Name: recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

המחברים מודים ללין פוסטר על הסיוע הטכני בניסויי זיהום, לג'יימס פיצפטריק במרכז להדמיית תאים באוניברסיטת וושינגטון (WUCCI) על הגישה ל-SEM, לסקוט הולטגרן על זן UTI89kanR UPEC, ולדיוויד הונסטאד על קריאה ביקורתית של כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מלגת מחקר לתארים מתקדמים ל- VPO#DGE - 1143954), על ידי המרכז לחקר מחלות זיהומיות של נשים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון (פרס מחקר פיילוט ל- NMG), על ידי איגוד הלב האמריקאי: #12POST12050583 (NMG) ו- #14POST20020011 (NMG), ועל ידי המכונים הלאומיים לבריאות, NIAID: R01 AI114635 (ALL) ו- NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, פרויקט II PI:ALL) ו-K01 DK110225-01A1 (NMG). חלק מהמחקרים בבעלי חיים בוצעו במתקן הנתמך על ידי מענק NCRR C06 RR015502. המרכז להדמיה תאית של אוניברסיטת וושינגטון (WUCCI; שם בוצע SEM) ו-MSJ נתמכו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, מכון תגלית הילדים של אוניברסיטת וושינגטון ובית החולים לילדים סנט לואיס (CDI-CORE-2015-505), הקרן לבית החולים היהודי בארנס (3770) והמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NS086741). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים הקשורים למחקר זה.

הצעד הקריטי הראשון במודל זה לזיהוי עכברים שלא ניקו את חיידקי UPEC במהלך שלב ה-UTI הראשוני. עכברים אלה חייבים להיות מוסרים מהניסוי מכיוון שאחרת הם היו מבלבלים את שיעורי הבקטריוריה של UPEC לאחר חשיפת G. vaginalis. לאחר החיסון הראשוני של UPEC, יש לאסוף את השתן מדי שבוע כדי לעקוב אחר פינוי החיידקים. כ-65-80% מעכברי C57BL/6 ינקו זיהום ב-UTI89kanR תוך 4 שבועות. לזני עכברים גזעיים אחרים יש נטיות שונות לפינוי UPEC42,43 ולהיווצרות מאגרים ולכן ייתכן שאינם מתאימים למודל זה. הנקודה הקריטית השנייה היא שמחקרים אמפיריים קבעו כי שני חיסונים רציפים של G. vaginalis (בהפרש של 12 שעות או 1 שבועות זה מזה) נחוצים כדי לגרום להופעת מאגר משמעותית מעל הופעת הרקע הספונטנית המתרחשת בעכברי בקרה החשופים רק ל- PBS. פרקי זמן אחרים בין שתי החשיפות הרצופות לא נבדקו, אך הם עשויים להניב תוצאות דומות. חשוב לציין כי הפחתה בשלפוחית השתן של UPEC נצפתה רק במודל שבו ניתנו חשיפות ל-G. vaginalis בהפרש של 1שבועות זה מזה 39. בעוד שניתן לתת יותר משתי חשיפות, עדויות אמפיריות מצביעות על כך שצנתור חוזר ונשנה לבדו מגביר את הופעתה, מה שעלול לבלבל את פרשנות התוצאות או לדרוש ממספר גדול יותר של בעלי חיים להבחין בהבדלים בין קבוצות חשיפה ובקרה. לבסוף, לשיטת קיבוע שלפוחית השתן in situ יש מספר שלבים קריטיים. נדרשת מיומנות מסוימת כדי להבטיח שהקיבוע יישאר בתוך שלפוחית השתן המהודקת. שלפוחית שתן מנופחת תהיה קשה יותר לדמיון על ידי SEM. זה גם חיוני להיות עדין מאוד בעת חיסון מקבע לתוך שלפוחית השתן, כמו גירוד urothelium עם קטטר המכיל מקבע יכול לגרום פילינג urothelial ללא תלות במה שמופעל על ידי G. vaginalis. כל הריכוזים המוזכרים בקוקטייל המקבע הם ריכוזים סופיים. יחסים לא נאותים של אלה עלולים לגרום לתיקון ונפיחות או התכווצות לא מספיקים של התאים. יש לחמם את המקבעים לטמפרטורות פיזיולוגיות כדי למנוע הלם טמפרטורה בתאים וברקמות. ההתחממות מספקת גם שיפור קל בקצב הדיפוזיה של מקבעים באמצעות ממברנות פלזמה. בעוד שלעתים קרובות ניתן להשמיט את צביעת אוסמיום עבור דגימות שהוכנו לניתוח SEM, זהו שלב חיוני בפרוטוקול זה כדי לייצב את השומנים ולמנוע פיצוח של קרומי התאים במהלך ייבוש נקודה קריטית.
