Name: recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

저자들은 감염 실험에 대한 기술 지원을 받은 린 포스터, SEM에 접근하기 위한 워싱턴 대학 셀루어 이미징 센터(WUCCI)의 제임스 피츠패트릭, UTI89kanR UPEC 균주에 대한 스콧 헐트그렌, 원고를 비판적으로 읽은 데이비드 훈스타드에게 감사를 표한다.
이 연구는 국립 과학 재단 (VPO # DGE 대학원 연구 펠로우십 - 1143954), 워싱턴 대학 의과 대학의 여성 전염병 연구 센터 (NMG에 파일럿 연구 상), 미국 심장 협회 : #12POST12050583 (NMG) 및 #14POST20020011 (NMG), 국립 보건원 (NIAID) : R01 AI114635 (ALL) 및 NIDDK의 지원을 받았습니다. R21 DK092586 (모두), P50 DK064540-11 (SJH, 프로젝트 II PI : ALL) 및 K01 DK110225-01A1 (NMG). 일부 동물 연구는 NCRR 그랜트 C06 RR015502에 의해 지원되는 시설에서 수행되었다. 워싱턴 대학 세포 영상 센터 (WUCCI; SEM이 수행 된 곳)와 MSJ는 워싱턴 대학 의과 대학, 워싱턴 대학의 어린이 발견 연구소 및 세인트 루이스 아동 병원 (CDI-CORE-2015-505), 반스 - 유대인 병원 재단 (3770) 및 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NS086741)의 지원을 받았다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다.

저자들은 이 연구와 관련하여 이해상충이 없다고 선언한다.

