Name: cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology
Uploaded: 2021-01-23T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology at JoVE.com

Особая благодарность Нэт Джонстон за запись и редактирование видео.
Пунам Шарма был поддержан Университетом Ньюкасла стипендиями UNIPRS и Central and Faculty School (UNRSC5050). Кармин Джентиле была поддержана UTS Семенное финансирование, католическая митрополия Сиднея Грант для взрослых исследований стволовых клеток и Сиднейской медицинской школы Фонд кардиоторакальной хирургии исследований Грант.

<ol>
	<li>Dzobo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Regenerative+Medicine+and+Tissue+Engineering:+Innovation+and+Transformation+of+Medicine.">Advances in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: Innovation and Transformation of Medicine.</a> Stem Cells International. 2018, 2495848 (2018).</li><li>Pecha, S., Eschenhagen, T., Reichenspurner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+tissue+engineering+for+cardiac+repair.">Myocardial tissue engineering for cardiac repair.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (3), 294-298 (2016).</li><li>Sekiya, S., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+vasculature+in+engineered+three-dimensional+tissue.">Introduction of vasculature in engineered three-dimensional tissue.</a> Inflammation and Regeneration. 37, 25 (2017).</li><li>Rodrigues, I. C. P., Kaasi, A., Maciel Filho, R., Jardini, A. L., Gabriel, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+current+state-of-the-art+materials,+cells+and+tissue+formation.">Cardiac tissue engineering: current state-of-the-art materials, cells and tissue formation.</a> Einstein. 16 (3), 4538 (2018).</li><li>Pena, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+Hydrogels+for+Cardiac+Tissue+Engineering.">Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Engineering.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (6), 1800079 (2018).</li><li>Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+in+three-dimensional+bioprinting+heart+tissues+for+cardiac+surgery.">Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , (2020).</li><li>Fleischer, S., Feiner, R., Dvir, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+from+matrix+design+to+the+engineering+of+bionic+hearts.">Cardiac tissue engineering: from matrix design to the engineering of bionic hearts.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 275-284 (2017).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Arteries+to+Capillaries:+Approaches+to+Engineering+Human+Vasculature.">From Arteries to Capillaries: Approaches to Engineering Human Vasculature.</a> Advanced Functional Materials. (1910811), 23 (2020).</li><li>O'Donnell, B. T., Ives, C. J., Mohiuddin, O. A., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Present+Constraints+That+Prevent+a+Wide+Spread+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine+Approaches.">Beyond the Present Constraints That Prevent a Wide Spread of Tissue Engineering and Regenerative Medicine Approaches.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 95 (2019).</li><li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+Gaps+between+the+In+Vivo+and+In+Vitro+Microenvironment:+Engineering+of+Spheroids+for+Stem+Cell+Technology.">Filling the Gaps between the In Vivo and In Vitro Microenvironment: Engineering of Spheroids for Stem Cell Technology.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therarpy. 11 (8), 652-665 (2016).</li><li>Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+three-dimensional+engineered+tissues+for+regenerative+medicine+applications.">Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications.</a> Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).</li><li>Gentile, C., Muise-Helmericks, R. C., Drake, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+phosphorylation+of+eNOS+regulates+angioblast+and+embryonic+endothelial+cell+proliferation.">VEGF-mediated phosphorylation of eNOS regulates angioblast and embryonic endothelial cell proliferation.</a> Developmental Biology. 373 (1), 163-175 (2013).</li><li>Sweeney, M., Foldes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+Takes+Two:+Endothelial-Perivascular+Cell+Cross-Talk+in+Vascular+Development+and+Disease.">It Takes Two: Endothelial-Perivascular Cell Cross-Talk in Vascular Development and Disease.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 154 (2018).</li><li>Polonchuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+spheroids+as+promising+in+vitro+models+to+study+the+human+heart+microenvironment.">Cardiac spheroids as promising in vitro models to study the human heart microenvironment.