ניתן לשנות פרוטוקול זה כדי לבדוק זנים אחרים של UPEC ו/או G. vaginalis על יכולתם ליצור מאגרים ולהפעיל את הופעתם, בהתאמה. ניתן להוסיף גם גורמים ניסיוניים אחרים, כגון חשיפה לחיידקים נרתיקיים אחרים (למשל, לקטובצילוס קריספאטוס PVAS100) או G. vaginalis מומת בחום, שאף אחד מהם לא מדגים פתולוגיה במודל זה39. כאשר בוחרים זני חיידקים אחרים לבדיקה, חשוב להדגים צמיחה עקבית כך שניתן יהיה להשתמש בריכוז אינוקולום סטנדרטי בכל הניסויים. הצמיחה של JCP8151BSmR עברה אופטימיזציה בתא אנאירובי. סביר להניח שניתן יהיה לטפח את הזן הזה במערכת GasPak אנאירובית, אך הדבר ידרוש אופטימיזציה כדי להבטיח צמיחה חזקה של חיידקים. לבסוף, ייתכן שניתן יהיה לשנות את העיתוי של שלבים מסוימים במודל. לדוגמה, ניתן לאסוף שתן בנקודות זמן מוקדמות יותר במהלך שלב היווצרות מאגר UPEC כדי לעקוב אחר תגובות CFU או מארח. השפעה שלילית של איסוף דגימות שתן בנקודות זמן מוקדמות (3, 6, 12 hpi) על התקדמות הזיהום או הקמת מאגרים לא נצפתה במודל זה. דווח כי הופעתם של מאגרי UPEC מתרחשת לאחר שתי מנות JCP8151BSmR שניתנו 12 שעות או 1 שבועות, אך מרווחי זמן אחרים טרם נבדקו. כמו כן, ייתכן שניתן יהיה לקצר את משך הזמן הכולל של המודל על ידי הפחתת שלב היווצרות מאגר UPEC לשבועיים (במקום 4 שבועות), מכיוון שרבים מהעכברים מפנים בקטריוריה בשלב זה. מחקרים קודמים שבחנו את הופעת UPEC בעקבות חשיפה לשלפוחית השתן לפילינגים כימיים השתמשו בהיווצרות מאגר UPEC של 1 או 2 שבועות שלב17,18. עם זאת, הפחתת משך הזמן לפינוי בקטריוריה של UPEC עלולה לבוא במחיר של דרישה לסילוק בעלי חיים נוספים מהניסוי. לבסוף, ניתוח SEM של שלפוחית השתן יכול להתבצע בנקודות זמן נוספות כדי לבחון את משך ההשפעה של G. vaginalis על האורותליום.
לגבי פתרון בעיות, ישנם כמה שיקולים חשובים במיוחד לגבי ניתוח SEM שלפוחית השתן. בהתאם לרקע העכבר שבו נעשה שימוש וכמות הדלקת הקיימת, חלק משלפוחית השתן תציג קירות דקים מאוד. שלפוחית השתן הזו נוטה להתכרבל יותר במהלך ייבוש נקודתי קריטי, ועלולה לגרום לצורה דמוית קליפת פרה. אם זה קורה, השיטה הטובה ביותר היא לחתוך את שלפוחית השתן בצורת פגז לשניים לאורך הממשק המכורבל ולאחר מכן בפעם השנייה כדי להסיר את עיקר הרקמה התלויה. חיתוך עובד בצורה הטובה ביותר עם סכין גילוח דו-קצוות מצופה PTFE. עודף שומן יכול לפעמים להתייבש במהלך שלבי צביעת האוסמיום. זה יכול לגרום לטיפות שומן לא מסיסות לא מסיסות שעלולות שלא להישטף במהלך שלבי השטיפה וההתייבשות ויכולות להתיישב על פני השטח של שלפוחית השתן במהלך הייבוש הבא. טיפות אלה יכולות להופיע ככדורים קטנים או כמבנים דמויי דיסק הפזורים על פני הדגימה (איור 4D). ניתן למתן זאת על ידי הבטחה שכמה שיותר רקמת שומן תוסר מסביב לשלפוחית השתן. ניתן להחליף פלטינה בציפוי אירידיום, אך יש לשמור על עוביים למינימום כדי להפחית את מיסוך הפרטים המבניים העדינים. מומלץ מאוד להשתמש בשלב מסתובב במהלך הציפוי.
