Name: cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology
Uploaded: 2021-01-23T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology at JoVE.com

En spesiell takk til Nat Johnston for innspillingen og redigering av videoen.
Poonam Sharma ble støttet av University of Newcastle med UNIPRS og UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050) stipender. Carmine Gentile ble støttet av en UTS Seed Funding, katolsk erkebispedømme av Sydney Grant for Adult Stem Cell Research og en Sydney Medical School Foundation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

MERK: hiPSC-CMs som brukes for denne protokollen er kommersielt tilgjengelige. Vennligst søk institusjonell godkjenning av human etikkkomité før du starter dette arbeidet hvis nødvendig.
1. Human hjerte fibroblast og endotelcellekultur plating og vekst
<ol><li>Tin kryovialer som inneholder HCFs og HCAECs i et vannbad ved 37 ° C i ett minutt.</li>
	<li>Flytt kryovialer under en steril laminær strømningsbiosikkerhetsskap klasse 2.</li>
	<li>Samle 1 ml cellesuspensjon fra kryovialene ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss og legg til et 15 ml rør som inneholder 7 ml humant hjertefibroblastmedium for HCFs og 7 ml human meso endovekstmedium for HCAECer. MERK: For å samle de fleste cellene fra hver kryovial, skyll dem to ganger med 1 ml kulturmedium fra samme 15 ml rør.</li>
	<li>Bland forsiktig cellesuspensjoner.</li>
	<li>Overfør cellesuspensjoner for å skille T75-kulturflasker ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.</li>
	<li>Inkuber celler ved 37 °C med 5 % CO2.</li>
	<li>Etter 18 timer, aspirere mediet fra begge kulturflasker og skyll dem en gang med steril fosfat bufret saltvann (PBS) for å fjerne frysende middels og døde celler.</li>
	<li>Erstatt PBS med 7 ml passende kulturmedium til hver kulturkolbe og inkuber ved 37 °C.</li>
	<li>Undersøk cellulær ekspansjon og levedyktighet regelmessig og erstatt media annenhver dag til cellene når 80-90% samløpet.</li>
</ol>2. iCM kultur plating og vekst
<ol><li>Pre-coat to T25 kultur kolbe med 2 ml PBS som inneholder 40 μg / ml fibronectin (FN) og inkubere ved 37 ° C, 5% CO2 i minst 4 timer.</li>
	<li>Etter 4 timer, samle en kryovial som inneholder iCMer og plassere den i et vannbad ved 37 °C i 4 min.</li>
	<li>Flytt kryovialen under en steril laminær strømningsbiosikkerhetsskap klasse 2.</li>
	<li>Overfør forsiktig iCMer fra kryovialen til et sterilt 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en 1 ml pipettespiss.</li>
	<li>Skyll de tomme iCMs cryovial med 1 ml romtemperatur plating medium for å gjenopprette eventuelle gjenværende celler. Overfør 1 ml plating medium skyll fra kryovial drop-wise over 90 sek til 50 ml sentrifugerør som inneholder iCM celle suspensjon. MERK: Virvle forsiktig røret mens du legger til mediet for å blande oppløsningen helt og for å redusere det osmotiske sjokket på de tinte cellene.</li>
	<li>Tilsett langsomt 8 ml romtemperatur Plating Medium til 50 ml sentrifugerør. Legg til de første 1 ml dropwise over 30 - 60 s. Deretter legger du til det gjenværende volumet i løpet av de neste 30 s. Virvle forsiktig sentrifugerøret mens du legger til Plating-mediet. Bland forsiktig innholdet i 50 ml sentrifugerør ved å snu 2 - 3 ganger (unngå kraftig risting eller vortexing).</li>
	<li>Utfør umiddelbart celletellingen ved hjelp av et hemocytometer og bestem den levedyktige celletettheten (i celler/ml).</li>
	<li>Ta FN-pre-coated T25 flasker og aspirere FN-PBS løsning uten å la kolbene tørke. Til dette legge såing volum av iCMs (1,6 x 106 levedyktige iCMer i 8 ml romtemperatur plating medium).</li>
	<li>Kultur iCMer i inkubatoren i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Tin vedlikeholdsmediet over natten ved 4 °C daglig før bruk.</li>
	<li>Likevekt vedlikeholdsmediet i et 37 °C vannbad og bruk umiddelbart.</li>
	<li>Etter 2 dager flytter du iCMs T25-flasker under biosikkerhetsskapet.</li>
	<li>Vask forsiktig av døde celler og rusk ved å forsiktig pipettere Plating Medium opp og ned 5 ganger.</li>
	<li>Aspirer Plating Medium og erstatt med 8 ml forhåndsoppvarmet vedlikeholdsmedium. Plasser T25-kolben tilbake i inkubatoren. Skift ut vedlikeholdsmediet annenhver dag og undersøk samløpet regelmessig.</li>
</ol>3. Cellerisolasjon og telling
<ol><li>Start med å samle inn første HCAECer og HCFs, og deretter iCMer ved å følge trinn 3.2-3.12.</li>
	<li>Forbered CS kultur medium ved å blande 10 ml iCMs Maintenance Medium, 5 ml Human Cardiac Fibroblast Medium og 5 ml Meso Endo Growth Medium.</li>
	<li>Fjern kulturmedium fra hver vevkolbe som inneholder HCFs og HCAECs og skyll en gang med 5 ml PBS for T75 flasker. Fjern PBS.</li>
	<li>Tilsett 5 ml 0,25 % trypsin EDTA-oppløsning i hver T75 kolbe og inkuber i 5 min ved 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Når cellene løsner, nøytraliserer du umiddelbart trypsin EDTA-løsningen med 5 ml kulturmedium.</li>
	<li>Overfør cellesuspensjoner til et 15 ml rør og sentrifugeceller ved 300 x g i 4 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten forsiktig fra hvert rør. Legg til 1 ml CS medium til hver cellepellet og gjenoppussette dem. Hold røret på is og telle celler ved hjelp av Trypan Blue og et hemocytometer.</li>
	<li>Fjern Vedlikeholdsmedium fra vevsflasker som inneholder iCMer og skyll én gang med 3 ml PBS.</li>
