Name: recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Lynne Foster for teknisk bistand i infektionseksperimenter, James Fitzpatrick ved Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) for adgang til SEM, Scott Hultgren for UTI89kanR UPEC-stammen og David Hunstad for kritisk læsning af manuskriptet.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (Graduate Research Fellowship til VPO # DGE - 1143954), af Center for Women's Infectious Disease Research ved Washington University School of Medicine (Pilot Research Award til NMG), af American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) og #14POST20020011 (NMG) og af National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) og NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) og K01 DK110225-01A1 (NMG). Nogle af dyreforsøgene blev udført i et anlæg støttet af NCRR-bevilling C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; hvor SEM blev udført) og MSJ blev støttet af Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) og National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet.

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter i forbindelse med denne undersøgelse.

Det første kritiske trin i denne model til at identificere mus, der ikke har ryddet UPEC-bakteriuri i den primære UTI-fase. Disse mus skal fjernes fra eksperimentet, da de ellers ville forvirre satserne for UPEC-bakteriuri efter G. vaginalis eksponering. Efter den indledende UPEC-podning skal urin opsamles ugentligt for at overvåge bakteriel clearance. Ca. 65-80% af C57BL /6 mus vil rydde en UTI89kanR infektion inden for 4 uger. Andre indavlede musestammer har forskellige tilbøjeligheder til UPEC-clearance42,43 og reservoirdannelse og er derfor muligvis ikke egnede til denne model. Det andet kritiske punkt er, at empiriske undersøgelser har fastslået, at to sekventielle podninger af G. vaginalis (enten 12 timer eller 1 wk fra hinanden) er nødvendige for at udløse signifikant reservoirfremkomst over baggrunden spontan fremkomst, der forekommer i kontrolmus, der kun udsættes for PBS. Andre varigheder af tid mellem de to sekventielle eksponeringer er ikke blevet testet, men kunne give lignende resultater. Det er vigtigt at bemærke, at en reduktion i UPEC blæretitre kun blev observeret i modellen, hvor G. vaginalis eksponeringer blev givet 1 wk fra hinanden39. Mens mere end to eksponeringer kan administreres, tyder empiriske beviser på, at gentagen kateterisering alene øger fremkomsten, hvilket kan forvirre fortolkningen af resultaterne eller kræve et større antal dyr for at skelne forskelle mellem eksponeringsgrupper og kontroller. Endelig har in situ blærefikseringsmetoden flere kritiske trin. En vis færdighed er nødvendig for at sikre, at fikseringsmidlet forbliver inde i de fastspændte blærer. Deflaterede blærer vil være vanskeligere at forestille sig af SEM. Det er også vigtigt at være meget forsigtig, når man poder fikseringsmidlet i blæren, da skrabning af urotelet med det fikseringsholdige kateter kan fremkalde urotelial eksfoliering uafhængigt af, hvad der udløses af G. vaginalis. Alle koncentrationer, der er nævnt i den fikserende cocktail, er endelige koncentrationer. Forkerte forhold mellem disse kan resultere i utilstrækkelig fastgørelse og hævelse eller krympning af cellerne. Fikseringsmidler bør opvarmes til fysiologiske temperaturer for at undgå temperaturchok i celler og væv. Opvarmning giver også en lille forbedring af diffusionshastigheden af fikseringsmidler gennem plasmamembraner. Mens osmiumfarvning ofte kan udelades for prøver, der er forberedt til SEM-analyse, er det et vigtigt skridt i denne protokol at stabilisere lipider og forhindre revner i cellulære membraner under kritisk punkttørring.