מגבלה אחת של מודל זה היא שהוא דורש מספר רב של עכברים. רק 65-80% מעכברי C57BL/6 יפנו את חיידקי ה-UPEC שלהם ויתאימו לחיסון G. vaginalis או PBS הבאים (ראו איור 2C). כדי להשיג 10-12 עכברים לכל קבוצה (G. vaginalis inoculation לעומת PBS), כ-30 עכברים צריכים להיות נגועים בתחילה ב-UPEC. יתר על כן, סביר להניח שנדרשים ניסויים מרובים כדי להשיג את השכפולים הביולוגיים הדרושים כדי לזהות מובהקות סטטיסטית. כאשר החשיפות ניתנו בהפרש של 1 שבועות זו מזו, הופעת UPEC התרחשה ב-14% מהעכברים שנחשפו ל-PBS (איור 3B). לפיכך, זיהוי עלייה משמעותית ב-UPEC rUTI בעכברים שנחשפו ל-G. vaginalis ביחס לבקרות PBS (המופעלות ב-0.8; alpha=0.05 [חד-צדדיות]) דורשות בדיקה מצטברת של לפחות 40 עכברים עבור כל קבוצת חשיפה. שיקול נוסף הוא שניסויים אלה יקרים ועתירי עבודה. עכברים חייבים להיות במעקב שבועי לצורך אישור UPEC ומסלול הזמן הניסיוני הוא 4-5 שבועות, תלוי אם G. vaginalis ניתן פעמיים במסגרת זמן של 12 שעות או פעמיים בהפרש של 1 שבועות זה מזה. SEM הוא עתיר עבודה ועשוי להיות יקר, בהתאם לזמינות המיקרוסקופים ולחובי השירות. הכנת שלפוחית השתן כולה ל- SEM מספקת חומר רב לניתוח אך החיסרון הוא שניתוח כל שלפוחית שתן יכול לגזול זמן רב. לפיכך, סביר להניח כי רק מספר מוגבל של שלפוחית שתן ניתן לנתח על ידי SEM בהשוואה למספרים גבוהים יותר של בעלי חיים המשמשים שתן ורקמות titers. בנוסף, קבלת תמונות באיכות גבוהה של המשטחים המעוקלים של "כוסות" שלפוחית השתן דורשת מיומנות בשל צללים שיכולים לעכב את הראות. למרות SEM שלפוחית השתן הוא כלי שימושי להדמיה של פילינג אורותליאלי, שיטה זו היא איכותית במידה רבה. מכיוון שהדגימה קבועה בצורה עגולה, ובשל השימוש בגלוטרלדהיד בקיבוע, לא ניתן לבצע הקרנה של חיידקים המבטאים פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיית אור. חיסון וצבעים כימיים אינם עולים בקנה אחד עם תהליך זה בשל השימוש בגלוטראלדהיד שיחצה את רוב האנטיגנים והאוסמיום ואשר יסתיר את אתרי האנטיגן ויכהה את הרקמה. עם זאת, טכניקת SEM שימושית עבור פרמטרים שניתן להעריך באופן כמותי ללא שימוש בבדיקות נוספות, כגון גודל התא48,49.
