a giorni diversi fino a formare una CS.</li>
</ol>5.CS incorporamento nei gel di collagene
<ol><li>Raccogliere i CS con una punta di pipetta da 1 mL. NOTA: È necessario tagliare la punta della pipetta a circa 0,2 cm dal bordo prima del suo uso con una superficie affilata sterile (un bisturi o una forbice) per evitare qualsiasi danno gel sferoidi incorporati durante la loro raccolta.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione CS in un tubo da 50 ml su ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min. NOTA: il pellet ottenuto deve essere conservato sul ghiaccio fino all'uso.</li>
	<li>Preparare una soluzione di gel di collagene (100 μL / bene per 30 pozzi di piastra di 96 po ') sul ghiaccio usando collagene della coda di ratto e mezzo CS in un rapporto 3:7.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante dal tubo contenente CS.</li>
	<li>Mescolare i CS pelletati all'interno della soluzione di gel di collagene.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL/mL di idrossido di sodio da 5 mM alla sospensione del gel di collagene CS e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Trasferire 100 μL di gel di collagene CS su un fondo piatto chiaro 96 micropia piastra di polistirolo nero e incubare a 37 °C per 30 min.</li>
</ol>6. Misure di vitalità e tossicità delle CS trattate con DOX
<ol><li>Dopo 30 minuti raccogliere la piastra del pozzo 96 dall'incubatore</li>
	<li>Preparare un DOX da 10 μM (basato su un protocollo precedentemente stabilito per la morte cellulare in CSs14). NOTA: Per testare potenzialmente altri agenti che possono proteggersi da HF nei CS, generare soluzioni contenenti DOX + Agente A, B, ecc.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzioni contenenti DOX e/o altri agenti ad ogni pozzo. Le impostazioni cultura di controllo contengono supporti senza DOX.</li>
	<li>Incubare la piastra per 18 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno seguente, raccogli le soluzioni di stoccaggio dei reagenti di colorazione Live / Dead e consenti loro di scongelarsi sul ghiaccio al buio in un armadietto di biosicurezza.</li>
	<li>Preparare una soluzione contenente macchia di Hoechst, 4 μM di omodimero di etidio e 2 μM calcein-AM.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di macchia di Hoechst, calceina-AM/soluzione omodimero di etidio in ogni pozzo.</li>
	<li>Misurare la fluorescenza in ogni pozzo a 645 nm per l'omodimero di etidio e a 530 nm per la calceina-AM, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiacpia multimodale.</li>
	<li>Trasferire le misurazioni della fluorescenza in Graphpad PRISM (o in un software equivalente per l'analisi statistica).</li>
	<li>Usa il software GraphPad Prism per l'analisi dei dati e le statistiche.</li>
	<li>Per il controllo di qualità, controllare al microscopio a epifluorescenza la colorazione dei nuclei, insieme alla calceina-AM e all'omodimero dell'etidio.</li>
</ol>7.CS della funzione contrattile
<ol><li>Raccogliere la micropiatta come preparato al passaggio 5.8.</li>
	<li>Accendere il computer contenente il software IonOptix per un rilevamento dei bordi basato su video, l'interfaccia di assistenza alla fluorescenza e lo stimolatore di campo MyoPacer.</li>
	<li>Posizionare un nuovo slittamento di copertura sulla piattaforma porta tessuto e assemblare il bagno d'acqua con elettrodi.</li>
	<li>Raccogliere delicatamente i CS dai gel di collagene utilizzando una punta della pipetta da 1 ml tagliata a 0,5 mm dal bordo e trasferirli su un tubo di falco. Aggiungere il supporto a CS per evitare l'essiccazione dei CS. Trasferire CS (uno alla volta) con pochi μL di supporti sul palco del sistema IonOptix.</li>
	<li>Selezionare il CS da analizzare impostando i picchi sul lato sinistro e destro di CS utilizzando il software IonOptix.</li>
	<li>Utilizzate l'analizzatore di movimento basato su computer per tenere traccia del movimento dei bordi CS. NOTA: Normalmente, la contrattilità viene misurata in % di accorciamento cellulare o in % di accorciamento frazionato. In questo caso, abbiamo misurato % accorciamento sferoide.</li>
	<li>Stabilizzare sia i picchi che regolano la soglia che le opzioni dei bordi dal computer.</li>
	<li>Esporre i CS a frequenze e tensioni diverse (0,3, 0,6, 1, 2 e 3 Hz) e tensioni (1, 2, 3 e 5 V) utilizzando lo stimolatore di campo myopacer.</li>