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7005 (2017).</li><li>Zhang, J., Zhu, W., Radisic, M., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+We+Engineer+a+Human+Cardiac+Patch+for+Therapy.">Can We Engineer a Human Cardiac Patch for Therapy.</a> Circulation Research. 123 (2), 244-265 (2018).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+in+Vitro+Cell+Culture+Models+in+Drug+Discovery+and+Drug+Repositioning.">Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models in Drug Discovery and Drug Repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Sarker, M. D., Naghieh, S., Sharma, N. K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+biofabrication+of+vascular+networks+for+tissue+regeneration:+A+report+on+recent+advances.">3D biofabrication of vascular networks for tissue regeneration: A report on recent advances.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (5), 277-296 (2018).</li><li>Zamani, M., Karaca, E., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+Interactions+in+3D+Engineered+Myocardial+Tissue.">Multicellular Interactions in 3D Engineered Myocardial Tissue.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 147 (2018).</li><li>Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+and+challenges+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+Australian+nuances.">Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 45 (4), 390-400 (2018).</li><li>Campbell, M., Reis, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 387-393 (2019).</li><li>Figtree, G. A., Bubb, K. J., Tang, O., Kizana, E., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+Cardiac+Spheroids+as+Novel+3D+in+vitro+Models+to+Study+Cardiac+Fibrosis.">Vascularized Cardiac Spheroids as Novel 3D in vitro Models to Study Cardiac Fibrosis.</a> Cells Tissues Organs. 204 (3-4), 191-198 (2017).</li><li>Campbell, M., Chabria, M., Figtree, G. A., Polonchuk, L., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Derived+Cardiac+Spheroids+as+3D+In+Vitro+Models+of+the+Human+Heart+Microenvironment.">Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids as 3D In Vitro Models of the Human Heart Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 2002, 51-59 (2019).</li><li>Pagliari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multistep+procedure+to+prepare+pre-vascularized+cardiac+tissue+constructs+using+adult+stem+sells,+dynamic+cell+cultures,+and+porous+scaffolds.">A multistep procedure to prepare pre-vascularized cardiac tissue constructs using adult stem sells, dynamic cell cultures, and porous scaffolds.</a> Frontiers in Physiology. 5, 210 (2014).</li><li>Gentile, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+fusion+in+the+generation+of+uniluminal+vascular+spheroids.">VEGF-mediated fusion in the generation of uniluminal vascular spheroids.</a> Developmental Dynamics. 237 (10), 2918-2925 (2008).</li><li>Visconti, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+organ+printing:+engineering+an+intra-organ+branched+vascular+tree.">Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (3), 409-420 (2010).</li><li>Fleming, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+uniluminal+vascular+spheroids:+a+model+for+assembly+of+blood+vessels.">Fusion of uniluminal vascular spheroids: a model for assembly of blood vessels.</a> Developmental Dynamics. 239 (2), 398-406 (2010).</li><li>Traore, M. A., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+the+Vascular+Tree.">Tissue Engineering the Vascular Tree.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).</li><li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering.">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li><li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering.">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Progress in Polymer Science. 53, 86-168 (2016).</li><li>Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+the+basics+of+the+mechanism+of+doxorubicin-induced+cardiotoxicity:+Have+we+been+barking+up+the+wrong+tree.">Teaching the basics of the mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity: Have we been barking up the wrong tree.</a> Redox Biology. 29, 101394 (2020).</li></ol>

Ни один