Denne protokol kan ændres for at teste andre UPEC- og / eller G. vaginalis-stammer for deres evne til at danne reservoirer og udløse deres fremkomst. Andre eksperimentelle faktorer kan også tilføjes, såsom eksponering for andre vaginale bakterier (f.eks. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller varmedræbt G. vaginalis, hvoraf ingen viser patologi i denne model39. Ved valg af andre bakteriestammer, der skal testes, er det vigtigt at demonstrere konsekvent vækst, således at en standard podekoncentration kan anvendes i alle forsøg. Væksten af JCP8151BSmR er optimeret i et anaerobt kammer. Denne stamme kunne sandsynligvis dyrkes i et anaerobt GasPak-system, men dette ville kræve optimering for at sikre robust bakterievækst. Endelig kan det være muligt at ændre timingen af visse trin i modellen. For eksempel kan urin opsamles på tidligere tidspunkter under UPEC-reservoirdannelsesfasen for at overvåge CFU eller værtsresponser. En negativ virkning af indsamling af urinprøver på tidlige tidspunkter (3, 6, 12 hpi) på progression af infektion eller etablering af reservoirer er ikke blevet observeret i denne model. Fremkomsten af UPEC-reservoirer er rapporteret at forekomme efter to JCP8151BSmR-doser givet 12 timer eller 1 wk, men andre tidsintervaller er endnu ikke blevet testet. Det kan også være muligt at reducere den samlede tid for modellen ved at reducere UPEC-reservoirdannelsesfasen til 2 uger (snarere end 4 uger), da mange af musene rydder bakteriuri på dette tidspunkt. Tidligere undersøgelser, der undersøgte UPEC-fremkomsten efter blæreeksponering for kemiske eksfolieringsmidler, anvendte en 1 eller 2 wk UPEC-reservoirdannelsesfase17,18. En reduktion af tiden til UPEC-godkendelse af bakteriuri kan dog komme på bekostning af at kræve, at flere dyr skal aflives fra forsøget. Endelig kan SEM-analyse af blæren udføres på yderligere tidspunkter for at observere varigheden af virkningen af G. vaginalis på urotelium.
Med hensyn til fejlfinding er der nogle vigtige overvejelser specifikt med hensyn til blære SEM-analysen. Afhængigt af den anvendte musebaggrund og mængden af betændelse til stede, vil nogle blærer præsentere med meget tynde vægge. Disse blærer har tendens til at krølle mere under kritisk punkttørring og kan resultere i en cowrie shell-lignende form. Hvis dette sker, er den bedste metode at skære den skalformede blære i halvdelen langs den krøllede grænseflade og derefter en anden gang for at fjerne størstedelen af det overhængende væv. Skæring fungerer bedst med et PTFE-belagt tveægget barberblad. Overskydende fedt kan undertiden opløses under osmiumfarvningstrinnene. Dette kan resultere i uønskede uopløselige fedtdråber, der muligvis ikke vaskes af under skylnings- og dehydreringstrinnene, og som kan sætte sig på blæreoverfladen under efterfølgende tørring. Disse dråber kan vises som enten små kugler eller disklignende strukturer spredt over prøven (figur 4D). Dette kan afbødes ved at sikre, at så meget fedtvæv fjernes fra omkring blæren som muligt. Platin kan erstattes af iridiumbelægning, men tykkelser bør holdes på et minimum for at reducere maskering af fine strukturelle detaljer. Brug af et roterende trin under belægning anbefales stærkt.