מודל זה מציע מספר יתרונות מעבר לשיטות שתוארו קודם לכן. זה מאפשר בדיקה של מנגנונים של UPEC rUTI הנגרמים על ידי הופעה ממאגרי שלפוחית השתן, בניגוד להחדרה מחדש לשלפוחית השתן ממקור חיצוני. מודלים אחרים של rUTI עקב הופעתם ממאגרי שלפוחית השתן משתמשים בחומרים כימיים (פרוטמין סולפט או צ'יטוזן) כדי לגרום לפילינג אורותליאלי17,18, אשר לא יהיה טריגרים של rUTI אצל נשים. G. vaginalis הוא חיידק אורוגניטלי נפוץ שהתגלה בשתן שנאסף ישירות משלפוחית השתן באמצעות צנתור או שאיפה סופרפובית אצל חלק מהנשים23,26. עובדה זו, יחד עם הקשר הידוע בין BV (שבו G. vaginalis גדל יתר על המידה בנרתיק) לבין UTI, מצביעה על כך ש- G. vaginalis הוא טריגר סביר מבחינה קלינית של rUTI. לבסוף, שיטת קיבוע שלפוחית השתן באתרה משמרת את מבנה העל של שלפוחית השתן ומגבילה את הנזק, ומבטיחה ששכבות שלפוחית השתן אינן נפרדות זו מזו. שיטות קודמות להדמיה של האורותליום גורמות באופן מסורתי למשתמש לקצור, לחתוך, למתוח ולהצמיד את שלפוחית השתן למגש דיסקציה לפני שהוא מטביע את שלפוחית השתן המתוחה באופן אספטי48. שיטה זו מביאה לדגימה שטוחה מאוד אך אינה מבטיחה מתיחה אחידה או טבעית של הרקמה ועלולה לגרום לאזורים שנמתחים מעל ומתחת (וכתוצאה מכך רקמה מקומטת מאוד) ועלולה לגרום להפרדת שכבת שלפוחית השתן. בנוסף, מניפולציות פיזיות אלה של שלפוחית השתן כדי למתוח ולהצמיד את הרקמה עלולות לגרום לנזק, כולל פילינג אורותליאלי. שיטה נוספת היא להטביע שלפוחיות שלמות בקיבוע לפני ההטבעה בפרפין ולרכוש חלקים דקים עם מיקרוטום. מקטעים דקים לא יסולאו בפז לניסויים אימונוהיסטוכימיה לבחינת חיידקים ולוקליזציה של חלבון מארח, אך חתך דק אינו מאפשר הדמיה של משטח האורותל. שיטת SEM זו מאפשרת לבחון את פני השטח של שלפוחית השתן כולה בבת אחת.
כפי שתואר, יישומים עתידיים של מודל זה כוללים בדיקת זנים אחרים של UPEC כדי לקבוע אם הם יוצרים מאגרים תוך תאיים ובדיקת זנים אחרים של G. vaginalis כדי להעריך אם הם מעוררים פילינג והופעת UPEC לגרום ל-rUTI. זני עכברים אחרים מעבר לעכברי C57BL/6 עשויים גם הם להיבדק, אם כי עכברים עם נטייה גבוהה לפתח דלקת שלפוחית השתן כרונית (כגון עכברים על רקע C3H) אינם מומלצים, מכיוון שיהיה צורך להוציא יותר מדי עכברים מהניסוי. יתרון נוסף של עכברי C57BL/6 הוא שזני נוקאאוט גנטיים רבים זמינים באופן מסחרי. זנים כאלה מספקים הזדמנות לחקור את הגורמים המארחים המעורבים ביצירת מאגרים ו/או הופעתם.