В развитии правильное формирование сосудистой сети имеет решающее значение для генерации функциональныхтканей, в том числе сердца человека 10,12,23,24,25,26. Рассмотрение правильной васкуляризации 3D тканей позволяет обмениваться кислородом, факторами роста, сигнализацией молекул и питательных веществ, предотвращая развитие клеточного некроза в любой ткани толще 200мкм 6,10,12,17,24,25,26,27,28. В настоящее время доступны в пробирке 3D модели сердца, которые представляют сосудистой сети в первую очередь представления капиллярного размера, дезорганизованных сосудистых сетей и отсутствие иерархического комплекса разветвленной васкуляризациинаблюдаетсяв vivo 6,8,29. Альтернативный подход к разработке сложной сердечной эндотелиальной клеточной сети, описанный в этой рукописи, представляет улучшенную жизнеспособность и функцию клеток посравнению с существующими моделями (рисунок 1)14,22. 3D в пробирке CSs модели человеческого сердца, лучше recapitulating его в vivo микроэнvironment, в том числе его молекулярных, клеточных ивнеклеточных компонентов 14,22. Поколение CS из клеток, полученных из стволовых клеток в висячих каплях, позволяет их культурам в определенных условиях (например, типы клеток и соотношение, правильное образование тканей). Совместно культуры iCMs совместно с HCFs и HCAECs внутри CSs определяют молекулярный и клетчатый перекрестный разговор который регулирует патофизиологию сердца, включая свою контрактильной функцию и реакцию к снадобьям на концентрациях найденных в крови пациента14. Благодаря этим уникальным особенностям, CSs были использованы для моделирования сердечного фиброза, тяжелое следствие инфаркта миокарда и сердечной недостаточности21. Наши предыдущие исследования показали, как наличие как эндотелиальных клеток, так и фибробластов имеет решающее значение для перепросмотра микрооколонки сосудов в сердце человека, что позволяет оптимальное осаждение фибробластов, полученных ECM белков, таких как ламинин, фибронектин и коллаген типа IV, локализованных в непосредственной близости от развивающейсяэндотелиальной клеточной сети 14,21.
DOX является известным кардиотоксическим препаратом, который может развиться сердечная недостаточность у больных раком даже через 17 лет после ихлечения 30. Тем не менее, он остается препаратом выбора для лечения лейкемии и лимфомы у педиатрических пациентов и рака молочной железы уженщин 30. DOX лечение в CSs затем был использован для моделирования сердечной недостаточности (HF) in vitro для изучения как механизмы, регулирующие токсичность в сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов14 и модели HF-индуцированного сердечного фиброза21. Жизнеспособность клеток была статистически снижена в DOX лечение CSs в пределах 24 ч при воздействии препарата в концентрации, найденной в крови больных раком (между 5 и 10МК) 14 (Рисунок 2). Предыдущие исследования в нашей лаборатории также продемонстрировали токсическое воздействие DOX как на сердечные эндотелиальные клетки, так и на фибробласты с помощью эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) с использованием как генетических, так и химических ингибиторов этогосигнального пути 14. Использование генетических (NOS3 shRNA) и химических (N5-(1-iminoethyl)-L-орнитин, дигидрохлорид, или L-NIO) антагонистов eNOS сигнализации пути в качестве вниз по течению цель DOX предотвратить его токсическое воздействие как в сердечной эндотелиальных клеток ифибробластов 14.
Контрактильной активности в CSs также измеряется благодаря электрической связи сердечных клеток при воздействии на поле потенциальной стимуляции. Мы обнаружили, что CSs, культурные с средствами управления (DOX 0 МК) контракт спонтанно и однородно на избиение скорость, которая может быть темп по стимуляции поля в пределах 1 и 3 Гц, сопоставимы со здоровым сердцем человека. С другой стороны, обработанные DOX CS не следуют электрической стимуляции, поскольку они не могут контракт. Наряду с измерениями жизнеспособности клеток и токсичности с использованием calcein-AM и ethidium homodimer, этот функциональный анализ для CS контрактильной функции позволяют оценку сложного сценария, типичного для человеческого сердца in vitro, в настоящее время не достижимо с другими моделями. По сравнению с измерениями контрактной активности одиночных сердечных клеток, использующих ту же систему, мы не в состоянии визуализировать и измерить саркомер в CSs. Таким образом, мы ограничены измерениями % сфероидного сокращения с течением времени, анализ, который мы должны были разработать в нашей лаборатории. Как мы контролируем количество клеток, мы совместно культуры в каждом CS и, следовательно, размер каждого CS, мы используем CS с аналогичным размером, что действительно присутствует однородная контрактивная функция. Однако даже в случае, если мы генерировали СС разных размеров, их контрактная деятельность не меняться.