	<li>Tilsett 1 ml 0,25 % trypsin EDTA-oppløsning i hver T75 kolbe og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller celler hvert minutt til de er løsrevet.</li>
	<li>Når cellene løsner, nøytraliserer du umiddelbart trypsin EDTA-løsningen med 4 ml kulturmedium.</li>
	<li>Overfør cellesuspensjoner til et 15 ml rør og sentrifuger dem ved 300 x g i 5 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten forsiktig fra hvert rør. Tilsett 1 ml kulturmedium til cellepelleten og gjenoppusst den. Hold røret på is og telle celler ved hjelp av Trypan Blue og et hemocytometer.</li>
</ol>4.CS generasjon og vekst
<ol><li>Bland iCMer, HCFs og HCAECs i 2:1:1-forhold ved å plating 10.000 iCMer, 5000 HCFer og 5000 HCAECs per hengende dråpekultur som inneholder 20 μL cs medium. Juster til det endelige volumet for totalt antall CS-er.</li>
	<li>Pipette 20 μL cellefjæring i hver brønn av 384-brønn HDC-platen enten manuelt eller ved hjelp av en robotkanals pipette for automatisert væskehåndtering.</li>
	<li>Pipette 1,5 ml steril PBS i hver side av kanalen rundt hengende dropplate for å hindre uttørking av CSs. Inkuber HDC-plate ved 37 °C.</li>
	<li>Undersøk dannelsen av CSs daglig til en fullt dannet sfæroid observeres i de fleste brønner. Legg til 7,5 μL CS medium til hver brønn annenhver dag til en CS er dannet.</li>
</ol>5.CS innebygging i kollagengeler
<ol><li>Samle CS-er med en 1 ml pipettespiss. MERK: Det er nødvendig å kutte tuppen av pipetten rundt 0,2 cm fra kanten før den brukes med en steril skarp overflate (enten en skalpell eller en saks) for å forhindre skade gel innebygde sfæroider under innsamlingen.</li>
	<li>Samle CS suspensjon i en 50 ml rør på is.</li>
	<li>Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min. MERK: den oppnådde pelleten må oppbevares på is til bruk.</li>
	<li>Forbered en kollagengelløsning (100 μL/brønn for 30 brønner med 96 brønnplate) på is ved hjelp av rottehalekollagen og CS-medium i et 3:7-forhold.</li>
	<li>Fjern supernatanten fra røret som inneholder CSs.</li>
	<li>Bland pelleted CSs i kollagengeloppløsningen.</li>
	<li>Tilsett 1 μL/ml natriumhydroksid på 5 mM i CS-kollagengelfjæringen og bland forsiktig.</li>
	<li>Overfør 100 μL CS-kollagengel til en klar flat bunn 96 godt svart polystyrenmikroplate og inkuber ved 37 °C i 30 min.</li>
</ol>6. Levedyktighets- og toksisitetsmålinger av DOX-behandlede CS-er
<ol><li>Etter 30 min samle 96 brønnplaten fra inkubator</li>
	<li>Forbered en 10 μM DOX (basert på tidligere etablert protokoll for celledød i CSs14). MERK: For å potensielt teste andre agenter som kan beskytte mot HF i CSs, generere løsninger som inneholder DOX + Agent A, B, etc.</li>
	<li>Tilsett 100 μL med løsninger som inneholder DOX og/eller andre midler i hver brønn. Kontrollkulturer inneholder medier uten DOX.</li>
	<li>Inkuber plate i 18 timer ved 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Dagen etter samler du live/dead-eagensløsningene og lar dem tine på is i mørket i et biosikkerhetsskap.</li>
	<li>Forbered en løsning som inneholder Hoechst flekk, 4 μM ethidium homodimer og 2 μM calcein-AM.</li>
	<li>Tilsett 100 μL Hoechst flekk, calcein-AM / ethidium homodimer løsning i hver brønn.</li>
	<li>Mål fluorescensen i hver brønn på 645 nm for ethidium homodimer og på 530 nm for calcein-AM, henholdsvis ved hjelp av multimode mikroplateleser.</li>
	<li>Overfør fluorescensmålinger til Graphpad PRISM (eller en tilsvarende programvare for statistisk analyse).</li>
	<li>Bruk GraphPad Prism programvare for dataanalyse og statistikk.</li>
	<li>For kvalitetskontroll, sjekk under et epifluorescence mikroskop for kjernefarging, sammen med calcein-AM og ethidium homodimer.</li>
</ol>7.CS kontraktil funksjon evaluering
<ol><li>Samle mikroplaten som klargjort i trinn 5.8.</li>
	<li>Slå på datamaskinen som inneholder IonOptix-programvaren for en videobasert kantdeteksjon, Fluorescence Assistance Interface og MyoPacer Field Stimulator.</li>
	<li>Plasser et nytt deksel slip på vevholderplattformen og monter vannbad med elektroder.</li>
	<li>Samle forsiktig CSs fra kollagengeler ved hjelp av en 1 ml pipettespiss kuttet 0,5 mm fra kanten og overfør dem til et falkerør. Legg til medier på CS for å hindre tørking av CSs. Overfør CS (en om gangen) med noen få μL med medier på scenen i IonOptix-systemet.</li>
	<li>Velg CS som skal analyseres via innstillingstopper på venstre og høyre side av CS ved hjelp av IonOptix-programvaren.</li>
	<li>Bruk den databaserte bevegelsesanalysatoren til å spore bevegelsen av CS-kanter. MERK: Vanligvis måles kontraktsløshet i enten % celleforkortelse eller % fraksjonell forkortelse. I dette tilfellet målte vi % sfæroid forkortelse.</li>
	<li>Stabiliser både toppene som justerer terskel- og kantalternativer fra datamaskinen.</li>
	<li>Utsett CS-er for forskjellige frekvenser (0,3, 0,6, 1, 2 og 3 Hz) og spenninger (1, 2, 3 og 5 V) ved hjelp av Myopacer Field Stimulator.</li>
	<li>Registrer sfæroid forkortelse som CS lengde endringer av DOX-behandlet og ubehandlet CSs. Analyser data ved hjelp av Soft-Edge programvare og gjennomsnitt for hver CS.</li>
</ol>8. Mikroskopi av CSs: fiksering og immunolabeling
<ol><li>Samle 96 brønnplaten etter 30 min (som klargjort i trinn 5.8) og fest CSs i 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern PFA og skyll tre ganger med PBS som inneholder 0,01 % natriumazid (PBSA).</li>