	<li>Registrare l'accorciamento dello sferoide con le variazioni di lunghezza CS dei CS trattati con DOX e non trattati. Analizzare i dati utilizzando il software Soft-Edge e la media per ogni CS.</li>
</ol>8. Microscopia dei CS: fissazione e immunoetichettatura
<ol><li>Raccogliere la piastra del pozzo 96 dopo 30 minuti (come preparato nel passaggio 5.8) e fissare i CS in paraformaldeide al 4% (PFA) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere pfa e risciacquare tre volte con PBS contenente 0,01% di azide di sodio (PBSA).</li>
	<li>Rimuovere PBSA.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di PBSA contenente lo 0,02% di Tritone-X-100 ad ogni pozzo per 30 minuti su uno shaker. NOTA: Questo passaggio permeabilizza i CS per una migliore infiltrazione di anticorpi.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di albumina di siero bovino al 3% in soluzione PBSA per 60 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Questo passaggio blocca il legame anticorpale non specifico nei CS.</li>
	<li>Preparare una soluzione contenente 10 μg/mL di anticorpi anti-umani del topo primario contro CD31 diluiti in soluzione di blocco.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale primaria ad ogni pozzo e incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker.</li>
	<li>Risciacquare la piastra tre volte con PBSA per 20 minuti a temperatura ambiente su una piastra a dondolo.</li>
	<li>Preparare una soluzione contenente la macchia di DNA hoechst e 10 μg/mL di anticorpo anti-topo dell'asino secondario coniugato Cy3 diluito in soluzione di blocco.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale secondaria contenente macchia di Hoechst ad ogni pozzo e incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker. NOTA: Coprire la piastra con un foglio di alluminio da questo punto in poi.</li>
	<li>Risciacquare la piastra tre volte per 20 minuti con PBSA a temperatura ambiente su una piastra a dondolo.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di mezzo di montaggio Vectashield ad ogni pozzo.</li>
	<li>CS delle immagini al microscopio confocale a scansione laser. Eseguire sessioni ottiche lungo l'asse Z e comprimere le immagini in un unico piano focale utilizzando il software ImageJ.</li>
</ol>

<ol>
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Dal punto di vista dello sviluppo, una corretta formazione della rete vascolare è fondamentale per la generazione di tessuti funzionali, tra cuiil cuore umano 10,12,23,24,25,26. La considerazione per la corretta vascolarizzazione dei tessuti 3D consente lo scambio di ossigeno, fattori di crescita, molecole di segnalazione e nutrienti, prevenendo lo sviluppo della necrosi cellulare all'interno di qualsiasi tessuto più spesso di 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Attualmente disponibili modelli cardiaci 3D in vitro che presentano una rete vascolare presentano principalmente reti vascolari capillari e disorganizzate e mancano della vascolarizzazione ramificata complessa gerarchica osservata in vivo6,8,29. L'approccio alternativo per sviluppare una complessa rete di cellule endoteliali cardiache descritte in questo manoscritto presenta una migliore vitalità e funzione cellulare rispetto ai modelli esistenti(figura 1)14,22. I CS 3D in vitro modellano il cuore umano ricapitolando meglio il suo microambiente in vivo, compresi i suoi componenti molecolari, cellulari edextracellulari 14,22. La generazione di CS da cellule derivate da cellule staminali nelle gocce appese consente le loro colture in condizioni definite (ad esempio, tipi e rapporti cellulari, corretta formazione dei tessuti). Le co-colture di iCM insieme agli HHCF e agli HCAEC all'interno dei CS definiscono il crosstalk molecolare e cellulare che regola la fisiopatologia cardiaca, compresa la sua funzione contrattile e la risposta ai farmaci a concentrazioni riscontrate nel flusso sanguignodel paziente 14. A causa di queste caratteristiche uniche, i CS sono stati utilizzati per modellare la fibrosi cardiaca, una grave conseguenza dell'infarto del miocardio e dell'insufficienzacardiaca 21. I nostri studi precedenti hanno dimostrato come la presenza di cellule endoteliali e fibroblasti sia fondamentale per la ricapitolazione del microambiente vascolare nel cuore umano, consentendo la deposizione ottimale di proteine ECM derivate da fibroblasti, come laminina, fibronectina e collagene di tipo IV, localizzate in prossimità di una rete cellulare endoteliale in via di sviluppo14,21.
