Name: recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفون لين فوستر على المساعدة التقنية في تجارب العدوى ، وجيمس فيتزباتريك في مركز جامعة واشنطن للتصوير الخلوي (WUCCI) للوصول إلى SEM ، وسكوت هولتغرين على سلالة UTI89kanR UPEC ، وديفيد هونستاد على القراءة النقدية للمخطوطة.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (زمالة أبحاث الدراسات العليا إلى VPO # DGE - 1143954) ، من قبل مركز أبحاث الأمراض المعدية للمرأة في كلية الطب بجامعة واشنطن (جائزة البحث التجريبي إلى NMG) ، من قبل جمعية القلب الأمريكية: #12POST12050583 (NMG) و #14POST20020011 (NMG) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، NIAID: R01 AI114635 (ALL) و NIDDK: R21 DK092586 (الكل) و P50 DK064540-11 (SJH ، المشروع II PI: ALL) و K01 DK110225-01A1 (NMG). أجريت بعض الدراسات على الحيوانات في مرفق مدعوم بمنحة NCRR C06 RR015502. تم دعم مركز جامعة واشنطن للتصوير الخلوي (WUCCI ؛ حيث تم إجراء SEM) و MSJ من قبل كلية الطب بجامعة واشنطن ، ومعهد اكتشاف الأطفال بجامعة واشنطن ومستشفى سانت لويس للأطفال (CDI-CORE-2015-505) ، ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي (3770) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS086741). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.

الخطوة الحاسمة الأولى في هذا النموذج لتحديد الفئران التي لم تزيل البيلة الجرثومية UPEC خلال مرحلة UTI الأولية. يجب إزالة هذه الفئران من التجربة لأنها قد تربك معدلات البيلة الجرثومية UPEC بعد التعرض ل G. vaginalis. بعد التلقيح الأولي UPEC ، يجب جمع البول أسبوعيا لمراقبة إزالة البكتيريا. ما يقرب من 65-80 ٪ من الفئران C57BL / 6 سوف تزيل عدوى UTI89kanR في غضون 4 أسابيع. سلالات الفئران الأخرى المولودة لها ميول مختلفة لإزالة UPEC42,43 وتشكيل الخزان وبالتالي قد لا تكون مناسبة لهذا النموذج. النقطة الحرجة الثانية هي أن الدراسات التجريبية قد حددت أن اثنين من التطعيمات المتسلسلة من G. vaginalis (إما 12 ساعة أو 1 أسبوع) ضروريان لتحفيز ظهور خزان كبير فوق الظهور التلقائي الأساسي الذي يحدث في الفئران الضابطة المعرضة فقط ل PBS. ولم تختبر فترات زمنية أخرى بين التعرضين المتتابعين ولكنها يمكن أن تسفر عن نتائج مماثلة. من المهم ملاحظة أن انخفاضا في عيارات المثانة UPEC لم يلاحظ إلا في النموذج الذي أعطيت فيه التعرض المهبلي ل G. 1 أسبوعا عن39. وفي حين يمكن إعطاء أكثر من تعرضين اثنين، تشير الأدلة التجريبية إلى أن القسطرة المتكررة وحدها تزيد من ظهورها، مما قد يربك تفسير النتائج أو يتطلب أعدادا أكبر من الحيوانات للتمييز بين الاختلافات بين مجموعات التعرض والضوابط. أخيرا ، تحتوي طريقة تثبيت المثانة في الموقع على العديد من الخطوات الحرجة. هناك حاجة إلى بعض المهارات لضمان بقاء المثبت داخل المثانة المثبتة. سيكون من الصعب تصوير المثانة المفرغة بواسطة SEM. من الضروري أيضا أن تكون لطيفا جدا عند تلقيح المثبت في المثانة ، لأن كشط الأوروتيليوم باستخدام القسطرة المحتوية على المثبت يمكن أن يحفز تقشير الظهارة البولية بشكل مستقل عما يسببه G. vaginalis. جميع التركيزات المذكورة في الكوكتيل المثبت هي تركيزات نهائية. يمكن أن تؤدي النسب غير الصحيحة لهذه إلى عدم كفاية التثبيت والتورم أو انكماش الخلايا. يجب تسخين المثبتات إلى درجات الحرارة الفسيولوجية لتجنب صدمة درجة الحرارة في الخلايا والأنسجة. يوفر البرودء أيضا تحسنا طفيفا في معدل انتشار المثبتات من خلال أغشية البلازما. في حين أن تلطيخ الأوزميوم يمكن حذفه في كثير من الأحيان للعينات المعدة لتحليل SEM ، إلا أنه يعد خطوة أساسية في هذا البروتوكول لتحقيق الاستقرار في الدهون ومنع تكسير الأغشية الخلوية أثناء تجفيف النقاط الحرجة.