Важно также сообщить, что многоклеточный характер CS делает их достаточно тяжелыми, чтобы локализовать в нижней части крышки в системе Ion-Optix, даже если они наколены. Основываясь на том факте, что СС сидят сами по себе в определенном положении, нам не нужно, чтобы заставить их придерживаться крышки, вопреки тому, что обычно делается с одной сердечной клетки в большинстве лабораторий.
Микроскопический анализ CSs окрашенных антителами против сердечного тропонина T, CD31/PECAM, и PECAM (в качестве маркеров для iCMs, HCAECs, и HCFs, соответственно) показали формирование эндотелиальной сети клеток(рисунок 1, синий). Чтобы полностью исключить некроз во внутренней части CSs, пространственная оценка жизнеспособности клеток была проведена в нашей лаборатории конфокального анализа кальцина-AM/ethidium homodimer окрашенных CSs(данные не показаны). Тем не менее, важно признать, что будущие разработки в области биофабрикации, чтобы лучше резюмировать другие сложные особенности, типичные для человеческого сердца in vivo, в настоящее время не доступны в существующей модели. К ним относятся: i) контрактильной функции, характерные для взрослых кардиомиоцитов; ii) кровоток и силы давления; iii) паракринная сигнализация; iv) иммунный ответ, который будет иметь решающее значение для улучшения этого и других в пробирке сердечныхмоделей 6. Поскольку любая другая модель направлена на повторение основных особенностей либо здоровой ткани, либо состояния болезни, протокол для генерации и использования CS, описанный в этой рукописи, направлен на оказание помощи исследователю в решении конкретных вопросов, которые не могут быть исчерпывающими с помощью этого подхода. Например, потенциальное использование клеток, полученных пациентами для генерации СС, обеспечит инструменты для персонализированной медицины, которые в настоящее время недоступны с использованием общедоступных высокоопруговых анализов для сердечно-сосудистых исследований.
В заключение, мы продемонстрировали простой способ лучше резюмировать микроокноронию сердца человека с помощью сердечных клеток. Сердечные сфероиды представляют эндотелиальную клеточную сеть, которая лучше резюмирует тот, который присутствует в сердце человека по сравнению с монослойными культурами сердечных клеток. Учитывая их уникальные особенности, они представляют собой передовые инструменты для тестирования in vitro для сердечно-сосудистых исследований. Будущие исследования с использованием клеток, полученных пациентом, могли бы предоставить варианты персонализированной медицины и новых методов лечения как для профилактики, так и для лучшего лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Сердце человека имеет ограниченную регенеративную способность, в то время как сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остается основной причиной смерти во всем мире, несмотря на последние достижения в области тканевой инженерии и технологийстволовых клеток 1. Потребность в новых терапевтических средств, включая молекулярные и клеточные подходы либо восстановить поврежденное сердце или предотвратить сердце от отказа является одним из основных текущих клинических потребностей для пациентов, страдающихот сердечно-сосудистых заболеваний 2,3,4. Основной целью инженерии сердечной ткани является изготовление трехмерной (3D) ткани сердца, которая представляет молекулярные, клеточные и внеклеточные особенности, характерные для сердца человека, включая его сосудистую сеть и физиологическую контрактивнуюфункцию 4,5,6.