DOX è un noto farmaco cardiotossico che può sviluppare insufficienza cardiaca nei pazienti oncologici anche 17 anni dopo il trattamento30. Tuttavia, rimane un farmaco preferito per il trattamento della leucemia e del linfoma nelle pazienti pediatriche e il cancro al seno nelle donne30. Il trattamento DOX in CSs è stato quindi utilizzato per modellare l'insufficienza cardiaca (HF) in vitro per studiare sia i meccanismi che regolano la tossicità nei miociti cardiaci, nelle cellule endoteliali e nei fibroblasti14 sia per modellare la fibrosi cardiaca indotta da HF21. La vitalità cellulare è stata statisticamente ridotta nei CS trattati con DOX entro 24 ore se esposti al farmaco alla concentrazione riscontrata nel flusso sanguigno dei pazienti oncologici (tra 5 e 10 μM)14 (Figura 2). Studi precedenti nel nostro laboratorio hanno anche dimostrato gli effetti tossici del DOX sia sulle cellule endoteliali cardiache che sui fibroblasti attraverso l'ossido nitrico endoteliale sintasi (eNOS) utilizzando inibitori genetici e chimici di questa via di segnalazione14. L'uso di antagonisti genetici (NOS3 shRNA) e chimici (N5-(1-iminoetile)-L-ornitina, diidrocloruro o L-NIO) della via di segnalazione eNOS come bersaglio a valle del DOX ha impedito i suoi effetti tossici sia nelle cellule endoteliali cardiache che nei fibroblasti14.
L'attività contrattile all'interno dei CS è stata misurata anche grazie all'accoppiamento elettrico delle cellule cardiache quando esposte alla stimolazione potenziale di campo. Abbiamo scoperto che i CS coltivati con mezzi di controllo (DOX 0 μM) si contraggono spontaneamente e omogeneamente a una velocità di battiaggio che può essere ritmo dalla stimolazione sul campo entro 1 e 3 Hz, paragonabile a un cuore umano sano. D'altra parte, i CS trattati con DOX non seguono la stimolazione elettrica in quanto non possono contrarsi. Insieme alle misurazioni della vitalità cellulare e della tossicità utilizzando calceina-AM e omodimero di etidio, questo saggio funzionale per la funzione contrattile CS consente la valutazione dello scenario complesso tipico del cuore umano in vitro, attualmente non ottenibile con altri modelli. Rispetto alle misurazioni dell'attività contrattile di singole cellule cardiache utilizzando lo stesso sistema, non siamo in grado di visualizzare e misurare il sarcomero in CSs. Pertanto, ci siamo limitati a misurazioni di % riduzione dello sferoide nel tempo, un saggio che abbiamo dovuto sviluppare all'interno del nostro laboratorio. Mentre controlliamo il numero di cellule, co-coltura in ogni CS e quindi le dimensioni di ogni CS, utilizziamo CS con dimensioni simili che presentano effettivamente una funzione contrattile omogenea. Tuttavia, anche nel caso in cui abbiamo generato CS di dimensioni diverse, la loro attività contrattile non è modificata.