يمكن تعديل هذا البروتوكول لاختبار سلالات UPEC و / أو G. المهبلية الأخرى لقدرتها على تشكيل الخزانات وتحفيز ظهورها ، على التوالي. يمكن أيضا إضافة عوامل تجريبية أخرى ، مثل التعرض للبكتيريا المهبلية الأخرى (على سبيل المثال ، Lactobacillus crispatus PVAS100) أو G. vaginalis المقتولة حراريا ، ولا يظهر أي منهما علم الأمراض في هذا النموذج39. عند اختيار سلالات بكتيرية أخرى للاختبار ، من المهم إظهار نمو ثابت بحيث يمكن استخدام تركيز التلقيح القياسي في جميع التجارب. تم تحسين نمو JCP8151BSmR في غرفة لاهوائية. من المحتمل أن تزرع هذه السلالة في نظام GasPak اللاهوائي ، لكن هذا يتطلب التحسين لضمان نمو البكتيريا القوي. أخيرا ، قد يكون من الممكن تعديل توقيت خطوات معينة في النموذج. على سبيل المثال ، يمكن جمع البول في نقاط زمنية مبكرة خلال مرحلة تكوين خزان UPEC لمراقبة استجابات CFU أو المضيف. لم يلاحظ في هذا النموذج أي أثر ضار لجمع عينات البول في نقاط زمنية مبكرة (3 ، 6 ، 12 hpi) على تطور العدوى أو إنشاء خزانات. تم الإبلاغ عن ظهور خزانات UPEC بعد إعطاء جرعتين JCP8151BSmR 12 ساعة أو 1 أسبوع، ولكن لم يتم بعد اختبار فترات زمنية أخرى. قد يكون من الممكن أيضا تقليل المدة الزمنية الإجمالية للنموذج عن طريق تقليل مرحلة تكوين خزان UPEC إلى 2 أسابيع (بدلا من 4 أسابيع) ، لأن العديد من الفئران تزيل البيلة الجرثومية بحلول هذا الوقت. استخدمت الدراسات السابقة التي فحصت ظهور UPEC بعد تعرض المثانة للمقشرات الكيميائية مرحلة تكوين خزان UPEC 1 أو 2 أسبوعا17,18. ومع ذلك ، فإن تقليل مقدار الوقت اللازم لإزالة البيلة الجرثومية UPEC قد يأتي على حساب طلب المزيد من الحيوانات لإعدامها من التجربة. أخيرا ، يمكن إجراء تحليل SEM للمثانة في نقاط زمنية إضافية لمراقبة مدة تأثير G. vaginalis على الظهارة البولية.
فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، هناك بعض الاعتبارات المهمة على وجه التحديد فيما يتعلق بتحليل SEM للمثانة. اعتمادا على خلفية الماوس المستخدمة وكمية الالتهاب الموجودة ، ستقدم بعض المثانة بجدران رقيقة جدا. تميل هذه المثانة إلى التجعد أكثر أثناء تجفيف النقاط الحرجة ويمكن أن تؤدي إلى شكل يشبه قشرة البقرة. إذا حدث هذا ، فإن أفضل طريقة هي قطع المثانة على شكل قشرة إلى نصفين على طول الواجهة المجعدة ثم مرة ثانية لإزالة الجزء الأكبر من الأنسجة المتدلية. يعمل القطع بشكل أفضل مع شفرة حلاقة ذات حدين مطلية ب PTFE. يمكن أن تذوب الدهون الزائدة في بعض الأحيان أثناء خطوات تلطيخ الأوزميوم. هذا يمكن أن يؤدي إلى قطرات الدهون غير القابلة للذوبان غير المرغوب فيها التي قد لا تغسل أثناء خطوات الشطف والجفاف والتي يمكن أن تستقر على سطح المثانة أثناء التجفيف اللاحق. يمكن أن تظهر هذه القطرات إما ككرات صغيرة أو هياكل تشبه القرص منتشرة فوق العينة (الشكل 4D). يمكن تخفيف ذلك عن طريق ضمان إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الدهنية من حول المثانة. يمكن استبدال البلاتين بطلاء الإيريديوم ، ولكن يجب الحفاظ على السماكات إلى الحد الأدنى لتقليل إخفاء التفاصيل الهيكلية الدقيقة. يوصى بشدة باستخدام مرحلة دوارة أثناء الطلاء.