Для того, чтобы биоинженер и изготовить функциональную сердечную ткань человека, которая имитирует сердце человека для in vitro и in vivo приложений, было исследовано несколько подходов, включая инженерии тканей сердца (EHTs), клеточных листов и сфероидныхкультур 7,8. Тем не менее, эти ткани терпят неудачу при повторном воспроизведении оптимальной 3D микроокноронности, характерной для сердца человека и их потенциальное использование для пациентов с ССЗ не может непосредственно перевести со скамейкина кровать 7. Это потому, что они не резюмируют сложные биологии, морфологии и физиологии in vivo сердечных тканей9. Одна из основных проблем в инженерии сердечной ткани включает в себя развитие иерархической сосудистой сети в биоинженерной сердечной ткани, так как любая ткань, которая больше, чем 200 мкм в диаметре развивается гибельклеток в середине 2,10. Правильно сформированная сосудистая сеть в сердечной ткани человека играет важную роль в поставках крови, кислорода и питательных веществ в сердечные клетки11. Во время эмбрионального развития коронарные капилляры и артерии образуются через васкулогенез (образование сосудов крови de novo) и ангиогенез (генерация кровеносных сосудов из уже существующих) из эндотелиальных клеток-предшественников8,12. Сердечные фибробласты также играют важную роль в правильном формировании сосудистой сети, обеспечивая оптимальную внеклеточную матрицу (ECM) исостав роста 13,14.
3D сосудистая сеть биоинженерных тканей сердца контролирует выживаемость клеток и функции, создавая кислородные и питательные градиенты и паракринную сигнализацию, такие как гомотипическое клеточное взаимодействие, гетеротипическое клеточное взаимодействие, взаимодействие клеток через секретные растворимые белки и клетки к взаимодействиям ECM3,10,15,16,17,18. Это предотвращает гибель клеток в середине ткани и способствует жизнеспособности клеток и физиологической функции в биоинженерныхтканей сердца 16,18,19.
Сфероидные культуры из стволовых клеток были недавно изучены как в пробирке модели человеческого сердца20. Для дальнейшего улучшения микроокновидения сердца в пробирке, они включали использование всех основных типов клеток, найденных в сердце человека, таких как сердечные миоциты, эндотелиальные клетки, и фибробласты. Сфероидные культуры представляют необходимую 3D структурную поддержку для клеток расти и функционировать и могут быть использованы для биоинженерасосудистой сети 14,20,21,22. В этом контексте, наша лаборатория разработала человека сердечных сфероидов (CSs) путем совместного культивирования сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов в соотношении, найденном в сердцечеловека 14. Эта модель является расширение крыс желудочковой сердечной модели клеток сердца сфероидов, порожденных совместного культивирования сердечных клеток в висячих культур падение, используется для моделирования сердечногофиброза 21. Человеческие CSs могут быть использованы в качестве анализа токсичности, рассматривая их доксорубицин (DOX, противоопухольный агент, используемый для лечения лейкемии, лимфомы и рака молочной железы), который хорошо известен, чтобы вызвать сердечный фиброз и сердечную недостаточность (HF) даже 17 лет послеего сомминистрации 14.
В этой рукописи мы описываем, как генерировать человеческие CSs путем совместного культивирования человека индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMs или iCMs), человека сердечных фибробластов (HCFs) и коронарной артерии человека эндотелиальных клеток (HCAECs) в висячих культурах падения. Для того, чтобы использовать и изображения CSs для тестирования в пробирке, они встроены в коллагеновый гель. Конфокальный анализ СС, окрашенных антителами против CD31, маркера эндотелиальных клеток, показал, что эти клетки образуют сеть, аналогичную той, которая наблюдается in vivo. Чтобы вызвать HF и потенциально проверить новые агенты, которые могут лечить или предотвращать его, CSs лечили с 10 МК DOX (концентрация в крови больных раком, получающих препарат). При окрашивания кальцеин-AM и ethidium homodimer (окрашивание живых и мертвых клеток, соответственно), DOX-обработанные CS представляют собой значительное снижение жизнеспособности по сравнению с CSs, которые не получили препарат. CSs также представляют однородную контрактиабельную активность при темпе, используя потенциальную стимуляцию поля между 1 и 3 Гц.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Secondary Antibodies</td>
			<td>Jackson Immunological Research Labs, Inc.</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>From Bovine Plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac fibroblasts (HCFs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>306AK-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human coronary artery endothelial cells (HCAECs)</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>300K-05a</td>
			<td>5x10^5 Cells (Adult), Medium &#38; Subculture Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCF Growth medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>316-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MesoEndo Cell Growth Medium</td>
			<td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM</td>