	<li>Fjern PBSA.</li>
	<li>Tilsett 200 μL PBSA som inneholder 0,02 % Triton-X-100 i hver brønn i 30 minutter på en shaker. MERK: Dette trinnet gjennomsyrer CS for bedre antistoffinfiltrasjon.</li>
	<li>Tilsett 200 μL med 3 % storfe serumalbumin i PBSA-oppløsning i 60 min ved romtemperatur. MERK: Dette trinnet blokkerer uspesifisert antistoffbinding i CS.</li>
	<li>Forbered en løsning som inneholder 10 μg/ml primærmusanti-menneskelige antistoffer mot CD31 fortynnet i blokkeringsløsning.</li>
	<li>Tilsett 100 μL primær antistoffløsning til hver brønn og inkuber over natten ved 4 °C på en shaker.</li>
	<li>Skyll platen tre ganger med PBSA i 20 min ved romtemperatur på en gyngeplate.</li>
	<li>Forbered en løsning som inneholder Hoechst DNA-flekk og 10 μg/ml Cy3-konjugert sekundært esel anti-mus antistoff fortynnet i blokkerende løsning.</li>
	<li>Tilsett 100 μL sekundær antistoffoppløsning som inneholder Hoechst-flekken til hver brønn og inkuber over natten ved 4 °C på en shaker. MERK: Dekk platen med aluminiumsfolie fra nå av.</li>
	<li>Skyll platen tre ganger i 20 min med PBSA ved romtemperatur på en gyngeplate.</li>
	<li>Tilsett 100 μL vectashield monteringsmedium til hver brønn.</li>
	<li>Bilde CSs under en laser skanning confocal mikroskop. Utfør optisk snitting langs Z-aksen og skjul bilder i et enkelt fokalplan ved hjelp av ImageJ-programvaren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dzobo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Regenerative+Medicine+and+Tissue+Engineering:+Innovation+and+Transformation+of+Medicine.">Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine.</a> Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).</li><li>Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering+for+cardiac+repair.">Myocardial tissue engineering for cardiac repair.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).</li><li>Sekiya, S., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+vasculature+in+engineered+three-dimensional+tissue.">Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue.</a> Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).</li><li>Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+current+state-of-the-art+materials,+cells+and+tissue+formation.">Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation.</a> Einstein. 16 (3), 4538 (2018).</li><li>Pena, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+Hydrogels+for+Cardiac+Tissue+Engineering.">Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).</li><li>Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+in+three-dimensional+bioprinting+heart+tissues+for+cardiac+surgery.">Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).</li><li>Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+from+matrix+design+to+the+engineering+of+bionic+hearts.">Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Arteries+to+Capillaries:+Approaches+to+Engineering+Human+Vasculature.">From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature.</a> Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).</li><li>O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Present+Constraints+That+Prevent+a+Wide+Spread+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine+Approaches.">Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).</li><li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+Gaps+between+the+In+Vivo+and+In+Vitro+Microenvironment:+Engineering+of+Spheroids+for+Stem+Cell+Technology.">Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+three-dimensional+engineered+tissues+for+regenerative+medicine+applications.">Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications.</a> Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).</li><li>Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+phosphorylation+of+eNOS+regulates+angioblast+and+embryonic+endothelial+cell+proliferation.">VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation.</a> Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).</li><li>Sweeney, M., Foldes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+Takes+Two:+Endothelial-Perivascular+Cell+Cross-Talk+in+Vascular+Development+and+Disease.">It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).</li><li>Polonchuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+spheroids+as+promising+in+vitro+models+to+study+the+human+heart+microenvironment.">Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).</li><li>Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Engineer+a+Human+Cardiac+Patch+for+Therapy.">Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy.</a> Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+in+Vitro+Cell+Culture+Models+in+Drug+Discovery+and+Drug+Repositioning.">Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+biofabrication+of+vascular+networks+for+tissue+regeneration:+A+report+on+recent+advances.">3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).</li><li>Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+Interactions+in+3D+Engineered+Myocardial+Tissue.">Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).</li><li>Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+and+challenges+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+Australian+nuances.">Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).