En begrænsning ved denne model er, at den kræver et stort antal mus. Kun 65-80% af C57BL/6-mus vil rydde deres UPEC-bakteriuri og være egnede til efterfølgende G. vaginalis- eller PBS-podning (se figur 2C). For at opnå 10-12 mus pr. gruppe (G. vaginalis inokulation vs. PBS) skal ~30 mus i første omgang inficeret med UPEC. Endvidere kræves der sandsynligvis flere eksperimenter for at opnå de biologiske replikater, der er nødvendige for at detektere statistisk signifikans. Når eksponeringer blev givet 1 wk fra hinanden, forekom UPEC-fremkomst hos 14% af mus udsat for PBS (figur 3B). Påvisning af en signifikant stigning i UPEC rUTI i G. vaginalis eksponerede mus i forhold til PBS-kontroller (drevet ved 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) kræver test af et kumulativt total på mindst 40 mus for hver eksponeringsgruppe. En yderligere overvejelse er, at disse eksperimenter er dyre og arbejdskrævende. Mus skal overvåges ugentligt for UPEC-clearance, og det eksperimentelle tidsforløb er 4-5 wk afhængigt af om G. vaginalis gives to gange inden for en 12 timers tidsramme eller to gange 1 wk fra hinanden. SEM er arbejdskrævende og kan være dyrt afhængigt af mikroskoptilgængelighed og servicegebyrer. Forberedelse af hele blæren til SEM giver rigeligt materiale til analyse, men ulempen er, at analyse af hver blære kan være tidskrævende. Det er således sandsynligt, at kun et begrænset antal blærer kan analyseres af SEM sammenlignet med de højere dyretal, der anvendes til urin- og vævstitre. Derudover kræver opnåelse af højkvalitetsbilleder af blærens "kopper" dygtighed på grund af skygger, der kan hindre synligheden. Selvom blære SEM er et nyttigt værktøj til visualisering af uroteleksfoliering, er denne metode stort set kvalitativ. Da prøven er fastgjort i en rund form, og på grund af brugen af glutaraldehyd i fikseringsmidlet, er screening for fluorescerende ekspressive bakterier via lysmikroskopi ikke mulig. Immunostaining og kemiske farvestoffer er uforenelige med denne proces på grund af brugen af glutaraldehyd, der vil krydsbinde de fleste antigener og osmium, og som vil maskere antigensteder og mørkere vævet. Når det er sagt, er SEM-teknikken nyttig til parametre, der kan evalueres kvantitativt uden brug af yderligere sonder, såsom cellestørrelse48,49.
Denne model giver flere fordele ud over tidligere beskrevne metoder. Det tillader undersøgelse af mekanismer af UPEC rUTI forårsaget af fremkomst fra blærereservoirer, i modsætning til genindførelse i blæren fra en ekstern kilde. Andre modeller af rUTI på grund af fremkomst fra blærereservoirer bruger kemiske agenser (protaminsulfat eller chitosan) til at forårsage urotel eksfoliering 17,18, hvilket ikke ville være udløsere af rUTI hos kvinder. G. vaginalis er en udbredt urogenital bakterie, der er blevet påvist i urin opsamlet direkte fra blæren via kateterisering eller suprapubisk aspiration hos nogle kvinder23,26. Denne kendsgerning kombineret med den kendte sammenhæng mellem BV (hvor G. vaginalis vokser i vagina) og UTI tyder på, at G. vaginalis er en klinisk plausibel udløser af rUTI. Endelig bevarer in situ blærefikseringsmetoden blærens ultrastruktur og begrænser skader, hvilket sikrer, at blærelagene ikke adskiller sig fra hinanden. Tidligere metoder til visualisering af urotelet har traditionelt brugeren aseptisk høstet, skåret, stræk og fastgør blæren på en dissektionsbakke, før den strakte blære nedsænkes i fiksering48. Denne metode resulterer i en meget flad prøve, men sikrer ikke jævn eller naturlig strækning af vævet og kan resultere i områder, der er over og under strakt (hvilket resulterer i stærkt rynket væv) og kan forårsage blærelagsseparation. Derudover kan disse fysiske manipulationer af blæren for at strække og fastgøre vævet forårsage skade, herunder urotel eksfoliering. En anden metode er at nedsænke intakte blærer i fikseringsmiddel, før de indlejres i paraffin og erhverver tynde sektioner med et mikrotom. Tynde sektioner er uvurderlige til immunhistokemiske eksperimenter for at undersøge bakterier og værtsproteinlokalisering, men en tynd sektion tillader ikke visualisering af uroteloverfladen. Denne SEM-metode gør det muligt at undersøge overfladen af hele blæren på én gang.