أحد قيود هذا النموذج هو أنه يتطلب عددا كبيرا من الفئران. فقط 65-80٪ من الفئران C57BL/6 سوف تزيل البيلة الجرثومية UPEC الخاصة بها وتكون مناسبة لتلقيح G. المهبلي أو PBS اللاحق (انظر الشكل 2C). للحصول على 10-12 فأرا لكل مجموعة (G. التطعيم المهبلي مقابل PBS) ، يجب أن يصاب حوالي 30 فأرا في البداية ب UPEC. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تجارب متعددة لتحقيق النسخ المتماثلة البيولوجية اللازمة للكشف عن الأهمية الإحصائية. عندما تم إعطاء التعرض على بعد 1 أسبوع، حدث ظهور UPEC في 14٪ من الفئران المعرضة ل PBS (الشكل 3B). وبالتالي ، فإن اكتشاف زيادة كبيرة في UPEC rUTI في الفئران المعرضة ل G. vaginalis بالنسبة لعناصر تحكم PBS (التي تعمل بالطاقة عند 0.8 ؛ alpha = 0.05 [جانب واحد]) يتطلب اختبار إجمالي تراكمي لا يقل عن 40 فأرا لكل مجموعة تعرض. وهناك اعتبار إضافي هو أن هذه التجارب مكلفة وكثيفة العمالة. يجب مراقبة الفئران أسبوعيا لإزالة UPEC والدورة الزمنية التجريبية هي 4-5 أسابيع اعتمادا على ما إذا كان يتم إعطاء G. vaginalis مرتين في إطار زمني 12 ساعة أو مرتين 1 أسبوع. SEM كثيف العمالة وقد يكون مكلفا ، اعتمادا على توافر المجهر ورسوم الخدمة. يوفر إعداد المثانة بأكملها ل SEM مادة وفيرة للتحليل ولكن العيب هو أن تحليل كل مثانة يمكن أن يستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فمن المحتمل أنه لا يمكن تحليل سوى عدد محدود من المثانة بواسطة SEM مقارنة بأعداد الحيوانات الأعلى المستخدمة في عيارات البول والأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب الحصول على صور عالية الجودة للأسطح المنحنية ل "أكواب" المثانة مهارة بسبب الظلال التي يمكن أن تعيق الرؤية. على الرغم من أن SEM المثانة هي أداة مفيدة لتصور تقشير الظهارة البولية ، إلا أن هذه الطريقة نوعية إلى حد كبير. نظرا لأن العينة ثابتة في شكل دائري ، وبسبب استخدام glutaraldehyde في المثبت ، فإن فحص البكتيريا التي تعبر عن الفلورسنت عبر المجهر الضوئي غير ممكن. لا تتوافق الأصباغ المناعية والكيميائية مع هذه العملية بسبب استخدام glutaraldehyde الذي سيتقاطع مع معظم المستضدات والأوزميوم والذي سيخفي مواقع المستضدات ويغمق الأنسجة. ومع ذلك ، فإن تقنية SEM مفيدة للمعلمات التي يمكن تقييمها كميا دون استخدام مجسات إضافية ، مثل حجم الخلية48,49.