זיהומים בדרכי השתן (UTI) מטילים נטל בריאותי משמעותי ברחבי העולם, ומשפיעים על איכות חייהם של מיליוני אנשים מדי שנה, במיוחד נשיםבנות 1. Escherichia coli אורופתוגני (UPEC) הם הגורם השכיח ביותר ל- UTI1. חולים רבים (כ-20-30%) המפתחים UTI יחוו UTI חוזר (rUTI) תוך 6 חודשים למרות אישור בתיווךאנטיביוטי של הזיהום הראשוני 2. למרבה הצער, עד 5% מהנשים לפני גיל המעבר סובלות מ-3 rUTI או יותר בכל שנה 3,4. אפיזודות עוקבות של rUTI יכולות להיגרם על ידי התמדה של אותו זן UPEC ממקרה המדד 5,6,7,8. נתונים מדגימות אנושיות וממודלים של עכברים מצביעים על כך ש-rUTI באותו זן יכול להיגרם על-ידי UPEC השוכנת בתוך מאגרים שקטים בשלפוחית השתן. בבני אדם, UPEC זוהו בתאי אפיתל ובביופסיות של שלפוחית השתן של חולים עם UTI 9,10,11,12,13. מחקרים בעכברי C57BL/6 הראו כי זנים מסוימים של UPEC יכולים להקים מאגרים תוך-תאיים תוך-תאיים בשלפוחית השתן, כפי שזוהו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ועל ידי הומוגניזציה ותרבית של רקמת שלפוחית השתן, שנשמרים במשך חודשים לאחר רזולוציה של בקטריוריה 14,15,16. טיפול בשלפוחית השתן עם חומרים הגורמים לפילינג של אפיתל שלפוחית השתן (urothelium), למשל פרוטאמין סולפט17 או chitosan18, לגרום להופעת UPEC ממאגרים לגרום rUTI. נתונים אלה מצביעים על כך שבנשים המחזיקות במאגרי UPEC של שלפוחית השתן כתוצאה מזיהום קודם, חשיפות לשלפוחית השתן שמובילות לפילינג אורותליאלי עלולות לגרום ל-rUTI.
ישנן עדויות הולכות וגוברות לכך שהמיקרוביוטה הנרתיקית תורמת לזיהום בדרכי השתן19,20. Gardnerella vaginalis הוא חבר שכיח הן במיקרוביוטה הנרתיקית והן במיקרוביוטה של השתן 21,22,23,24,25,26,27,28,29. בנרתיק, נוכחות של רמות גבוהות של G. vaginalis קשורה עם דיסביוזה מיקרוביאלית המכונה נרתיק חיידקי (BV), אשר משפיע על ~ 30% מהנשים 30,31,32. נשים עם BV נמצאות בסיכון גבוה יותר לחוות UTI בהשוואה לנשים עם קהילה נרתיקית הנשלטת על ידי לקטובצילוס 33,34,35,36,37. במודלים של עכברים, G. vaginalis גורם לפילינג אפיתל הן בנרתיק38 והן בשלפוחית השתן39. בעכברים C57BL/6 המחזיקים במאגרי שלפוחית השתן של UPEC, שתי חשיפות רצופות של שלפוחית השתן ל-G. vaginalis - אך לא ל-PBS - גורמות לעלייה מחודשת של UPEC ממאגרים כדי לגרום ל-UPEC rUTI. הופעתה מעידה על הופעתם של טיטרים של UPEC בשתן מעכברים שפתרו בעבר את חיידקי UPEC וירידה לאחר מכן בטיטרים הומוגנטיים של שלפוחית השתן של UPEC בהקרבה בהשוואה לחיות בקרה שנחשפו ל-PBS39. באופן מעניין, אין התיישבות מתמשכת על ידי G. vaginalis בשלפוחית השתן. ברוב המכריע של המקרים, שתי חשיפות קצרות, שלכל אחת מהן פחות מ-12 (h) של G. vaginalis בר קיימא בשתן, מספיקות כדי לעורר פילינג אורותליאלי ולקדם rUTI.
פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי של rUTI הנגרם על ידי UPEC השוכן במאגרי שלפוחית השתן התוך תאיים, תוך שימוש בחיסון שלפוחית השתן G. vaginalis כדי לגרום להישנות המחלה. ההתקדמות שהושגה על ידי מודל זה היא כי G. vaginalis הוא טריגר ביולוגי רלוונטי מבחינה קלינית של rUTI בהשוואה לחומרים כימיים בשימוש בעבר. יתר על כן, ההישרדות קצרת הימים יחסית של G. vaginalis בדרכי השתן של העכבר מאפשרת לבחון את ההשפעה של חשיפות מיקרוביאליות חולפות על האורותליום, כפי שעלול להתרחש לאחר פעילות מינית. בנוסף להתוויית מודל rUTI, פרוטוקול זה מתאר גם שיטות לציטולוגיה של השתן ולקיבוע והדמיה של שלפוחית השתן באתרה של האורותליום על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM).