Som beskrevet omfatter fremtidige anvendelser af denne model test af andre UPEC-stammer for at afgøre, om de danner intracellulære reservoirer og test af andre G. vaginalis-stammer for at vurdere, om de fremkalder eksfoliering og UPEC-fremkomst for at forårsage rUTI. Andre musestammer ud over C57BL/6-mus kan også testes, selvom mus med en høj tilbøjelighed til at udvikle kronisk blærebetændelse (såsom mus på C3H-baggrund) ikke anbefales, da for mange mus skal fjernes fra forsøget. En yderligere fordel ved C57BL/6-mus er, at mange genetiske knockout-stammer er kommercielt tilgængelige. Sådanne stammer giver mulighed for at forhøre sig om de værtsfaktorer, der er involveret i reservoirdannelse og/eller fremkomst.

Urinvejsinfektioner (UTI) pålægger en betydelig sundhedsbyrde på verdensplan og påvirker livskvaliteten for millioner af mennesker hvert år, især kvinder1. Uropatogen escherichia coli (UPEC) er den hyppigste årsag til UTI1. Mange patienter (ca. 20-30%), der udvikler UTI, vil opleve en tilbagevendende UTI (rUTI) inden for 6 måneder på trods af antibiotikamedieret clearance af den oprindelige infektion2. Desværre lider så mange som 5% af præmenopausale kvinder af 3 eller flere rUTI hvert år 3,4. Sekventielle episoder af rUTI kan være forårsaget af persistens af den samme UPEC-stamme fra indekstilfældet 5,6,7,8. Data fra humane prøver og musemodeller tyder på, at rUTI af samme stamme kan være forårsaget af UPEC, der befinder sig i hvilende reservoirer i blæren. Hos mennesker blev UPEC påvist i epitelceller og blærebiopsier hos patienter med UTI 9,10,11,12,13. Undersøgelser i C57BL/6-mus har vist, at nogle stammer af UPEC kan etablere hvilende intracellulære reservoirer i blæren, som påvist ved fluorescensmikroskopi og ved homogenisering og dyrkning af blærevæv, der opretholdes i flere måneder efter opløsning af bakteriuri 14,15,16. Behandling af blæren med midler, der inducerer eksfoliering af blæreepitelet (urotelium), fx protaminsulfat17 eller chitosan18, udløser fremkomst af UPEC fra reservoirer for at forårsage rUTI. Disse data tyder på, at hos kvinder, der har blære UPEC-reservoirer fra en tidligere infektion, kan blæreeksponeringer, der fører til urotelial eksfoliering, udløse rUTI.
Der er stigende beviser for, at den vaginale mikrobiota bidrager til urinvejsinfektion19,20. Gardnerella vaginalis er et hyppigt medlem af både vaginal og urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I vagina er tilstedeværelsen af høje niveauer af G. vaginalis forbundet med en mikrobiel dysbiose kendt som bakteriel vaginose (BV), som påvirker ~ 30% af kvinderne 30,31,32. Kvinder med BV har en højere risiko for at opleve UTI sammenlignet med kvinder med et vaginalt samfund domineret af Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musemodeller forårsager G. vaginalis epitel eksfoliering både i vagina38 og i blæren39. I C57BL/6-mus, der huser UPEC-blærereservoirer, resulterer to sekventielle blæreeksponeringer for G. vaginalis - men ikke pbs - i genopståen af UPEC fra reservoirer for at forårsage UPEC rUTI. Fremkomsten fremgår af forekomsten af UPEC-titere i urin fra mus, der tidligere havde løst UPEC-bakteriuri og et efterfølgende fald i UPEC-blærehomogenattitre ved ofring sammenlignet med PBS-eksponerede kontroldyr39. Interessant nok er der ikke en varig kolonisering af G. vaginalis i blæren. I langt de fleste tilfælde er to korte eksponeringer, hver med mindre end 12 (h) levedygtig G. vaginalis i urinen, tilstrækkelige til at fremkalde uroteleksfoliering og fremme rUTI.