يقدم هذا النموذج العديد من المزايا التي تتجاوز الطرق الموصوفة سابقا. يسمح بفحص آليات UPEC rUTI الناجمة عن الخروج من خزانات المثانة ، بدلا من إعادة إدخالها في المثانة من مصدر خارجي. تستخدم نماذج أخرى من التهاب المسالك البولية بسبب ظهورها من خزانات المثانة عوامل كيميائية (كبريتات البروتامين أو الشيتوزان) للتسبب في تقشير المسالك البولية17,18 ، والتي لن تكون محفزات لالتهاب المسالك البولية لدى النساء. G. vaginalis هي بكتيريا بولية تناسلية منتشرة تم اكتشافها في البول الذي تم جمعه مباشرة من المثانة عن طريق القسطرة أو الشفط فوق العانة لدى بعض النساء23,26. هذه الحقيقة ، إلى جانب الارتباط المعروف بين BV (حيث ينمو G. vaginalis في المهبل) و UTI ، تشير إلى أن G. vaginalis هو محفز معقول سريريا ل rUTI. وأخيرا، تحافظ طريقة تثبيت المثانة في الموقع على البنية الفائقة للمثانة وتحد من الضرر، مما يضمن عدم انفصال طبقات المثانة عن بعضها البعض. الطرق السابقة لتصور urothelium تقليديا تجعل المستخدم يحصد معقما ، ويقسم ، ويتمدد ، ويعلق المثانة على صينية تشريح قبل غمر المثانة الممتدة في مثبت48. ينتج عن هذه الطريقة عينة مسطحة جدا ولكنها لا تضمن امتدادا متساويا أو طبيعيا للأنسجة ويمكن أن تؤدي إلى مناطق ممتدة أكثر فأقل (مما يؤدي إلى أنسجة شديدة التجاعيد) ويمكن أن تسبب انفصال طبقة المثانة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسبب هذه التلاعب المادي للمثانة لتمديد الأنسجة وتثبيتها أضرارا ، بما في ذلك تقشير المسالك البولية. طريقة أخرى هي غمر المثانة السليمة في التثبيت قبل تضمينها في البارافين والحصول على أقسام رقيقة مع ميكروتوم. الأقسام الرقيقة لا تقدر بثمن لتجارب الكيمياء النسيجية المناعية لفحص البكتيريا وتوطين البروتين المضيف ولكن القسم الرفيع لا يسمح بتصور سطح الظهارة البولية. تسمح طريقة SEM هذه بفحص سطح المثانة بالكامل في وقت واحد.
كما هو موضح، تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج اختبار سلالات UPEC الأخرى لتحديد ما إذا كانت تشكل خزانات داخل الخلايا واختبار سلالات G. vaginalis الأخرى لتقييم ما إذا كانت تثير التقشير وظهور UPEC لتسبب rUTI. يمكن أيضا اختبار سلالات الفئران الأخرى التي تتجاوز C57BL/6 ، على الرغم من أن الفئران ذات الميل العالي للإصابة بالتهاب المثانة المزمن (مثل الفئران على خلفية C3H) غير مستحسنة ، حيث يجب إعدام الكثير من الفئران من التجربة. ميزة إضافية للفئران C57BL/6 هي أن العديد من سلالات الضربة القاضية الجينية متاحة تجاريا. توفر هذه السلالات فرصة لاستجواب العوامل المضيفة المشاركة في تكوين الخزان و / أو ظهوره.

تفرض التهابات المسالك البولية (UTI) عبئا كبيرا على الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ، مما يؤثر على نوعية حياة الملايين من الناس كل عام ، وخاصة النساء1. الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) هي السبب الأكثر شيوعا لعدوى المسالك البولية1. سيعاني العديد من المرضى (حوالي 20-30٪) الذين يصابون بعدوى المسالك البولية من عدوى المسالك البولية المتكررة (rUTI) في غضون 6 أشهر على الرغم من إزالة العدوى الأولية بوساطة المضادات الحيوية2. لسوء الحظ ، يعاني ما يصل إلى 5٪ من النساء قبل انقطاع الطمث من 3 أو أكثر من التهاب المسالك البولية كل عام 3,4. يمكن أن تحدث النوبات المتسلسلة من التهاب المسالك البولية بسبب استمرار نفس سلالة UPEC من الحالة الدالة 5,6,7,8. تشير البيانات المستقاة من العينات البشرية ونماذج الفئران إلى أن التهاب المسالك البولية لنفس السلالة يمكن أن يكون ناجما عن UPEC الموجود داخل خزانات هادئة في المثانة. في البشر ، تم الكشف عن UPEC في الخلايا الظهارية وخزعات المثانة للمرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية9،10،11،12،13. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران C57BL/6 أن بعض سلالات UPEC يمكن أن تنشئ خزانات هادئة داخل الخلايا في المثانة ، كما تم اكتشافها بواسطة الفحص المجهري الفلوري وعن طريق تجانس وزراعة أنسجة المثانة ، والتي يتم الحفاظ عليها لعدة أشهر بعد حل البيلة الجرثومية14،15،16. علاج المثانة بالعوامل التي تحفز تقشير ظهارة المثانة (urothelium) ، على سبيل المثال كبريتات البروتامين17 أو الشيتوزان18 ، يؤدي إلى ظهور UPEC من الخزانات لتسبب rUTI. تشير هذه البيانات إلى أنه في النساء اللواتي يضوين خزانات UPEC للمثانة من عدوى سابقة ، فإن التعرض للمثانة الذي يؤدي إلى تقشير الظهارة البولية قد يؤدي إلى التهاب المسالك البولية (rUTI).