È anche importante segnalare che la natura multicellulare dei CS li rende abbastanza pesanti da localizzare in fondo al coverslip nel sistema Ion-Optix, anche nel caso in cui siano superfusi. Sulla base del fatto che i CS siedono da soli in una posizione specifica, non abbiamo bisogno di farli aderire al coverlip, al contrario di ciò che viene comunemente fatto con singole cellule cardiache nella maggior parte dei laboratori.
L'analisi microscopica dei CS macchiati di anticorpi contro la troponina cardiaca T, CD31/PECAM e PECAM (come marcatori rispettivamente per iCM, HCAEC e HHCF) ha mostrato la formazione di una rete cellulare endoteliale(Figura 1,blu). Per escludere completamente la necrosi nella parte interna dei CS, la valutazione spaziale della vitalità cellulare è stata eseguita nel nostro laboratorio mediante analisi confocale di CS macchiati di calcein-AM/etidium homodimer(dati non mostrati). Tuttavia, è importante riconoscere che i futuri sviluppi nel campo della biofabbricazione per ricapitolare meglio altre caratteristiche complesse tipiche del cuore umano in vivo, attualmente non disponibili nel modello esistente. Questi includono: i) funzione contrattile tipica dei cardiomiociti adulti; ii) flusso sanguigno e forze di pressione; iii) segnalazione paracrina; iv) risposta immunitaria, che sarà fondamentale per migliorare questo e altri modelli cardiaci in vitro6. Poiché qualsiasi altro modello mira a ricapitolare le principali caratteristiche di un tessuto sano o di uno stato di malattia, il protocollo per la generazione e l'uso di CS descritto in questo manoscritto mira ad aiutare il ricercatore ad affrontare domande specifiche, che potrebbero non essere esaustive utilizzando questo approccio. Ad esempio, il potenziale uso di cellule derivate dal paziente per la generazione di CS fornirebbe strumenti per la medicina personalizzata, attualmente non disponibile utilizzando saggi ad alta produttività comunemente disponibili per la ricerca cardiovascolare.
In conclusione, abbiamo dimostrato un modo semplice per ricapitolare meglio il microambiente cardiaco umano utilizzando cellule cardiache. Gli sferoidi cardiaci presentano una rete cellulare endoteliale che ricapitola meglio quella presente nel cuore umano rispetto alle colture monostrato delle cellule cardiache. Date le loro caratteristiche uniche, rappresentano strumenti avanzati per i test in vitro per la ricerca cardiovascolare. Studi futuri che utilizzano cellule derivate dal paziente potrebbero fornire opzioni per la medicina personalizzata e nuove terapie per prevenire e trattare meglio le malattie cardiovascolari.

Il cuore umano ha una capacità rigenerativalimitata, mentrele malattie cardiovascolari (CVD) rimangono la principale causa di morte in tutto il mondo nonostante i recenti progressi nell'ingegneria tissutale e nelle tecnologie delle cellule staminali 1 . La necessità di nuove terapie tra cui approcci molecolari e cellulari per riparare un cuore danneggiato o per evitare che un cuore fallisca è uno dei principali bisogni clinici attuali per i pazienti affetti da malattiecardiache 2,3,4. L'obiettivo principale dell'ingegneria dei tessuti cardiaci è quello di fabbricare un tessuto cardiaco tridimensionale (3D) che presenti caratteristiche molecolari, cellulari ed extracellulari tipiche di un cuore umano, tra cui la sua rete vascolare e la fisiologica funzione contrattile4,5,6.