פרוטוקול זה של UPEC UTI חוזר המושרה על ידי G. vaginalis משתמש בזן UPEC UTI89 הנושא קלטת עמידות לקנאמיצין (UTI89kanR)40. לא כל הזנים של UPEC שנבדקו הצליחו ליצור קהילות חיידקים תוך תאיות במהלך שלב ההדבקה החריפה בעכברים41 ועדיין לא ידוע אם לכל הזנים של UPEC יש את היכולת ליצור מאגרים תוך תאיים סמויים. יש לאשר את היווצרות המאגר לפני השימוש בזנים אחרים של UPEC במודל. פרוטוקול זה משתמש בבידוד G. vaginalis עמיד לסטרפטומיצין ספונטני, JCP8151BSmR38. אינדוקציה של rUTI על ידי JCP8151BSmR דורשת שני חיסונים רציפים של G. vaginalis , בהינתן 12 שעות או 7 ימים (d) בהפרששל 39. האם זנים אחרים של G. vaginalis גורמים לפילינג ו/או ל-UPEC rUTI עדיין יש לקבוע באמצעות מודל זה. חיוני להשתמש בזני UPEC ו-G. vaginalis עם עמידות ידועה לאנטיביוטיקה (כגון קנאמיצין או ספקטינומיצין עבור UPEC וסטרפטומיצין עבור G. vaginalis) מכיוון שניתן להוסיף אנטיביוטיקה לצלחות אגר כדי למנוע צמיחה של מיקרוביוטה של עכברים אנדוגניים שעלולים להפריע אחרת לספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU) לניטור זיהום. זה חשוב במיוחד עבור גידול דגימות שתן, כי שתן של עכברים מכיל לעתים קרובות חיידקים אחרים שיכולים לגדול יתר על המידה על צלחות תרבית ללא אנטיביוטיקה. מקורם של חיידקים אנדוגניים אלה בשתן של עכברים אינו ידוע, אך ככל הנראה משקף חיידקים פריאוריתרליים ואורוגניטליים שנלקחו במהלך איסוף השתן.
G. vaginalis הוא חיידק אנאירובי פקולטטיבי, ולכן פרוטוקול זה מתאר גידול G. vaginalis JCP8151BSmR בתא אנאירובי. אם תא אנאירובי אינו זמין, ניתן להשתמש בשיטות אחרות לשמירה על תנאי גדילה אנאירוביים (כגון שקית GasPak במיכל אטום). לחלופין, זנים מסוימים של G. vaginalis (כולל JCP8151BSmR) יגדלו בחממת תרביות רקמה סטנדרטית (5% CO2). בדיוק כפי ששימוש בזני G. vaginalis שאינם JCP8151BSmR דורש בדיקה כדי לוודא שהחיידקים מתנהגים באופן דומה במודל זה, שינוי תנאי הגדילה דורש קביעה אמפירית של משכי זמן אידיאליים לתרבית (על צלחות ובנוזל) וצפיפות אופטית (OD)600 שווה ערך להשגת ריכוזי אינוקולום בני קיימא רצויים. יתר על כן, לא ידוע אם תנאי גדילה משפיעים על הפתוביולוגיה של G. vaginalis.