			<td>BD Pharmingen, San Diego, CA, USA</td>
			<td>566177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium (iCells)</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td>
			<td>R1057</td>
			<td>iCell Cardiomyocytes Kit, 01434</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#8211;EDTA, 0.25%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (T25)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates</td>
			<td>Corning, New York, USA</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Hanging Drop Plate</td>
			<td>3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td>HDP1385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac spheroids as in vitro bioengineered heart tissues to study human heart pathophysiology

Несмотря на несколько достижений в области инженерии сердечной ткани, одной из основных проблем, которые необходимо преодолеть, остается генерация полностью функциональной сосудистой сети, включающей несколько уровней сложности для обеспечения кислородом и питательными веществами в биоинженерных тканях сердца. Наша лаборатория разработала трехмерную модель in vitro человеческого сердца, известную как "сердечный сфероид" или "CS". Это представляет биохимические, физиологические и фармакологические особенности, характерные для сердца человека и генерируется путем совместного культивирования трех основных типов клеток, таких как сердечные миоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные кардиомиоциты (hiPSC-CMs или iCMs) совместно культурируются в соотношениях, приближенных к тем, которые находятся в виво с человеческими сердечными фибробластами (HCFs) и эндотелиальными клетками коронарной артерии человека (HCAECs) в висячих пластинах культуры падения в течение трех-четырех дней. Конфокальный анализ СС, окрашенных антителами против сердечного тропонина Т, CD31 и виментина (маркеры для сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, соответственно), показывает, что СС представляют собой сложную эндотелианую сеть клеток, напоминающую родную, найденную в сердце человека. Это подтверждается 3D-анализом рендеринга этих конфокальных изображений. CSs также представляют внеклеточные матричные (ECM) белки, типичные для сердца человека, такие как коллаген типа IV, ламинин и фибронектин. Наконец, CS представляют 400-ю договорливную активность, измеряемую как синцитиальная сотышность, ближе к типичной для человеческого сердца, по сравнению с CS, которые содержат только iCMs. При лечении с кардиотоксическим противораковым агентом, таким как доксорубицин (DOX, используется для лечения лейкемии, лимфомы и рака молочной железы), жизнеспособность DOX-обработанных CSs значительно снижается на 10 МКМ генетического и химического ингибирования эндотелиального оксида азота синтазы, вниз по течению цель DOX в HCFs и HCAECs, снижение его токсичности в CSS. Учитывая эти уникальные особенности, CSs в настоящее время используются в качестве моделей in vitro для изучения биохимии сердца, патофизиологии и фармакологии.

Протокол, описанный в этой рукописи представляет собой альтернативный подход к разработке сложной сердечной эндотелиальной клеточной сети в биоинженерной сердечной ткани с улучшенной жизнеспособности клеток и функции по сравнению с существующими моделями (Рисунок 1). Повторная перепросмотр 3D микроокноронности сердца in vivo в СС способствовала их реакции на DOX в концентрации, найденной в крови онкологических больных (от 5 до 10 МКМ, рисунок 2). DOX лечение CSs представил статистически значимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем (без DOX) CSs в пределах 24 ч (Рисунок 2), токсический эффект, который наблюдается у больных раком человека даже через 17 лет после их лечения препаратом.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig01.jpg"> Рисунок 1. CS Формирование и анализ васкуляризации. (A)Протокол, показывающий шаги для формирования CS из совместной культуры iCMs, HCAECs и HCFs в висячих капель. Яркие изображения на правой стороне показывают прогрессивное образование сфероидов из одиночных клеток в висячих каплях. (B) Рухнули стеки конфокальных изображений CS окрашенных антителами против сердечного troponin T (cTNT), PECAM и виментин, окрашивание сердечных миоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, соответственно. Эта цифра была изменена с14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig02.jpg"> Рисунок 2. Жизнеспособность и токсичность в CSs. Статистический анализ кальцина-AM (A) и этидия гомодимера (B )флуоресценцииCS, обработанных в присутствии либо средств массовой информации только (DOX 0 МК) или доксорубицин (10 МКМ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology at JoVE.com

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

Этот протокол направлен на изготовление 3D сердечных сфероидов (CSs) путем совместного культивирования клеток в висячих капель. Коллаген-встроенные CSs обрабатываются доксорубицин (DOX, кардиотоксический агент) в физиологических концентрациях для моделирования сердечной недостаточности. In vitro тестирования с использованием DOX-обработанных CSs могут быть использованы для выявления новых методов лечения для пациентов с сердечной недостаточностью.