Al fine di bioingegnerizzatore e fabbricare un tessuto cardiaco umano funzionale che imita il cuore umano per applicazioni in vitro e in vivo, sono stati studiati diversi approcci tra cui tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT), fogli cellulari ecolture sferoidi 7,8. Tuttavia, questi tessuti non riescono a ricapitolare il microambiente 3D ottimale tipico del cuore umano e il loro potenziale utilizzo per i pazienti CVD non può tradurre direttamente dal banco alcapezzale 7. Questo perché non ricapitolano la biologia complessa, la morfologia e la fisiologia dei tessuti cardiaci in vivo9. Una delle principali sfide nell'ingegneria dei tessuti cardiaci include lo sviluppo di una rete vascolare gerarchica all'interno del tessuto cardiaco bioingegnerato, poiché qualsiasi tessuto di diametro superiore a 200 μm sviluppa la morte cellulare ametà 2,10. Una rete vascolare adeguatamente formata in un tessuto cardiaco umano svolge un ruolo importante per l'apporto di sangue, ossigeno e sostanze nutritive alle cellule cardiache11. Durante lo sviluppo embrionale, i capillari coronari e le arterie si formano attraverso la vasculogenesi (formazione di vasi sanguigni de novo) e l'angiogenesi (generazione di vasi sanguigni da quelli preesistenti) dalle cellule progenitrici endoteliali8,12. I fibroblasti cardiaci svolgono anche un ruolo importante nella corretta formazione della rete vascolare fornendo la matrice extracellulare ottimale (ECM) e la composizione dellacrescita 13,14.
La rete vascolare 3D dei tessuti cardiaci bioingegnergiati controlla la sopravvivenza e la funzione cellulare creando gradienti di ossigeno e nutrienti e segnalazione paracrina, come l'interazione omotipica delle cellule, l'interazione delle cellule eterotipiche, l'interazione delle cellule attraverso proteine solubili secrete e le interazioni da cellula a ECM3,10,15,16,17,18. Ciò previene la morte cellulare nel mezzo del tessuto e promuove la vitalità cellulare e la funzione fisiologica nei tessuti cardiaci bioingegnerati16,18,19.
Le colture sferoidi provenienti da cellule staminali sono state recentemente esplorate come modelli in vitro del cuoreumano 20. Per migliorare ulteriormente il microambiente cardiaco in vitro, hanno incluso l'uso di tutti i principali tipi di cellule presenti nel cuore umano, come miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti. Le colture sferoidi presentano il supporto strutturale 3D richiesto per far crescere e funzionare le cellule e possono essere utilizzate per bioingegnerare una retevascolare 14,20,21,22. In questo contesto, il nostro laboratorio ha sviluppato sferoidi cardiaci umani (CS) co-coltivando miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti a rapporti trovati nel cuore umano14. Questo modello è un'espansione del modello di sferoide delle cellule cardiache ventricolari del ratto, generato dalla co-coltivatorie delle cellule cardiache in colture di goccia appese, utilizzato per modellare la fibrosicardiaca 21. I CS umani possono essere usati come test di tossicità trattandoli doxorubicina (DOX, un agente anti-cancro usato per trattare leucemia, linfoma e cancro al seno), che è noto per indurre fibrosi cardiaca e insufficienza cardiaca (HF) anche 17 anni dopo lasua morte 14.
In questo manoscritto, descriviamo come generare CS umani co-coltivando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CRM o iMM), fibroblasti cardiaci umani (HPF) e cellule endoteliali dell'arteria coronaria umana (HCAHC) in colture di goccia appese. Al fine di utilizzare e immagini CS per test in vitro, sono incorporati in un gel di collagene. L'analisi confocale delle CS macchiate di anticorpi contro cd31, un marcatore per le cellule endoteliali, ha mostrato che queste cellule formano una rete simile a quella osservata in vivo. Per indurre HF e potenzialmente testare nuovi agenti che possono trattarlo o prevenirlo, i CS sono stati trattati con 10 μM DOX (una concentrazione riscontrata nel flusso sanguigno dei pazienti oncologici che ricevono il farmaco). Quando sono macchiati di calceina-AM e omodimero di etidio (colorazione di cellule vive e morte, rispettivamente), i CS trattati con DOX presentano una significativa diminuzione della vitalità rispetto ai CS che non hanno ricevuto il farmaco. I CS presentano anche un'attività contrattile omogenea se ritmo utilizzando la stimolazione del potenziale di campo tra 1 e 3 Hz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Secondary Antibodies</td>
			<td>Jackson Immunological Research Labs, Inc.</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>From Bovine Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac fibroblasts (HCFs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>306AK-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human coronary artery endothelial cells (HCAECs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>300K-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCF Growth medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>316-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MesoEndo Cell Growth Medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, CA, USA</td>