Denne protokol beskriver en musemodel af rUTI forårsaget af UPEC bosiddende i intracellulære blærereservoirer ved hjælp af G. vaginalis blærepodning for at udløse gentagelsen. Fremskridtet opnået med denne model er, at G. vaginalis er en klinisk relevant biologisk udløser af rUTI sammenlignet med tidligere anvendte kemiske agenser. Endvidere tillader den relativt kortvarige overlevelse af G. vaginalis i musens urinveje undersøgelse af virkningen af forbigående mikrobielle eksponeringer på urotelium, som det kan forekomme efter seksuel aktivitet. Ud over at skitsere rUTI-modellen beskriver denne protokol også metoder til urincytologi og in situ blærefiksering og billeddannelse af urotelet ved scanning af elektronmikroskopi (SEM).
Denne protokol af G. vaginalis-induceret tilbagevendende UPEC UTI bruger UPEC stamme UTI89 bærer en kanamycin resistens kassette (UTI89kanR)40. Ikke alle testede stammer af UPEC var i stand til at danne intracellulære bakteriesamfund under det akutte infektionsstadium hos mus41 , og det vides endnu ikke, om alle stammer af UPEC har evnen til at danne latente intracellulære reservoirer. Reservoirdannelse skal bekræftes inden brug af andre UPEC-stammer i modellen. Denne protokol bruger et spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induktion af rUTI af JCP8151BSmR kræver to sekventielle G. vaginalis-podninger , givet enten 12 timer eller 7 dage (d) fra hinanden39. Hvorvidt andre G. vaginalis-stammer inducerer eksfoliering og/eller UPEC rUTI, skal stadig bestemmes med denne model. Det er vigtigt at bruge UPEC- og G. vaginalis-stammer med kendt antibiotikaresistens (såsom kanamycin eller spectinomycin til UPEC og streptomycin til G. vaginalis), fordi antibiotika kan tilsættes til agarplader for at forhindre vækst af endogen musemikrobiota, der ellers kunne forstyrre opregnende kolonidannende enheder (CFU) for at overvåge infektion. Dette er især vigtigt for dyrkning af urinprøver, fordi museurin ofte indeholder andre bakterier, der kan vokse på kulturplader uden antibiotika. Oprindelsen af disse endogene bakterier i museurin er ukendt, men afspejler sandsynligvis periuretrale og urogenitale bakterier, der afhentes under urinopsamling.
G. vaginalis er en fakultativ anaerob bakterie, og derfor beskriver denne protokol voksende G. vaginalis JCP8151BSmR i et anaerobt kammer. Hvis et anaerobt kammer ikke er tilgængeligt, kan andre metoder til opretholdelse af anaerobe vækstbetingelser (såsom en GasPak-pose i en lufttæt beholder) anvendes. Alternativt vil nogle stammer af G. vaginalis (herunder JCP8151BSmR) vokse i en standard vævskulturinkubator (5% CO2). Ligesom brug af andre G. vaginalis-stammer end JCP8151BSmR kræver test for at sikre, at bakterierne opfører sig på samme måde i denne model, kræver ændrede vækstbetingelser empirisk bestemmelse af ideelle varigheder for dyrkning (på plader og i væske) og optisk densitet (OD) 600 ækvivalenter for at opnå ønskede levedygtige podekoncentrationer. Desuden vides det ikke, om vækstbetingelser påvirker patobiologien af G. vaginalis.