</li><li>Campbell, M., Reis, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 387-393 (2019).</li><li>Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+Cardiac+Spheroids+as+Novel+3D+in+vitro+Models+to+Study+Cardiac+Fibrosis.">Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis.</a> Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).</li><li>Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Derived+Cardiac+Spheroids+as+3D+In+Vitro+Models+of+the+Human+Heart+Microenvironment.">Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).</li><li>Pagliari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multistep+procedure+to+prepare+pre-vascularized+cardiac+tissue+constructs+using+adult+stem+sells,+dynamic+cell+cultures,+and+porous+scaffolds.">A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds.</a> Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).</li><li>Gentile, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+fusion+in+the+generation+of+uniluminal+vascular+spheroids.">VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids.</a> Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).</li><li>Visconti, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+organ+printing:+engineering+an+intra-organ+branched+vascular+tree.">Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).</li><li>Fleming, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+uniluminal+vascular+spheroids:+a+model+for+assembly+of+blood+vessels.">Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels.</a> Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).</li><li>Traore, M. A., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+the+Vascular+Tree.">Tissue Engineering the Vascular Tree.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).</li><li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering.">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li><li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering.">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).</li><li>Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+the+basics+of+the+mechanism+of+doxorubicin-induced+cardiotoxicity:+Have+we+been+barking+up+the+wrong+tree.">Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree.</a> Redox Biology. 29, 101394 (2020).</li></ol>

Utviklingsmessig er riktig vaskulær nettverksdannelse avgjørende for generering av funksjonelle vev, inkludert det menneskelige hjerte10,12,23,24,25,26. Vurdering for riktig vaskularisering av 3D-vev tillater utveksling av oksygen, vekstfaktorer, signalmolekyler og næringsstoffer, og forhindrer utvikling av cellenekrose i noe vev tykkere enn 200 μm6,10,12,17,24,25,26,27,28. Foreløpig tilgjengelig in vitro 3D hjertemodeller som presenterer et vaskulært nettverk er primært presentere kapillær-størrelse, uorganisert vaskulære nettverk og mangler hierarkisk kompleks forgrenet vaskularisering observert in vivo6,8,29. Den alternative tilnærmingen til å utvikle komplekse hjerte endotelcellenettverk beskrevet i dette manuskriptet presenterer forbedret celle levedyktighet og funksjon sammenlignet med eksisterende modeller (Figur 1)14,22. 3D in vitro CSs modellerer det menneskelige hjertet ved bedre å rekapulere in vivo mikromiljøet, inkludert molekylære, cellulære og ekstracellulærekomponenter 14,22. CS generasjon fra stamcelle-avledede celler i hengende dråper tillate sine kulturer i definerte forhold (f.eks celletyper og forhold, riktig vevdannelse). Co-kulturer av iCMs sammen med HCFs og HCAECs i CS definere molekylær og cellulær crosstalk som regulerer hjertet patofysiologi, inkludert sin kontraktile funksjon og respons på legemidler ved konsentrasjoner som finnes i pasientens blodbanen14. På grunn av disse unike funksjonene har CS-er blitt brukt til å modellere hjertefibrose, en alvorlig konsekvens av hjerteinfarkt og hjertesvikt21. Våre tidligere studier viste hvordan tilstedeværelsen av både endotelceller og fibroblaster er avgjørende for rekapbilisering av vaskulær mikromiljø i det menneskelige hjerte, slik at optimal avsetning av fibroblast-avledede ECM-proteiner, som laminin, fibronectin og kollagen type IV, lokalisert i nærheten av et utviklende endotelcellenettverk14,21.
DOX er et velkjent kardiotoksisk legemiddel som kan utvikle hjertesvikt hos kreftpasienter selv 17 år etter behandlingen30. Likevel er det fortsatt et stoff av valget for behandling av leukemi og lymfom hos pediatriske pasienter og brystkreft hos kvinner30. DOX-behandling i CSs har da blitt brukt til å modellere hjertesvikt (HF) in vitro for å studere både mekanismene som regulerer toksisitet i hjertemocytter, endotelceller og fibroblaster14 og modell HF-indusert hjertefibrose21. Celleleveabiliteten ble statistisk redusert i DOX-behandlede CS-er innen 24 timer når de ble eksponert for stoffet ved konsentrasjonen som ble funnet i blodet av kreftpasienter (mellom 5 og 10 μM)14 (figur 2). Tidligere studier i laboratoriet vårt viste også de toksiske effektene av DOX på både hjerteendeotelceller og fibroblaster via endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS) ved hjelp av både genetiske og kjemiske hemmere av denne signalveien14. Bruk av genetisk (NOS3 shRNA) og kjemiske (N5-(1-iminoethyl)-L-ornitin, dihydroklorid, eller L-NIO) antagonister av eNOS signalveien som et nedstrøms mål for DOX forhindret sine toksiske effekter i både hjerte endotelceller og fibroblaster14.