Сердечные сфероиды как в пробирке Биоинженерные ткани сердца для изучения патофизиологии сердца человека

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Одна из основных проблем в инженерии ткани сердца человека включает в себя его васкуляризации. Наша лаборатория разработала в пробирке модель человеческого сердца путем совместного культивирования клеток, найденных в виво. К ним относятся сердечные миоциты, сердечные фибробласты и сердечные эндотелиальные клетки.Все вместе эти клетки позволяют перепроверить микроокноронность сердца человека, включая его молекулярные, клеточные и дополнительные клеточные компоненты. Мы используем их в нашей лаборатории для тестирования различных препаратов на эссе о токсичности наркотиков. К ним относятся доксорубицин, известный кардиотоксический препарат, который поражает сердца человека даже спустя годы после его лечения.Мы культурируем сердечные фибробласты, эндотелиальные клетки и миоциты отдельно перед формированием сфероидов. Для того, чтобы вырастить кардиомиоциты, мы собираем флакон от минус 80 градусов и нагреваем его при температуре 37 градусов в течение четырех минут на водяной бане. Затем мы распылим флакон крио с 70%этанолом и переместим его в шкаф для биобезопасности.Мы аккуратно собираем подвеску клетки и переатрат ее в 15-миллилитровую трубку Falcon. Мы собираем один миллилитр довоенной пластины среды, промыть крио флакон один раз, а затем добавить его в 50 миллилитров Сокол трубки, одна капля в то время, каждые четыре секунды. В то время как добавить в покрытие среды, осторожно встряхните трубку Сокола.С помощью клеточной пипетки соберите семь миллилитров покрытия среды и аккуратно добавьте его в 15-миллилитровую трубку Falcon. После добавления конечного объема покрытия среды в трубку Falcon, передача клеточной подвески в фибронектин закодированных фляги ткани. Наконец, перемести ячейки в инкубатор.Через два дня мы собираем флябы из инкубатора и проверяем слияние клеток под микроскопом. В этот момент мы переместим колбу в шкаф для биобезопасности и удалим покрытие среды. Мы аккуратно промыть клетки с той же средой покрытия из ткани колбу четыре или пять раз.Мы заменяем его свежим средством технического обслуживания и переместим в инкубатор еще на один-два дня. В день, когда мы создаем завесы культур, мы собираем все три типа клеток из инкубатора. Мы чип в клетках, удалив средства массовой информации.Мы промыть их с тремя миллилитров PBS. И, наконец, мы добавляем чипы в клетки. Затем колбы перемещаются в инкубатор и инкубируется на срок до пяти минут.Для того, чтобы генерировать сердечные сфероиды, мы со-культуры 20000 клеток на висячие капли. К ним относятся 10 000 кардиомиоцитов, тысяча сердечных фибробластов и 5000 сердечных внутренних клеток. Эти co-культурные в вися падении 384 наилучшим образом плиты.Они помылись с помощью нашей жидкостной системы обработки. Мы также добавляем PBS на боковинах висячих пластин падения, чтобы предотвратить культур от высыхания в инкубаторе. Аккуратно переместите висящую пластину капли, содержащую клетки, в инкубатор.Через три-четыре дня сформируются сфероиды. Мы собираем висячие пластины капли из инкубатора, и мы проверяем, что сфероиды формируются в каждой хорошо. Как показано на этих изображениях, у нас есть набор сфероидов в центре каждой хорошо.После образования мы собираем сфероиды и встраиваем их в коллагеновые гели. Наконечник пипетки разрезают внутри, чтобы предотвратить повреждение сфероидов. Сфероиды собираются и переносятся в 50-миллилитровую трубку Falcon, где они собраны вместе.