לבסוף, כאשר שוקלים אם להשתמש במודל זה, החוקרים צריכים להיות מודעים לכך שהוא יכול לדרוש מספר גדול יותר של בעלי חיים לכל קבוצה מאשר מודלים טיפוסיים של עכברי UTI. זאת, בין היתר, משום שאינדוקציה של rUTI דורשת מהעכברים לפתור את הבקטריוריה של UPEC הנגרמת על ידי הזיהום הראשוני של שלפוחית השתן. לפיכך, כל עכבר שאינו מצליח לנקות בקטריוריה (פנוטיפ המעיד בדרך כלל על זיהום כליות מתמשך) אינו נכלל בשלב rUTI של הפרוטוקול. מספר העכברים הדרושים להפעלת מחקרים אלה מושפע גם משיעור הופעת UPEC "ספונטנית" בשתן (12-14% בממוצע). לבסוף, לזני עכברים שונים יש נטיות שונות לפתח בקטריוריה כרונית לעומת היווצרות מאגרים תוך-תאיים42,43. אם משתמשים בזני עכברים שאינם C57BL/6 במודל זה, יש לוודא כי בעלי החיים מפתחים מאגרים תוך תאיים של UPEC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

דלקות חוזרות ונשנות בדרכי השתן (rUTI) הנגרמות על ידי Escherichia coli (UPEC) אורופתוגנית הן שכיחות ויקרות. מאמרים קודמים המתארים מודלים של UTI בעכברים זכרים ונקבות המחישו את ההליכים לחיסון חיידקים ולספירתם בשתן וברקמות. במהלך זיהום ראשוני בשלפוחית השתן בעכברי C57BL/6, UPEC מקימה מאגרים סמויים בתוך תאי אפיתל של שלפוחית השתן שנמשכים לאחר פינוי של חיידקי UPEC. מודל זה מתבסס על מחקרים אלה כדי לבחון rUTI הנגרם על ידי הופעתה של UPEC מתוך מאגרי שלפוחית שתן סמויים. החיידק האורוגניטלי Gardnerella vaginalis משמש כטריגר של rUTI במודל זה מכיוון שהוא נמצא לעתים קרובות בדרכי האורגניטל של נשים, במיוחד בהקשר של דיסביוזיס נרתיקי שנקשר עם UTI. בנוסף, מתוארת גם שיטה לקיבוע שלפוחית השתן באתרה ולאחריה ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) של רקמת שלפוחית השתן, עם יישום פוטנציאלי למחקרים אחרים המערבים את שלפוחית השתן.

לאחר החיסון, ניתן לזהות טיטרים של UPEC בשתן (איור 2B). כישלון לצלוח דגימות שתן במדיה סלקטיבית המכילה קנאמיצין יגרום ככל הנראה לצמיחת יתר של מיקרוביוטה של עכברים אנדוגניים המזהמת את השתן. רמת הבקטריוריה של UPEC תהיה ככל הנראה גבוהה ביום הראשון ועשויה לעלות במהלך השבוע הראשון לפני שתרד בנקודות זמן מאוחרות יותר (איור 2C). לכ-65-80% מהעכברים לא יהיה UPEC הניתן לזיהוי בשתן ב-28 dpi (איור 2C, עיגול ירוק). ניתן להשתמש בעכברים אלה בשלבים הבאים של המודל. עכברים שנותרו בקטריוריים (איור 2C, אליפסה אדומה) צריכים להיות מסולקים מהניסוי.
שתי חשיפות עוקבות של G. vaginalis בהינתן 12 שעות (איור 3A) או 1 שבועות זה מזה (איור 3B) גורמות להופעת UPEC ממאגרים תוך תאיים ולגרום לבקטריוריה חוזרת. הן רמת הבקטריוריה של UPEC (בדיקת מאן-וויטני) והן חלק העכברים המציגים UPEC rUTI (הבדיקה המדויקת של פישר) גבוהים משמעותית בעכברים שנחשפו ל-G. vaginalis בהשוואה לקבוצת הביקורת של PBS. ניתוח ציטולוגיה של שתן מזהה PMNs בשתן מעכברים שנחשפו ל-G. vaginalis שהפגינו הופעת UPEC (איור 3C). במודל עם שתי חשיפות שניתנו בהפרש של 1 שבועות זו מזו, טיטרים של UPEC ברקמת שלפוחית השתן נמוכים יותר בעכברים שנחשפו ל-G. vaginalis בהשוואה ל-PBS (איור 3D), ככל הנראה בשל הופעת UPEC ממאגרים ופינוי לאחר מכן.