Kontraktil aktivitet innen CSs har også blitt målt takket være elektrisk kobling av hjerteceller når de utsettes for feltpotensial stimulering. Vi fant at CSs kultivert med kontrollmedier (DOX 0 μM) kontrakt spontant og homogent med en slaghastighet som kan paced av feltstimulering innen 1 og 3 Hz, sammenlignbar med et sunt menneskehjerte. Dox-behandlede CS-er følger derimot ikke den elektriske stimuleringen, da de ikke kan trekke seg sammen. Sammen med målinger av celle levedyktighet og toksisitet ved hjelp av calcein-AM og ethidium homodimer, denne funksjonelle analysen for CS kontraktil funksjon tillate evaluering av det komplekse scenariet typisk for det menneskelige hjerte in vitro, for tiden ikke oppnåelig med andre modeller. Sammenlignet med kontraktile aktivitetsmålinger av enkelthjerteceller som bruker samme system, er vi ikke i stand til å visualisere og måle sarkomene i CSs. Derfor er vi begrenset til målinger av % sfæroid forkortelse over tid, en analyse vi måtte utvikle i laboratoriet vårt. Når vi kontrollerer antall celler, vi co-kultur i hver CS og derfor størrelsen på hver CS, bruker vi CSs med lignende størrelse som faktisk presenterer homogen kontraktil funksjon. Men selv i tilfelle vi genererte CS-er av forskjellige størrelser, endret ikke deres kontraktile aktivitet.
Det er også viktig å rapportere at CSs flercellede natur gjør dem tunge nok til å lokalisere nederst på dekkslippen i Ion-Optix-systemet, selv i tilfelle de er superfundert. Basert på det faktum at CSs sitter alene i en bestemt posisjon, trenger vi ikke å få dem til å følge dekkslippen, tvert imot hva som vanligvis gjøres med enkelthjerteceller i de fleste laboratorier.
Den mikroskopiske analysen av CS-er farget med antistoffer mot hjertetroponin T, CD31/PECAM og PECAM (som markører for iCMer, HCAECer og HCFer) viste dannelsen av et endotelcellenettverk (figur 1, blå). For å utelukke nekrose fullt ut i den indre delen av CSs, ble romlig evaluering av celle levedyktighet utført i vårt laboratorium ved konfokal analyse av calcein-AM / ethidium homodimer farget CS(data ikke vist). Det er imidlertid viktig å erkjenne at fremtidig utvikling i biofabrikasjonsfeltet for bedre å rekafulere andre komplekse funksjoner som er typiske for det menneskelige hjertet in vivo, for tiden ikke tilgjengelig i den eksisterende modellen. Disse inkluderer: i) kontraktil funksjon typisk for voksne kardiomyocytter; ii) blodstrøm og trykkkrefter; iii) paracrine signalering; iv) immunrespons, som vil være avgjørende for å forbedre dette og andre in vitro hjertemodeller6. Som enhver annen modell tar sikte på å rekastatere viktige funksjoner i enten et sunt vev eller en sykdomstilstand, protokollen for generering og bruk av CS beskrevet i dette manuskriptet tar sikte på å hjelpe forskeren på å løse spesifikke spørsmål, som kanskje ikke er uttømmende ved hjelp av denne tilnærmingen. For eksempel, den potensielle bruken av pasient-avledede celler for generering av CSs ville gi verktøy for personlig medisin, for tiden ikke tilgjengelig ved hjelp av allment tilgjengelige høy gjennomstrømning analyser for kardiovaskulær forskning.
Til slutt viste vi en enkel måte å bedre rekabrere det menneskelige hjertemikromiljøet ved hjelp av hjerteceller. Hjertesfæroider presenterer et endotelcellenettverk som bedre rekafulerer den som er tilstede i det menneskelige hjerte sammenlignet med monolayerkulturer i hjerteceller. Gitt deres unike egenskaper, representerer de avanserte verktøy for in vitro testing for kardiovaskulær forskning. Fremtidige studier ved hjelp av pasientavledede celler kan gi alternativer for personlig medisin og nye terapier for både å forebygge og bedre behandle kardiovaskulær sykdom.

Det menneskelige hjerte har en begrenset regenerativ kapasitet mens kardiovaskulær sykdom (CVD) fortsatt er den viktigste dødsårsaken over hele verden til tross for de siste fremskrittene innen vevsteknikk og stamcelleteknologi1. Behovet for nye terapeutiske midler, inkludert molekylære og cellulære tilnærminger for å enten reparere et skadet hjerte eller for å forhindre at et hjerte svikter, er et av de viktigste nåværende kliniske behovene for pasienter som lider avhjertesykdom 2,3,4. Hovedmålet med hjertevev engineering er å fremstille en tredimensjonal (3D) hjertevev som presenterer molekylære, cellulære, og ekstracellulære funksjoner typisk for et menneskehjerte, inkludert det vaskulære nettverket og fysiologisk kontraktil funksjon4,5,6.