			<td>566177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#8211;EDTA, 0.25%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (T25)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning, New York, USA</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td>3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>HDP1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology

Nonostante diversi progressi nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, una delle principali sfide da superare rimane la generazione di una rete vascolare completamente funzionale che comprende diversi livelli di complessità per fornire ossigeno e sostanze nutritive all'interno dei tessuti cardiaci bioingegnerati. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello tridimensionale in vitro del cuore umano, noto come "sferoide cardiaco" o "CS". Questo presenta caratteristiche biochimiche, fisiologiche e farmacologiche tipiche del cuore umano ed è generato co-coltivando i suoi tre principali tipi di cellule, come miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti. I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CRM o iMM) sono co-coltivati a rapporti che approssimano quelli trovati in vivo con fibroblasti cardiaci umani (HPF) e cellule endoteliali dell'arteria coronaria umana (HCAEC) in piastre di coltura a goccia appese per tre o quattro giorni. L'analisi confocale delle CS macchiate di anticorpi contro troponina cardiaca T, CD31 e vimentina (marcatori per miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti, rispettivamente) mostra che i CS presentano una complessa rete cellulare endoteliale, simile a quella nativa trovata nel cuore umano. Ciò è confermato dall'analisi del rendering 3D di queste immagini confocali. I CS presentano anche proteine della matrice extracellulare (ECM) tipiche del cuore umano, come collagene di tipo IV, laminina e fibronectina. Infine, i CS presentano un'attività contrattile misurata come contrattilità sincreziale più vicina a quella tipica del cuore umano rispetto ai CS che contengono solo iMM. Se trattata con un agente cardiotossico anti-cancro, come la doxorubicina (DOX, utilizzata per trattare la leucemia, il linfoma e il cancro al seno), la vitalità dei CS trattati con DOX è significativamente ridotta a 10 μM inibizione genetica e chimica dell'ossido nitrico endoteliale sintasi, un bersaglio a valle del DOX negli HHCF e negli HCAEC, ha ridotto la sua tossicità in CSs. Date queste caratteristiche uniche, i CS sono attualmente utilizzati come modelli in vitro per studiare biochimica cardiaca, fisiopatologia e farmacologia.

Il protocollo descritto in questo manoscritto rappresenta un approccio alternativo per sviluppare una complessa rete cellulare endoteliale cardiaca all'interno di un tessuto cardiaco bioingegnerato con una migliore vitalità e funzione cellulare rispetto ai modelli esistenti (Figura 1). La ricapitolazione del microambiente cardiaco in vivo 3D all'interno dei CS ha promosso la loro risposta al DOX alla concentrazione riscontrata nel flusso sanguigno dei pazienti oncologici (tra 5 e 10 μM, Figura 2). I CS trattati con DOX hanno presentato una riduzione statisticamente significativa della vitalità cellulare rispetto ai CS di controllo (no DOX) entro 24 ore(Figura 2),un effetto tossico osservato nei pazienti oncologici umani anche 17 anni dopo il trattamento con il farmaco.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig01.jpg"> Figura 1. Analisi di formazione e vascolarizzazione cs. (A) Protocollo che mostra i passi per la formazione di un CS dalla coculazione di iCM, HCAEC e HFC in gocce appese. Le immagini brightfield sul lato destro mostrano la formazione progressiva di sferoidi da singole cellule in gocce appese. (B) Pile Z compresse di immagini confocali di un CS macchiate di anticorpi contro troponina cardiaca T (cTNT), PECAM e vimentina, colorazione di miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti, rispettivamente. Questa cifra è stata modificata da14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig02.jpg"> Figura 2. Vitalità e tossicità nelle CS. Analisi statistiche della calceina-AM (A) e dell'omodimero di etidio (B) fluorescenza dei CS trattati in presenza solo di mezzi (DOX 0 μM) o doxorubicina (10 μM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Questo protocollo mira a fabbricare sferoidi cardiaci 3D (CS) co-coltivando cellule in gocce appese. I CS incorporati nel collagene vengono trattati con doxorubicina (DOX, un agente cardiotossico) a concentrazioni fisiologiche per modellare l'insufficienza cardiaca. I test in vitro che utilizzano CS trattati con DOX possono essere utilizzati per identificare nuove terapie per i pazienti con insufficienza cardiaca.