הדמיה של רקמת שלפוחית השתן הקבועה באתרה על ידי SEM חושפת תאי מטריה שטחיים גדולים של השתן המצפים את פני השטח של שלפוחית השתן בעכברי בקרה שנחשפו רק ל-PBS (איור 4A). פילינג אורותליאלי מעיד על אובדן של תאי מטריה שטחיים, החושפים תאי אפיתל מעבר קטנים יותר בעכברים שנחשפו ל-G. vaginalis (איור 4B). בשלב מוקדם לאחר חיסון UPEC במהלך הקמת מאגרים תוך-תאיים, UPEC נראה על האורותליום וננעץ מתוך תאים מקלפים (איור 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> איור 2. ניטור טיטרים של UPEC בשתן במהלך שלב 1 (היווצרות מאגר). (A) שרטוט של יחידות יוצרות מושבה (CFU) ציפוי. (B) תמונה מייצגת של טיטרים של UPEC בשתן על LB+kanamycin. עיגולים שחורים מצביעים על כתמי דגימת שתן שיש לספור כדי לחשב CFU/mL. (C) קורס זמן של חיידקי UPEC בעכברי C57BL/6. כל שורה מייצגת עכבר בודד, תוך התחקות אחר טיטר השתן של UPEC לאורך זמן. קו מקווקו מציין את גבול הזיהוי (1000 CFU/mL). אליפסה אדומה מצביעה על ארבעה עכברים (מתוך 20) שלא הצליחו לפתור את חיידקי UPEC ולכן לא ישמשו למודל ה-RUTI המושרה על ידי G. vaginalis. לעומת זאת, עיגול ירוק מציין עכברים שפתרו את בקטריוריה של UPEC והמשיכו לשלבים הבאים. (D) טבלת נתונים המשמשים ליצירת גרף בלוח C. CFU צהוב וניתן לזיהוי; ירוק, ללא CFU. (E) אקראיות של עכברים לקבוצות חשיפה בהתבסס על נקודת הזמן שבה UPEC CFU כבר לא זוהו בשתן ("היום נפתר"). מספרי העכבר בעמודה השמאלית של לוח D הם אותם מספרי עכבר שניתנו בחלונית E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> איור 3. G. vaginalis מפעילה UPEC rUTI. UPEC titers בשתן בעקבות שתי חשיפות רצופות של דרכי השתן ל-PBS (עיגולים) או ל-G. vaginalis (Gvag; ריבועים) בהפרש של 12 שעות (A) או 1 שבועות (B). כל סמל מייצג עכבר בודד. ה-CFU/mL UPEC הגבוה ביותר שזוהה מכל עכבר בין 1-3 ד' לאחר החשיפה השנייה מתוארים. עכברים ללא בקטריוריה הניתנת לזיהוי מתווים בגבול הגילוי (קו מקווקו). (C) ניתוח ציטולוגי של שתן המציג תאים UPEC (ראשי חץ) ותאי פולימורפונוקליאר (PMN) (חצים). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D) טיטרים של UPEC ברקמות שלפוחית השתן נאספו ב-3 ד' לאחר שתי חשיפות רצופות לדרכי השתן בהפרש של 1 שבועות זו מזו. כל סמל מייצג עכבר אחר ואפסים משורטטים בגבול הזיהוי (קו מקווקו). ב-A, B ו <- D, הקופסאות נמצאות ברבעון הראשון והשלישי עם החציון המסומן והשפם ממיני עד למקסימום. ** עמ' < 0.01; עמ' < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> תרשים 4. ניתוח SEM של שלפוחית השתן קבועה באתרה. שלפוחית השתן נאספה מעכברים 3 שעות לאחר שתי חשיפות (בהפרש של 12 שעות זו מזו) ל-PBS (A) או ל-G. vaginalis (C). קווים מנוקדים ממחישים תא אפיתל שתן יחיד, שהוא קטן יותר בשלפוחית השתן החשופה ל-G. vaginalis מכיוון שהתאים השטחיים הגדולים התרחקו וחשפו את אפיתל המעבר הבסיסי. (B) שלפוחית השתן נאספה 6 שעות לאחר החיסון הראשוני עם UPEC, במהלך שלב 1 של המודל, והראה פילינג אורותליאלי ו-UPEC חוץ-תאי. (D) דוגמה לטיפות שומן בלתי מסיסות הקיימות על פני השטח של שלפוחית השתן. סרגלי קנה מידה הם 20 מיקרומטר בתמונות הראשיות ו-2 מיקרומטר בכניסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

מודל עכברי של חיסון אורופתוגני E. coli (UPEC) טרנס-urethral כדי ליצור מאגרי שלפוחית שתן תוך-תאיים סמויים וחשיפה שלפוחית השתן לאחר מכן ל - G. vaginalis כדי לגרום ל- UPEC UTI חוזר ונשנה מודגם. כמו כן הודגמו ספירה של חיידקים, ציטולוגיה של שתן, וקיבוע ועיבוד שלפוחית השתן באתרם לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...