For å bioingeniør og fremstille et funksjonelt menneskelig hjertevev som etterligner det menneskelige hjerte for in vitro og in vivo-applikasjoner, har flere tilnærminger blitt undersøkt, inkludert konstruert hjertevev (EHTs), celleark og sfæroidkulturer7,8. Imidlertid, disse vevene mislykkes i å rekapulere den optimale 3D mikromiljø typisk for det menneskelige hjerte og deres potensielle bruk for CVD pasienter kan ikke direkte oversette fra benken til sengen7. Dette er fordi de ikke rekafulerer den komplekse biologien, morfologien og fysiologien til in vivo hjertevev9. En av de store utfordringene i hjertevevsteknikk inkluderer utviklingen av et hierarkisk vaskulært nettverk i det bioengineerte hjertevevet, da ethvert vev som er større enn 200 μm i diameter utvikler celledød i midten2,10. Et riktig dannet vaskulært nettverk i et menneskelig hjertevev spiller en viktig rolle for tilførsel av blod, oksygen og næringsstoffer til hjerteceller11. Under embryonisk utvikling dannes koronarkapillærer og arterier via vaskogenese (de novo blodkardannelse) og angiogenese (generering av blodkar fra eksisterende) fra endotelstamceller8,12. Hjertefibroblaster spiller også en viktig rolle i riktig vaskulær nettverksdannelse ved å gi den optimale ekstracellulære matrisen (ECM) og vekstsammensetning13,14.
3D vaskulært nettverk av bioingeniør hjertevev kontrollerer celleoverlevelse og funksjon ved å skape oksygen og næringsgradienter og paracrine signalering, som homotypisk celle interaksjon, heterotypisk celle interaksjon, interaksjon av celler gjennom utskilles løselige proteiner og celle til ECMinteraksjoner 3,10,15,16,17,18. Dette forhindrer celledød i midten av vevet og fremmer celle levedyktighet og fysiologisk funksjon i bioingeniør hjertevev16,18,19.
Sfæroidkulturer fra stamceller har nylig blitt utforsket som in vitro modeller av det menneskelige hjerte20. For ytterligere å forbedre hjertemikromiljøet in vitro, har de inkludert bruk av alle de viktigste celletypene som finnes i det menneskelige hjerte, som hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster. Sfæroidkulturer presenterer den nødvendige 3D strukturelle støtten for celler for å vokse og fungere og kan brukes til å bioingeniør et vaskulærtnettverk 14,20,21,22. I denne sammenheng har vårt laboratorium utviklet menneskelige hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster i forhold som finnes i det menneskelige hjerte14. Denne modellen er en utvidelse av rotte ventrikulære hjerteceller sfæroid modell, generert av co-culturing hjerteceller i hengende dråpe kulturer, brukes til å modellere hjertefibrose21. Human CSs kan brukes som toksisitetsanalyser ved å behandle dem doksorubicin (DOX, et anti-kreftmiddel som brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), som er kjent for å indusere hjertefibrose og hjertesvikt (HF) selv 17 år etter sin somministrasjon14.
I dette manuskriptet beskriver vi hvordan vi genererer menneskelige CS-er ved å co-culturing human indusert pluripotente stamcelle avledet kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs), menneskelige hjertefibroblaster (HCFs) og menneskelige koronar arterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturer. For å bruke og bilde CSs for in vitro testing, er de innebygd i en kollagengel. Den konfokale analysen av CS-er farget med antistoffer mot CD31, en markør for endotelceller, viste at disse cellene danner et nettverk som ligner på det som ble observert in vivo. For å indusere HF og potensielt teste nye midler som kan behandle eller forhindre det, ble CSs behandlet med 10 μM DOX (en konsentrasjon funnet i blodet av kreftpasienter som fikk stoffet). Når farget med calcein-AM og ethidium homodimer (farging levende og døde celler, henholdsvis), DOX-behandlet CSs presentere en betydelig reduksjon i levedyktighet i forhold til CSs som ikke fikk stoffet. CSs presenterer også en homogen kontraktil aktivitet når tempoet ved hjelp av feltet potensiellstimulering mellom 1 og 3 Hz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Secondary Antibodies</td>
			<td>Jackson Immunological Research Labs, Inc.</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>From Bovine Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac fibroblasts (HCFs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>306AK-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human coronary artery endothelial cells (HCAECs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>300K-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCF Growth medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>316-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MesoEndo Cell Growth Medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, CA, USA</td>
			<td>566177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#8211;EDTA, 0.25%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (T25)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning, New York, USA</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td>3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>HDP1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology

Til tross for flere fremskritt innen hjertevevsteknikk, er en av de store utfordringene for å overvinne fortsatt generasjonen av et fullt funksjonelt vaskulært nettverk bestående av flere nivåer av kompleksitet for å gi oksygen og næringsstoffer innen bioingeniørhjertevev. Vårt laboratorium har utviklet en tredimensjonal in vitro modell av det menneskelige hjerte, kjent som "hjertesfæroid" eller "CS". Dette presenterer biokjemiske, fysiologiske og farmakologiske egenskaper som er typiske for det menneskelige hjerte og genereres ved å co-culturing sine tre store celletyper, som hjerte myocytter, endotelceller, og fibroblaster. Humane induserte pluripotente stamceller-avledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs eller iCMs) er co-kultivert i forhold som tilnærmer de som finnes in vivo med menneskelige hjertefibroblaster (HCFer) og humane koronararterie endotelceller (HCAECs) i hengende dråpekulturplater i tre til fire dager. Den confocal analyse av CSs farget med antistoffer mot hjerte Troponin T, CD31 og vimentin (markører for hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis) viser at CSs presentere en kompleks endotelcellenettverk, som ligner den innfødte som finnes i det menneskelige hjerte. Dette bekreftes av 3D-gjengivelsesanalysen av disse konfokale bildene. CSs også presentere ekstracellulære matrise (ECM) proteiner typisk for det menneskelige hjerte, som kollagen type IV, laminin og fibronectin. Til slutt presenterer CSs en kontraktil aktivitet målt som syncytial kontraktilitet nærmere den som er typisk for det menneskelige hjertet sammenlignet med CSs som bare inneholder iCMer. Når det behandles med et kardiotoksisk antikreftmiddel, som doksorubicin (DOX, brukes til å behandle leukemi, lymfom og brystkreft), reduseres levedyktigheten til DOX-behandlede CS-er betydelig ved 10 μM genetisk og kjemisk hemming av endotelial nitrogenoksidsyntase, et nedstrømsmål for DOX i HCFs og HCAECer, redusert toksisitet i CSs. Gitt disse unike funksjonene, CSs er for tiden brukt som in vitro modeller for å studere hjerte biokjemi, patofysiologi, og farmakologi.

Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet representerer en alternativ tilnærming til å utvikle komplekse hjerte endotelcellenettverk i et bioingeniørt hjertevev med forbedret celle levedyktighet og funksjon sammenlignet med eksisterende modeller (figur 1). Rekakuleringen av 3D in vivo hjertemikromiljø i CS-er fremmet deres respons på DOX ved konsentrasjonen som ble funnet i blodet av kreftpasienter (mellom 5 og 10 μM, figur 2). DOX-behandlede CS-er ga en statistisk signifikant reduksjon i cellelevedisitet sammenlignet med kontroll (ingen DOX) CS innen 24 timer (figur 2), en toksisk effekt som observeres hos humane kreftpasienter selv 17 år etter behandling med legemidlet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig01.jpg"> Figur 1. CS dannelse og vaskularisering analyse. (A)Protokoll som viser trinnene for dannelsen av en CS fra co-kulturen av iCMs, HCAECs og HCFs i hengende dråper. Brightfield-bilder på høyre side viser den progressive sfæroidformasjonen fra enkeltceller i hengende dråper. (B)Kollapset Z-stabler av konfokale bilder av en CS farget med antistoffer mot hjerte Troponin T (cTNT), PECAM og vimentin, farging hjerte myocytter, endotelceller og fibroblaster, henholdsvis. Dette tallet er endret fra14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig02.jpg"> Figur 2. Levedyktighet og toksisitet i CSs. Statistiske analyser av calcein-AM (A) og ethidium homodimer (B) fluorescens av CSs behandlet i nærvær av begge medier (DOX 0 μM) eller doksorubicin (10 μM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology at JoVE.com

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Denne protokollen tar sikte på å fremstille 3D hjertesfæroider (CSs) ved å co-culturing celler i hengende dråper. Kollagen-innebygde CSs behandles med doksorubicin (DOX, et kardiotoksisk middel) ved fysiologiske konsentrasjoner for å modellere hjertesvikt. In vitro-testing med DOX-behandlede CS-er kan brukes til å identifisere nye behandlinger for hjertesviktpasienter.

Hjertesfæroider som in vitro bioingeniør hjertevev for å studere humant hjerte patofysiologi

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

En av de store utfordringene i å konstruere et menneskelig hjertevev inkluderer vaskularisering. Vårt laboratorium har utviklet en in vitro modell av det menneskelige hjerte ved å co-culturing celler funnet in vivo. Disse inkluderer hjerte myocytter, hjerte fibroblaster og hjerte endotelceller.Til sammen tillater disse cellene rekapisering av det menneskelige hjertemikromiljøet, inkludert molekylære, cellulære og ekstra cellulære komponenter. Vi bruker dem i laboratoriet vårt til å teste forskjellige stoffer for narkotikatoksisitetsessays. Disse inkluderer doksorubicin, et velkjent kardiotoksisk stoff som påvirker de menneskelige hjertene selv år etter behandlingen.Vi dyrker hjertefibroblaster, endotelceller og myocytter separat før vi danner spheroider. For å vokse kardiomyocytter samler vi hetteglasset fra minus 80 grader og vi varmer det ved 37 grader i fire minutter i et vannbad. Vi sprayer deretter kryo hetteglasset med 70% etanol og flytter det til et biosikkerhetsskap.Vi samler forsiktig cellefjæringen og overfører den til et 15 milliliter Falcon-rør. Vi samler en milliliter prewarm plating medium, skyller kryo hetteglasset en gang og legger det til 50 milliliter Falcon tube, en dråpe om gangen hvert fjerde sekund. Mens du legger i plating medium, forsiktig riste Falcon tube.Med en cellepipette samler du syv milliliter plating medium og legger den forsiktig til 15 milliliter Falcon-røret. Når lagt det endelige volumet av plating medium til Falcon tube, overføre celle suspensjon til fibronectin kodet vev kolbe. Til slutt flytter du celler til en inkubator.Etter to dager samler vi vevkolber fra inkubatoren, og vi sjekker cellekonfluens under mikroskopet. På dette punktet flytter vi kolben til et biosikkerhetsskap, og vi fjerner platingmediet. Vi skyller forsiktig celler med samme plating medium fra vevkolben fire eller fem ganger.Vi erstatter det med nytt vedlikeholdsmedium og flytter dem til en inkubator i en til to ekstra dager. Den dagen vi lager hengninger av kulturer, samler vi alle de tre celletypene fra inkubatoren. Vi chip i celler ved å fjerne media.Vi skyller dem med tre milliliter PBS. Og til slutt legger vi chips i cellene. Flasker flyttes deretter til en inkubator, og inkuberes i opptil fem minutter.For å generere hjertesfæroider, vi co-kultur 20, 000 celler per