هناك أدلة متزايدة على أن الميكروبات المهبلية تساهم في عدوى المسالك البولية19,20. Gardnerella vaginalis هو عضو متكرر في كل من الميكروبات المهبلية والبولية 21،22،23،24،25،26،27،28،29. في المهبل ، يرتبط وجود مستويات عالية من G. vaginalis ب dysbiosis الميكروبي المعروف باسم التهاب المهبل الجرثومي (BV) ، والذي يؤثر على ~ 30٪ من النساء 30،31،32. النساء المصابات بالتهاب المهبل الوراثي أكثر عرضة لخطر الإصابة بالتهاب المسالك البولية مقارنة بالنساء اللواتي لديهن مجتمع مهبلي تهيمن عليه Lactobacillus 33,34,35,36,37. في نماذج الفئران ، يسبب G. vaginalis تقشيرا ظهاريا في كل من المهبل38 والمثانة39. في الفئران C57BL/6 التي تؤوي خزانات المثانة UPEC ، يؤدي تعرضان متتابعان للمثانة إلى G. vaginalis - ولكن ليس ل PBS - إلى عودة ظهور UPEC من الخزانات لتسبب UPEC rUTI. ويتضح هذا الظهور من خلال ظهور عيارات UPEC في البول من الفئران التي سبق لها حل البيلة البكتيرية UPEC وانخفاض لاحق في عيارات المثانة المتجانسة UPEC عند التضحية مقارنة بالحيوانات الضابطة المعرضة ل PBS39. ومن المثير للاهتمام ، لا يوجد استعمار دائم من قبل G. vaginalis في المثانة. في الغالبية العظمى من الحالات، يكفي تعرضان قصيران، لكل منهما أقل من 12 (ساعة) من G. vaginalis القابل للحياة في البول، للحصول على تقشير الظهارة البولية وتعزيز التهاب المسالك البولية.
يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر من التهاب المسالك البولية الناجم عن UPEC المقيم في خزانات المثانة داخل الخلايا ، باستخدام تلقيح المثانة المهبلية G. المهبلية لتحفيز التكرار. التقدم الذي حققه هذا النموذج هو أن G. vaginalis هو محفز بيولوجي ذي صلة سريريا ل rUTI مقارنة بالعوامل الكيميائية المستخدمة سابقا. علاوة على ذلك ، فإن البقاء على قيد الحياة قصير الأجل نسبيا ل G. vaginalis في المسالك البولية للفأر يسمح بفحص تأثير التعرض الميكروبي العابر على الظهارة البولية ، كما قد يحدث بعد النشاط الجنسي. بالإضافة إلى تحديد نموذج rUTI ، يصف هذا البروتوكول أيضا طرق علم خلايا البول وتثبيت المثانة في الموقع وتصوير اليوروثيليوم عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).