Endelig, når man overvejer, om man skal bruge denne model, skal forskere være opmærksomme på, at det kan kræve et større antal dyr pr. Gruppe end typiske UTI-musemodeller. Dette skyldes til dels, at induktion af rUTI kræver, at musene løser UPEC-bakteriurien forårsaget af den første infektion i blæren. Således er enhver mus, der ikke rydder bakteriuri (en fænotype, der normalt indikerer igangværende nyreinfektion), ikke inkluderet i protokollens rUTI-fase. Antallet af mus, der er nødvendige for at drive disse undersøgelser, påvirkes også af hastigheden af "spontan" UPEC-fremkomst i urinen (12-14% i gennemsnit). Endelig har forskellige musestammer forskellige tilbøjeligheder til at udvikle kronisk bakteriuri versus intracellulær reservoirdannelse42,43. Hvis der anvendes andre musestammer end C57BL/6 i denne model, skal det bekræftes, at dyrene udvikler hvilende UPEC intracellulære reservoirer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Tilbagevendende urinvejsinfektioner (rUTI) forårsaget af uropatogen escherichia coli (UPEC) er almindelige og dyre. Tidligere artikler, der beskriver modeller af UTI hos han- og hunmus, har illustreret procedurerne for bakteriel podning og optælling i urin og væv. Under en indledende blæreinfektion hos C57BL/6-mus etablerer UPEC latente reservoirer inde i blæreepitelceller, der vedvarer efter clearance af UPEC-bakteriuri. Denne model bygger på disse undersøgelser for at undersøge rUTI forårsaget af fremkomsten af UPEC fra latente blærereservoirer. Den urogenitale bakterie Gardnerella vaginalis bruges som udløser af rUTI i denne model, fordi den ofte er til stede i kvinders urogenitale kanaler, især i forbindelse med vaginal dysbiose, der har været forbundet med UTI. Derudover beskrives også en metode til in situ blærefiksering efterfulgt af scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse af blærevæv med potentiel anvendelse på andre undersøgelser, der involverer blæren.

Efter podning kan UPEC-titere påvises i urinen (figur 2B). Manglende plade urinprøver på selektive medier indeholdende kanamycin vil sandsynligvis resultere i overvækst af endogen musemikrobiota, der forurener urinen. Niveauet af UPEC bakteriuri vil sandsynligvis være højt på dag 1 og kan stige i løbet af den første uge, før det falder på senere tidspunkter (figur 2C). Ca. 65-80% af musene vil ikke have nogen påviselig UPEC i urinen med 28 dpi (figur 2C, grøn cirkel). Disse mus kan bruges i de efterfølgende trin i modellen. Mus, der forbliver bakteriuriske (figur 2C, rød ellipse) bør elimineres fra forsøget.
To sekventielle G. vaginalis-eksponeringer givet 12 timer (figur 3A) eller 1 wk fra hinanden (figur 3B) resulterer i fremkomsten af UPEC fra intracellulære reservoirer for at forårsage tilbagevendende bakteriuri. Både niveauet af UPEC-bakteriuri (Mann-Whitney-test) og andelen af mus, der viser UPEC rUTI (Fishers nøjagtige test), er signifikant højere hos mus udsat for G. vaginalis sammenlignet med PBS-kontrolgruppen. Urincytologianalyse detekterer PMN'er i urinen fra G. vaginalis-eksponerede mus, der viste UPEC-fremkomst (figur 3C). I modellen med to eksponeringer givet 1 wk fra hinanden er UPEC-titere i blærevæv lavere i G. vaginalis-eksponerede mus sammenlignet med PBS (figur 3D), formodentlig på grund af fremkomsten af UPEC fra reservoirer og efterfølgende clearance.