Мы вращаем суспензию сфероида при 300 G в течение пяти минут, чтобы отделить их от среды. Мы используем темные стены 96 пластин хорошо для изображения сфероидов, средства массовой информации удаляется или заменяется коллагеновым гелем в трубке Сокола. Гидроксид натрия добавляется в суспензию сфероидного геля, прежде чем они помылись в темной пластине стены.100 микролитров суспензии сфероида добавляют в каждую колодец и инкубируется в течение 30 минут при 37 градусах. Препараты, в том числе доксорубицин и другие агенты добавляются в сфероидную пластину и инкубируется в течение 24 часов. На следующий день мы подготовили раствор, содержащий кальций AM и ethidium homodimer, маркировка живут под клетками соответственно.Это решение подготовлено в добавлении копейки к этой фильтровальной пластине. Сфероиды затем инкубируется при 37 градусах в течение одного часа. Мы используем считыватель пластин для измерения флуоресценции кальция AM и их ethidium homodimer в пластине.Эти измерения затем используются нашим программным обеспечением для выполнения статистического анализа. Мы измеряем контрактную активность сфероидов, обработанных различными препаратами с помощью ионооптической системы. Сфероиды перемещаются на сцену между двумя электродами.Это позволяет как контролировать, так и измерять контрактную деятельность по потенциалу на местах. Таким образом, мы можем протестировать различные напряжения и частотные диапазоны, чтобы стимулировать сфероиды. Сфероид в то время изображен, и используется для этих измерений.Сфероиды, которые не получили доксорубицин, смогут построить после электрической стимуляции. Напротив, доксорубицин обработанных сфероидов не будет контракт. Чтобы визуализировать форму эндотелиальной клеточной сети в каждом сфероиде, мы зафиксировали их раствором 4%paraformaldehyde в течение одного часа при комнатной температуре.Мы перенесли пластину в шейкер, который позволяет мягко пронизывания раствора через гель. PFA удаляется и промывается три раза с раствором PBS, содержащим 0,01% оксида натрия. Мы принесли мобилизации, конечно, добавив 0,02%решение Triton X в PVSA в течение 20 минут при комнатной температуре.Блокирующий раствор содержит 3%BSA в PBC, который затем добавляется в тарелку в течение одного часа при комнатной температуре. Раствор, содержащий первичное антитело против CD 31. Маркер для эндотелиального добавляется к пластине, которая затем инкубируется на ночь при четырех градусах.На следующий день первичный раствор антитела удаляется, и пластина трижды промывается раствором PBS, содержащим 0,01% оксида натрия. Вторичный раствор антитела, содержащий шестиугольное пятно, также добавляется к пластине, которая затем инкубируется на ночь при четырех градусах. Наконец, второй раствор антитела удаляется и пластины промыть три раза с раствором PBS, содержащий 0,01% оксида натрия.После пребывания с первичными и вторичными антителами, пластина может быть изображена с помощью нашего конфокального микроскопа. Надлежащая сосудистая сеть имеет решающее значение для выживания и функционирования сердечных клеток. Сердечные сфероиды представляют эндотелиальную клеточную сеть, которая лучше резюмирует тот, который присутствует в сердце человека по сравнению с монослойными культурами сердечных клеток.Учитывая уникальные особенности, сердечные сфероиды представляют собой передовые инструменты для тестирования в пробирке для сердечно-сосудистых исследований.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Многопараметрический Оптический Картирование Langendorff-перфузии сердца кролика

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Анализ трубчатой ​​мембраны сетей в кардиомиоциты от предсердий и желудочков

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Новорожденных сердца Каркасы: Новые Матрицы для регенеративных исследований

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Decellularization всего человеческого сердца внутри под давлением мешочек в Перевернутый ориентации

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...