يستخدم هذا البروتوكول من UPEC UTI المتكرر الناجم عن G. المهبلي سلالة UPEC UTI89 التي تحمل كاسيت مقاومة كاناميسين (UTI89kanR)40. لم تكن جميع سلالات UPEC التي تم اختبارها قادرة على تكوين مجتمعات بكتيرية داخل الخلايا خلال مرحلة العدوى الحادة في الفئران41 وليس من المعروف بعد ما إذا كانت جميع سلالات UPEC لديها القدرة على تكوين خزانات كامنة داخل الخلايا. يجب تأكيد تكوين الخزان قبل استخدام سلالات UPEC الأخرى في النموذج. يستخدم هذا البروتوكول عزل G. vaginalis التلقائي المقاوم للستربتومايسين، JCP8151BSmR38. يتطلب تحريض التهاب المسالك البولية بواسطة JCP8151BSmR تطعيمين متتابعين من G. vaginalis ، إما 12 ساعة أو 7 أيام (د) بصرف النظر عن39. يبقى تحديد ما إذا كانت سلالات G. vaginalis الأخرى تحفز التقشير و / أو UPEC rUTI أم لا باستخدام هذا النموذج. من الضروري استخدام سلالات UPEC و G. vaginalis ذات المقاومة المعروفة للمضادات الحيوية (مثل kanamycin أو spectinomycin ل UPEC والستربتومايسين ل G. vaginalis) لأنه يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى ألواح agar لمنع نمو ميكروبات الفئران الداخلية التي يمكن أن تتداخل مع تعداد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لمراقبة العدوى. هذا مهم بشكل خاص لزراعة عينات البول ، لأن بول الفئران يحتوي في كثير من الأحيان على بكتيريا أخرى يمكن أن تنمو على ألواح الثقافة بدون مضادات حيوية. أصل هذه البكتيريا الذاتية المنشأ في بول الفئران غير معروف ولكن من المحتمل أن يعكس البكتيريا حول الإحليل والجهاز البولي التناسلي التي يتم التقاطها أثناء جمع البول.
G. vaginalis هي بكتيريا لاهوائية اختيارية ، وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نمو G. vaginalis JCP8151BSmR في غرفة لاهوائية. إذا لم تكن الغرفة اللاهوائية متوفرة ، فيمكن استخدام طرق أخرى للحفاظ على ظروف النمو اللاهوائي (مثل حقيبة GasPak في حاوية محكمة الإغلاق). بدلا من ذلك ، ستنمو بعض سلالات G. vaginalis (بما في ذلك JCP8151BSmR) في حاضنة قياسية لزراعة الأنسجة (5٪ CO2). تماما كما يتطلب استخدام سلالات G. vaginalis بخلاف JCP8151BSmR اختبارا للتأكد من أن البكتيريا تتصرف بشكل مماثل في هذا النموذج ، فإن ظروف النمو المتغيرة تتطلب تحديدا تجريبيا لفترات مثالية للزراعة (على الألواح وفي السائل) وما يعادلها من الكثافة البصرية (OD) 600 لتحقيق تركيزات التلقيح القابلة للحياة المطلوبة. علاوة على ذلك ، من غير المعروف ما إذا كانت ظروف النمو تؤثر على البيولوجيا المرضية ل G. vaginalis.
أخيرا ، عند النظر في استخدام هذا النموذج ، يجب أن يدرك الباحثون أنه يمكن أن يتطلب أعدادا أكبر من الحيوانات لكل مجموعة مقارنة بنماذج فئران UTI النموذجية. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن تحريض التهاب المسالك البولية يتطلب أن تحل الفئران البيلة البكتيرية UPEC الناجمة عن العدوى الأولية للمثانة. وبالتالي ، فإن أي فأر يفشل في إزالة البيلة الجرثومية (النمط الظاهري عادة ما يشير إلى عدوى الكلى المستمرة) لا يتم تضمينه في مرحلة rUTI من البروتوكول. يتأثر عدد الفئران اللازمة لتشغيل هذه الدراسات أيضا بمعدل ظهور UPEC "التلقائي" في البول (12-14٪ في المتوسط). وأخيرا ، فإن سلالات الفئران المختلفة لها ميول مختلفة لتطوير البيلة الجرثومية المزمنة مقابل تكوين الخزان داخل الخلايا42,43. إذا كنت تستخدم سلالات الفئران بخلاف C57BL/6 في هذا النموذج ، فيجب التأكد من أن الحيوانات تطور خزانات UPEC هادئة داخل الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

التهابات المسالك البولية المتكررة (rUTI) الناجمة عن الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) شائعة ومكلفة. وقد أوضحت المقالات السابقة التي تصف نماذج التهاب المسالك البولية في الفئران الذكور والإناث إجراءات التلقيح البكتيري والتعداد في البول والأنسجة. أثناء عدوى المثانة الأولية في الفئران C57BL/6 ، تنشئ UPEC خزانات كامنة داخل الخلايا الظهارية للمثانة التي تستمر بعد إزالة البيلة البكتيرية UPEC. يعتمد هذا النموذج على هذه الدراسات لفحص التهاب المسالك البولية الناجم عن ظهور UPEC من داخل خزانات المثانة الكامنة. تستخدم بكتيريا Gardnerella المهبلية البولية التناسلية كمحفز لالتهاب المسالك البولية في هذا النموذج لأنها موجودة بشكل متكرر في المسالك البولية التناسلية للنساء ، خاصة في سياق dysbiosis المهبلي الذي ارتبط بالتهاب المسالك البولية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة لتثبيت المثانة في الموقع متبوعة بتحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لأنسجة المثانة ، مع إمكانية تطبيقها على دراسات أخرى تشمل المثانة.