Sferoidi cardiaci come tessuti cardiaci bioingegnerati in vitro per studiare la fisiopatologia del cuore umano

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Una delle principali sfide nell'ingegneria di un tessuto cardiaco umano include la sua vascolarizzazione. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello in vitro del cuore umano co-coltivando cellule trovate in vivo. Questi includono miociti cardiaci, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali cardiache.Tutte insieme, queste cellule consentono la ricapitolazione del microambiente cardiaco umano, compresi i suoi componenti molecolari, cellulari ed extra cellulari. Li usiamo nel nostro laboratorio per testare diversi farmaci alla ricerca di saggi sulla tossicità dei farmaci. Questi includono la doxorubicina, un noto farmaco cardiotossico che colpisce il cuore umano anche anni dopo il suo trattamento.Coltimo separatamente fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali e miociti prima di formare sferoidi. Per coltivare cardiomiociti, raccogliamo il flaconcino da meno 80 gradi e lo riscaldamo a 37 gradi per quattro minuti in un bagno d'acqua. Quindi spruzziamo la fiala criogenica con il 70% di etanolo e la spostiamo in un armadio di biosicurezza.Raccogliamo delicatamente la sospensione cellulare e la trasferiamo in un tubo Falcon da 15 millilitri. Raccogliamo un millilitro di mezzo di placcatura prebellico, risciacquiamo il flaconcino crio una volta e poi lo aggiungiamo al tubo Falcon da 50 millilitri, una goccia alla volta ogni quattro secondi. Mentre aggiungi il mezzo di placcatura, scuoti delicatamente il tubo Falcon.Con una pipetta a cella, raccogliere sette millilitri di mezzo di placcatura e aggiungerlo delicatamente al tubo Falcon da 15 millilitri. Una volta aggiunto il volume finale del mezzo di placcatura al tubo Falcon, trasferire la sospensione cellulare ai contenitori di tessuto codificati con fibronectina. Infine, spostare le cellule in un'incubatrice.Dopo due giorni, raccogliamo i contenitori di tessuto dall'incubatrice e controlliamo la confluenza cellulare al microscopio. A questo punto, spostiamo il pallone in un armadio di biosicurezza e rimuoviamo il mezzo di placcatura. Risciacquiamo delicatamente le cellule con lo stesso mezzo di placcatura dal pallone tissutale quattro o cinque volte.Lo sostituiamo con un nuovo mezzo di manutenzione e li spostiamo in un incubatore per uno o due giorni aggiuntivi. Il giorno in cui creiamo impiccagioni di colture, raccogliamo tutti e tre i tipi di cellule dall'incubatrice. Ci scheggiamo nelle cellule rimuovendo il supporto.Li risciacquiamo con tre millilitri di PBS. E infine aggiungiamo i trucioli nelle cellule. I contenitori vengono quindi spostati in un'incubatrice e incubati per un massimo di cinque minuti.Per generare sferoidi cardiaci, co-coltimo 20.000 cellule per goccia appesa. Questi includono 10.000 cardiomiociti, mille fibroblasti cardiaci e 5.000 cellule interne cardiache. Questi sono co-coltivati in piatti a goccia sospesa 384 pozzi.Sono placcati usando il nostro sistema di movimentazione dei liquidi. Aggiungiamo anche PBS sulle pareti laterali delle piastre di caduta appese per evitare che le colture si asciughino nell'incubatrice. Spostare con cura la piastra di caduta appesa contenente celle nell'incubatrice.Tra i tre e i quattro giorni si formerà lo sferoide. Raccogliamo la piastra di caduta sospesa dall'incubatrice e controlliamo che gli sferoidi si formino all'interno di ogni pozzo. Come mostrato in queste immagini, abbiamo un insieme di sferoidi all'interno del centro di ogni pozzo.Una volta formati, raccogliamo sferoidi e li incorporiamo nei gel di collagene. Una punta della pipetta viene tagliata all'interno in modo da prevenire danni allo