hengende dråpe. Disse inkluderer 10.000 kardiomyocytter, tusen hjertefibroblaster og 5000 hjerteinteriørceller. Disse er co-kultivert i hengende dråpe 384 brønnplater.De er belagt ved hjelp av vårt flytende håndteringssystem. Vi legger også til PBS på sideveggene til de hengende dråpeplatene for å hindre at kulturene tørker ut i inkubator. Flytt forsiktig den hengende dråpeplaten som inneholder celler til inkubatoren.Mellom tre til fire dager vil sfæroid dannes. Vi samler hengende drop plate fra inkubatoren, og vi kontrollerer at sfæroider dannes i hver brønn. Som vist på disse bildene, har vi et sett med sfæroider i midten av hver brønn.Når de er dannet, samler vi sfæroider og legger dem inn i kollagengeler. En pipettespiss er kuttet på innsiden for å forhindre sfæroidskade. Sfæroider samles inn og overføres til et 50 milliliter Falcon-rør hvor de trekkes sammen.Vi spinner ned spheroid suspensjon på 300 G i fem minutter for å skille dem fra mediet. Vi bruker mørkeveggede 96 brønnplater for å bilde spheroider, mediet fjernes eller erstattes med en kollagengel i et Falcon-rør. Natriumhydroksid tilsettes spheroid gel suspensjon før de er belagt i den mørke veggplaten.100 mikroliter sfæroid suspensjon tilsettes i hver brønn og inkuberes i 30 minutter ved 37 grader. Legemidler, inkludert doksorubicin og andre midler, legges til sfæroidplaten og inkuberes i 24 timer. Dagen etter utarbeidet vi en løsning som inneholder kalsium AM og ethidium homodimer, merking lever under cellene henholdsvis.Denne løsningen er klargjort i å legge krone til denne filterplaten. Sfæroider inkuberes deretter ved 37 grader i en time. Vi bruker en plateleser til å måle fluorescensen av kalsium AM og deres ethidium homodimer i platen.Disse målingene brukes deretter av programvaren vår til å utføre en statistisk analyse. Vi måler den kontraktile aktiviteten til sfæroider behandlet med de forskjellige stoffene ved hjelp av et iionoptisk system. Sfæroider flyttes til scenen mellom to elektroder.Disse gjør det mulig å både kontrollere og måle kontraktile aktiviteten etter feltpotensial. På denne måten kan vi teste forskjellige spenninger og frekvensområder for å stimulere sfæroider. En sfæroid på den tiden er avbildet, og brukes til disse målingene.Sfæroider som ikke fikk doksorubicin vil kunne konstruere etter elektrisk stimulering. Tvert imot vil doksorubicin behandlede sfæroider ikke trekke seg sammen. For å visualisere endotelcellenettverksskjemaet i hver sfæroid, fikset vi dem med en 4% paraformaldehydløsning i en time ved romtemperatur.Vi flyttet platen til en shaker som tillater mild gjennommating av løsningen gjennom gelen. PFA fjernes og skylles tre ganger med en PBS-løsning som inneholder 0,01 % natriumoksid. Vi tok mobilisering selvfølgelig ved å legge til en 0,02% løsning av Triton X i PVSA i 20 minutter ved romtemperatur.Blokkeringsløsningen inneholder 3% BSA i PBC, som deretter legges til platen i en time ved romtemperatur. En løsning som inneholder det primære antistoffet mot CD 31. En markør for endotel er lagt til platen som deretter inkuberes over natten ved fire grader.Dagen etter fjernes den primære antistoffoppløsningen og platen skylles tre ganger med en PBS-løsning som inneholder 0,01 % natriumoksid. Den sekundære antistoffløsningen som inneholder sekskantflekken, tilsettes også platen som deretter inkuberes over natten ved fire grader. Til slutt fjernes den andre antistoffoppløsningen og platen skylles tre ganger med en PBS-løsning som inneholder 0,01 % natriumoksid.Etter å ha bodd hos primære og sekundære antistoffer, kan platen avbildes ved hjelp av vårt konfokale mikroskop. Et riktig vaskulært nettverk er avgjørende for hjertecelleoverlevelse og funksjon. Hjertesfæroider presenterer et endotelcellenettverk som bedre rekafulerer den som er tilstede i det menneskelige hjerte sammenlignet med monolayerkulturer i hjerteceller.Gitt de unike funksjonene representerer hjertesfæroider avanserte verktøy for in-vitro-testing for kardiovaskulær forskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse av Tubular Membran Networks i hjertemuskelceller fra Atria og ventriklene

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal Cardiac Stillas: Nye matriser for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi for studier av Murine hjertet

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization av hele hjerte inne i en trykksatt pose i en omvendt retning

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...