Visualisering af in situ-fikseret blærevæv ved SEM afslører store overfladiske paraplyurotelceller, der forer blæreoverfladen i kontrolmus, der kun udsættes for PBS (figur 4A). Urotelial eksfoliering fremgår af et tab af overfladiske paraplyceller, der afslører mindre underliggende overgangsepitelceller hos mus udsat for G. vaginalis (figur 4B). Tidligt efter UPEC-podning under etablering af intracellulære reservoirer er UPEC synlig på urotelium og filamentering ud af eksfolierende celler (figur 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figur 2. Overvågning af UPEC-titere i urinen i fase 1 (reservoirdannelse). (A) Skematisk af kolonidannende enheder (CFU) plettering. (B) Repræsentativt billede af UPEC-titere i urinen på LB+kanamycin. Sorte rande angiver urinprøvepletter, der skal tælles for at beregne CFU / ml. (C) Tidsforløb for UPEC-bakteriuri i C57BL/6-mus. Hver linje repræsenterer en individuel mus, der sporer UPEC-urintitrene over tid. Stiplet linje angiver detektionsgrænsen (1000 CFU/ml). Rød ellipse indikerer fire mus (ud af 20), der ikke kunne løse UPEC-bakteriuri og derfor ikke ville blive brugt til G. vaginalis-induceret rUTI-model. Omvendt indikerer grøn cirkel mus, der løste UPEC bakteriuri og fortsatte til efterfølgende faser. (D) Tabel over data, der anvendes til at generere graf i panel C. Gul, påviselig CFU; grøn, ingen CFU. (E) Randomisering af mus i eksponeringsgrupper baseret på det tidspunkt, hvor UPEC CFU ikke længere blev påvist i urinen ("Dag løst"). Musenumrene i venstre kolonne i panel D er de samme musenumre, der er angivet i panel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figur 3. G. vaginalis udløser UPEC rUTI. UPEC-titere i urinen efter to sekventielle urinvejseksponeringer for PBS (cirkler) eller G. vaginalis (Gvag; kvadrater) givet 12 timer (A) eller 1 wk (B) fra hinanden. Hvert symbol repræsenterer en individuel mus. Den højeste CFU/ml UPEC, der er påvist fra hver mus mellem 1-3 d efter den anden eksponering, afbildes. Mus uden påviselig bakteriuri afbildes ved detektionsgrænsen (stiplet linje). (C) Urincytologianalyse, der viser UPEC (pilespidser) og polymorfonukleære (PMN) celler (pile). Skala bar = 20 μm. (D) UPEC-titere i blærevæv indsamlet 3 d efter to sekventielle urinvejseksponeringer givet 1 wk fra hinanden. Hvert symbol repræsenterer en anden mus, og nuller afbildes ved detektionsgrænsen (stiplet linje). I A, B og D er kasser i første og tredje kvartil med medianen markeret og whiskers fra min til max <. ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figur 4. SEM-analyse af blærer fikseret in situ. Blærer blev indsamlet fra mus 3 timer efter to eksponeringer (12 timer fra hinanden) for PBS (A) eller G. vaginalis (C). Stiplede linjer illustrerer en enkelt urinepitelcelle, som er mindre i G. vaginalis-eksponerede blærer, fordi de store overfladiske celler har eksfolieret væk og afsløret det underliggende overgangsepiteletel. (B) Blære opsamlet 6 timer efter indledende podning med UPEC i fase 1 af modellen, der viser urotel eksfoliering og ekstracellulær UPEC. (D) Eksempel på uopløselige fedtdråber, der findes på blæreoverfladen. Skalabjælker er 20 μm i hovedbillederne og 2 μm i indsatsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

En musemodel af uropatogen E. coli (UPEC) transuretral podning for at etablere latente intracellulære blærereservoirer og efterfølgende blæreeksponering for G. vaginalis for at inducere tilbagevendende UPEC UTI er demonstreret. Også demonstreret er optælling af bakterier, urincytologi og in situ blærefiksering og behandling til scanning elektronmikroskopi.

Tilbagevendende Escherichia coli urinvejsinfektion udløst af Gardnerella vaginalis Blæreeksponering hos mus

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Tilbagevendende Herpetisk stromal keratitis i Mus, en model for at studere menneskets HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Et-trins Negativ kromatografisk oprensning af<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende protein overudtrykt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinvejsinfektion i en lille dyremodel: transuretral kateterisation af mandlige og kvindelige mus

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning af Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisering i Murine vært ved Non-invasiv In Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En letkøbt protokol til at generere Site-Specifically acetyleret proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering af enkelt intracellulære bakterielle samfund genereret fra en Murine Model af urinvejsinfektion for Downstream encellede analyse

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...