sferoide. Gli sferoidi vengono raccolti e trasferiti in un tubo Falcon da 50 millilitri dove vengono riuniti.Spiniamo giù la sospensione dello sferoide a 300 G per cinque minuti per separarli dal mezzo. Usiamo 96 piastre di pozzo con pareti scure per immaginire sferoidi, il supporto viene rimosso o sostituito con un gel di collagene in un tubo Falcon. L'idrossido di sodio viene aggiunto alla sospensione del gel sferoide prima che siano placcati nella piastra della parete scura.100 microliter di sospensione dello sferoide vengono aggiunti in ogni pozzo e incubati per 30 minuti a 37 gradi. I farmaci, tra cui doxorubicina e altri agenti, vengono aggiunti alla piastra dello sferoide e incubati per 24 ore. Il giorno seguente, abbiamo preparato una soluzione contenente calcio AM e omodimero di etidio, etichettando vivono rispettivamente sotto le cellule.Questa soluzione è preparata per aggiungere il centesimo a questa piastra filtrante. Gli sferoidi vengono quindi incubati a 37 gradi per un'ora. Usiamo un lettore di piastre per misurare la fluorescenza del calcio AM e il loro omodimero di etidio nella piastra.Queste misurazioni vengono quindi utilizzate dal nostro software per eseguire un'analisi statistica. Misuriamo l'attività contrattile degli sferoidi trattati con i diversi farmaci utilizzando un sistema ottico ionico. Gli sferoidi vengono spostati allo stadio tra due elettrodi.Ciò consente sia di controllare che di misurare l'attività contrattile in base al potenziale sul campo. In questo modo, possiamo testare diverse tensioni e intervalli di frequenza per stimolare gli sferoidi. Uno sferoide all'epoca è stato identificato e utilizzato per quelle misurazioni.Gli sferoidi che non hanno ricevuto doxorubicina saranno in grado di costruire seguendo la stimolazione elettrica. Al contrario, gli sferoidi trattati con doxorubicina non si contrarranno. Per visualizzare la forma di rete cellulare endoteliale all'interno di ogni sferoide, li abbiamo fissati con una soluzione di paraformaldeide del 4% per un'ora a temperatura ambiente.Abbiamo spostato la piastra su uno shaker che consente la delicata permeazione della soluzione attraverso il gel. Il PFA viene rimosso e risciacquato tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. Abbiamo portato la mobilitazione ovviamente aggiungendo una soluzione allo 0,02% di Triton X in PVSA per 20 minuti a temperatura ambiente.La soluzione di blocco contiene 3%BSA in PBC, che viene quindi aggiunto alla piastra per un'ora a temperatura ambiente. Una soluzione contenente l'anticorpo primario contro CD 31. Un marcatore per l'endoteliale viene aggiunto alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi.Il giorno seguente, la soluzione di anticorpo primario viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. La soluzione anticorpale secondaria contenente anche la macchia esagonale viene aggiunta alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi. Infine, la seconda soluzione anticorpale viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio.Dopo essere rimasto con anticorpi primari e secondari, la piastra può essere immagine utilizzando il nostro microscopio confocale. Una corretta rete vascolare è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione delle cellule cardiache. Gli sferoidi cardiaci presentano una rete cellulare endoteliale che ricapitola meglio quella presente nel cuore umano rispetto alle colture monostrato delle cellule cardiache.Date le caratteristiche uniche, gli sferoidi cardiaci rappresentano strumenti avanzati per i test in vitro per la ricerca cardiovascolare.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analisi della membrana tubolare reti in Cardiac miociti da atri e ventricoli

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...