بعد التلقيح ، يمكن اكتشاف عيارات UPEC في البول (الشكل 2B). من المرجح أن يؤدي الفشل في وضع عينات البول على وسائط انتقائية تحتوي على كاناميسين إلى فرط نمو ميكروبات الفئران الداخلية التي تلوث البول. من المرجح أن يكون مستوى البيلة الجرثومية UPEC مرتفعا في اليوم 1 وقد يزداد خلال الأسبوع الأول قبل أن ينخفض في نقاط زمنية لاحقة (الشكل 2C). ما يقرب من 65-80 ٪ من الفئران لن يكون لديها UPEC يمكن اكتشافها في البول بنسبة 28 نقطة في البوصة (الشكل 2C ، الدائرة الخضراء). يمكن استخدام هذه الفئران في الخطوات اللاحقة للنموذج. يجب القضاء على الفئران التي لا تزال بكتيرية (الشكل 2C ، القطع الناقص الأحمر) من التجربة.
يؤدي تعرضان متتابعان ل G. vaginalis يعطيان 12 ساعة (الشكل 3A) أو 1 أسبوعا (الشكل 3B) إلى ظهور UPEC من الخزانات داخل الخلايا لتسبب البيلة الجرثومية المتكررة. كل من مستوى البيلة البكتيرية UPEC (اختبار مان-ويتني) وجزء الفئران التي تعرض UPEC rUTI (اختبار فيشر الدقيق) أعلى بكثير في الفئران المعرضة ل G. vaginalis مقارنة بمجموعة التحكم PBS. يكتشف تحليل خلايا البول PMNs في البول من الفئران المعرضة ل G. المهبل التي أظهرت ظهور UPEC (الشكل 3C). في النموذج الذي يحتوي على تعرضين يعطيان على بعد 1 أسبوع، تكون عيارات UPEC في أنسجة المثانة أقل في الفئران المعرضة ل G. المهبلية مقارنة ب PBS (الشكل 3D)، ويرجع ذلك على الأرجح إلى ظهور UPEC من الخزانات والإزالة اللاحقة.
يكشف تصور أنسجة المثانة الثابتة في الموقع بواسطة SEM عن خلايا عظمية سطحية سطحية كبيرة تبطن سطح المثانة في الفئران الضابطة المعرضة فقط ل PBS (الشكل 4A). يتضح التقشير البولي من خلال فقدان الخلايا المظلية السطحية ، مما يكشف عن خلايا ظهارية انتقالية أصغر في الفئران المعرضة ل G. vaginalis (الشكل 4B). في وقت مبكر بعد تلقيح UPEC أثناء إنشاء خزانات داخل الخلايا ، تكون UPEC مرئية على urothelium وخيوط من خلايا التقشير (الشكل 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> الشكل 2. مراقبة عيار UPEC في البول خلال المرحلة 1 (تكوين الخزان). (أ) التخطيط لطلاء وحدات تشكيل المستعمرات (CFU). (ب) صورة تمثيلية لعيار UPEC في البول على LB + kanamycin. تشير الدوائر السوداء إلى بقع عينة البول التي يجب حسابها لحساب CFU / mL. (ج) المسار الزمني للبيلة الجرثومية UPEC في الفئران C57BL/6. يمثل كل خط فأرة فردية ، يتتبع عيارات البول UPEC بمرور الوقت. يشير الخط المنقط إلى حد الكشف (1000 CFU / mL). يشير القطع الناقص الأحمر إلى أربعة فئران (من أصل 20) فشلت في حل البيلة البكتيرية UPEC وبالتالي لن يتم استخدامها لنموذج rUTI الناجم عن G. vaginalis. على العكس من ذلك ، تشير الدائرة الخضراء إلى الفئران التي حلت البيلة الجرثومية UPEC وانتقلت إلى المراحل اللاحقة. (د) جدول البيانات المستخدمة لإنشاء رسم بياني في اللوحة C. Yellow، CFU القابلة للكشف؛ أخضر ، لا CFU. (ه) التوزيع العشوائي للفئران إلى مجموعات التعرض استنادا إلى النقطة الزمنية التي لم تعد فيها وحدة المعالجة المركزية التابعة للاتحاد العالمي لنقابات العمال تكتشف في البول ("تم حلها في اليوم"). أرقام الماوس في العمود الأيسر من اللوحة D هي نفس أرقام الماوس الواردة في اللوحة E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> الشكل 3. G. المهبل يحفز UPEC rUTI. عيارات UPEC في البول بعد تعرضين متتابعين للمسالك البولية ل PBS (الدوائر) أو G. vaginalis (Gvag ؛ مربعات) تعطى 12 ساعة (A) أو 1 أسبوعا (B) على حدة. يمثل كل رمز ماوس فردي. يتم رسم أعلى CFU / mL UPEC المكتشفة من كل ماوس بين 1-3 d بعد التعرض الثاني. يتم رسم الفئران التي لا تحتوي على بيلة بكتيرية يمكن اكتشافها عند حد الكشف (الخط المنقط). (ج) تحليل خلايا البول الذي يظهر خلايا UPEC (رؤوس الأسهم) والخلايا النووية المتعددة الأشكال (PMN) (الأسهم). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (د) عيارات UPEC في أنسجة المثانة التي تم جمعها 3 d بعد تعرضين متتابعين للمسالك البولية يعطيان 1 أسبوعا منفصلا. يمثل كل رمز ماوس مختلفا ويتم رسم الأصفار عند حد الكشف (الخط المنقط). في A و B و D ، تكون الصناديق في الربع الأول والثالث مع وضع علامة على المتوسط والشعيرات من الحد الأقصى لاختبارات Mann-Whitney U * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01 ؛ P < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> الشكل 4. تحليل SEM للمثانة الثابتة في الموقع. تم جمع المثانة من الفئران بعد 3 ساعات من التعرض (12 ساعة على حدة) إلى PBS (A) أو G. vaginalis (C). توضح الخطوط المنقطة خلية ظهارية بولية واحدة ، وهي أصغر في المثانة المعرضة ل G. المهبلية لأن الخلايا السطحية الكبيرة قد تقشرت بعيدا مما يكشف عن الظهارة الانتقالية الأساسية. (ب) المثانة التي تم جمعها بعد 6 ساعات من التلقيح الأولي باستخدام UPEC ، خلال المرحلة 1 من النموذج ، والتي تظهر التقشير البولي الظهاري و UPEC خارج الخلية. (د) مثال على قطرات الدهون غير القابلة للذوبان الموجودة على سطح المثانة. أشرطة المقياس هي 20 ميكرومتر في الصور الرئيسية و 2 ميكرومتر في الجزء الداخلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

تم إثبات نموذج الفأر للتلقيح عبر الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) لإنشاء خزانات المثانة الكامنة داخل الخلايا والتعرض اللاحق للمثانة ل G. vaginalis للحث على UPEC UTI المتكرر. كما ثبت تعداد البكتيريا ، وعلم خلايا البول ، وتثبيت المثانة في الموقع ومعالجتها للمجهر الإلكتروني الماسح.

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

التهاب القرنية العقبولي المتكررة اللحمية في الفئران، وهذا نموذج لدراسة الإنسان HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

واحد خطوة السلبية الكروماتوغرافي تنقية<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; بروتين العدلات، تفعيل Overexpressed في<em&gt; كولاي</em&gt; في دفعة واسطة

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

عدوى المسالك البولية في نموذج حيوانات صغيرة: قسطرة Transurethral من الفئران الذكور والإناث

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

عزل واحد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا التي تم إنشاؤها من نموذج موريني لعدوى المسالك البولية لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...