이 모델의 첫 번째 중요한 단계는 일차 UTI 단계 동안 UPEC 세균뇨를 제거하지 않은 마우스를 식별하기 위한 것입니다. 이 마우스는 G. 질 노출 후 UPEC 박테리아뇨의 비율을 혼란스럽게 할 것이므로 실험에서 제거해야합니다. 초기 UPEC 접종 후, 소변은 박테리아 클리어런스를 모니터링하기 위해 매주 수집해야합니다. C57BL/6 마우스의 약 65-80%가 4주 이내에 UTI89kanR 감염을 제거한다. 다른 사육된 마우스 균주는 UPEC 클리어런스42,43 및 저수지 형성에 대해 상이한 성향을 가지며, 따라서 이 모델에 적합하지 않을 수 있다. 두 번째 중요한 점은 경험적 연구가 G. vaginalis의 두 가지 순차적 접종 (12 h 또는 1 wk 간격)이 PBS에만 노출 된 대조군 마우스에서 발생하는 배경 자발적 출현보다 중요한 저수지 출현을 유발하는 데 필요하다는 것입니다. 두 순차적 노출 사이의 다른 기간은 테스트되지 않았지만 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. UPEC 방광 역가의 감소는 G. 질 노출이 1 주 간격으로39 주 떨어진 모델에서만 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 두 개 이상의 노출을 투여 할 수 있지만, 경험적 증거는 반복적 인 카테터 삽입만으로도 출현이 증가하여 결과의 해석을 혼란스럽게하거나 노출 그룹과 대조군 간의 차이를 구별하기 위해 더 많은 수의 동물을 요구할 수 있음을 시사합니다. 마지막으로, 현장 방광 고정 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 고정 장치가 고정 된 방광 내부에 남아 있는지 확인하기 위해서는 몇 가지 기술이 필요합니다. 수축 된 방광은 SEM으로 이미지화하기가 더 어려울 것입니다. 또한 고정제를 방광에 접종 할 때 매우 온화한 것이 필수적이며, 고정 함유 카테터로 요로 텔륨을 긁어 내면 G. vaginalis에 의해 유발되는 것과 독립적으로 비뇨 생식기 박리를 유도 할 수 있습니다. 고정 칵테일에 언급 된 모든 농도는 최종 농도입니다. 이들의 부적절한 비율은 세포의 불충분 한 고정 및 팽창 또는 수축을 초래할 수 있습니다. 정착제는 세포와 조직의 온도 충격을 피하기 위해 생리적 인 온도로 따뜻하게해야합니다. 온난화는 또한 원형질막을 통한 고정제의 확산 속도를 약간 향상시킵니다. SEM 분석을 위해 준비된 샘플에 대해 오스뮴 염색은 종종 생략 될 수 있지만, 임계점 건조 중에 지질을 안정화시키고 세포막의 균열을 방지하는이 프로토콜의 필수 단계입니다.
이 프로토콜은 다른 UPEC 및/또는 G. 질 균주가 저수지를 형성하고 출현을 촉발시키는 능력에 대해 각각 테스트하도록 수정될 수 있다. 다른 질 박테리아 (예를 들어, 락토바실러스 크리스파투스 PVAS100) 또는 열-사멸된 G. vaginalis에 대한 노출과 같은 다른 실험 인자가 또한 추가될 수 있으며, 이들 중 어느 것도 이 모델39에서 병리를 입증하지 못한다. 시험할 다른 박테리아 균주를 선택할 때, 표준 접종 농도가 모든 실험에서 사용될 수 있도록 일관된 성장을 입증하는 것이 중요하다. JCP8151BSmR의 성장은 혐기성 챔버에서 최적화되었습니다. 이 균주는 혐기성 GasPak 시스템에서 재배 될 수 있지만 강력한 박테리아 성장을 보장하기 위해서는 최적화가 필요합니다. 마지막으로, 모델에서 특정 단계의 타이밍을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 소변은 CFU 또는 숙주 반응을 모니터링하기 위해 UPEC 저수지 형성 단계 동안 초기 시점에서 수집 될 수 있습니다. 감염의 진행 또는 저수지의 확립에 대한 초기 시점 (3, 6, 12 hpi)에서 소변 샘플을 수집하는 부작용은이 모델에서 관찰되지 않았습니다. UPEC 저장소의 출현은 12 h 또는 1 wk를 주어진 두 개의 JCP8151BSmR 용량 후에 발생하는 것으로보고되었지만 다른 시간 간격은 아직 테스트되지 않았습니다. 또한, UPEC 저장소 형성 단계를 2주(4주가 아닌)로 감소시킴으로써 모델에 대한 전체 시간 길이를 감소시킬 수 있는데, 이는 많은 마우스가 이 시간에 의해 세균뇨를 맑게 하기 때문이다. 화학 각질 제거제에 대한 방광 노출 후 UPEC 출현을 조사한 이전 연구는 1 또는 2 wk UPEC 저수지 형성 단계17,18을 사용했습니다. 그러나 UPEC 박테리아 제거를위한 시간을 줄이면 실험에서 더 많은 동물을 도태 할 것을 요구할 수 있습니다. 마지막으로, 방광의 SEM 분석은 비뇨생식기에 대한 G. 질염의 효과의 지속기간을 관찰하기 위해 추가적인 시점에 수행될 수 있다.
문제 해결과 관련하여 방광 SEM 분석과 관련하여 특히 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 사용 된 마우스 배경과 존재하는 염증의 양에 따라 일부 방광은 매우 얇은 벽으로 나타납니다. 이 방광은 임계점 건조 중에 더 많이 말리는 경향이 있으며 카우리 껍질과 같은 모양을 만들 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 가장 좋은 방법은 컬링 된 계면을 따라 껍질 모양의 방광을 반으로 자른 다음 두 번째로 돌출 된 조직의 벌크를 제거하는 것입니다. 절단은 PTFE 코팅 양날의 면도날로 가장 잘 작동합니다. 과도한 지방은 때때로 오스뮴 염색 단계 동안 가용화 될 수 있습니다. 이로 인해 헹굼 및 탈수 단계 중에 씻겨 나가지 않고 후속 건조 중에 방광 표면에 침전 될 수있는 원치 않는 불용성 지방 방울이 발생할 수 있습니다. 이 물방울은 샘플 위에 흩어져있는 작은 구 또는 디스크와 같은 구조로 나타날 수 있습니다 (그림 4D). 이것은 가능한 한 많은 지방 조직이 방광 주위에서 제거되도록함으로써 완화 될 수 있습니다. 백금은 이리듐 코팅을 대체 할 수 있지만 미세한 구조적 세부 사항의 마스킹을 줄이기 위해 두께를 최소한으로 유지해야합니다. 코팅 중에 회전 스테이지를 사용하는 것이 좋습니다.
이 모델의 한 가지 한계는 많은 수의 마우스가 필요하다는 것입니다. C57BL/6 마우스의 65-80%만이 UPEC 세균뇨를 제거하고 후속 G. 질 또는 PBS 접종에 적합하다(도 2C 참조). 그룹당 10-12 마리의 마우스 (G. 질 접종 대 PBS)를 얻으려면 ~ 30 마리의 마우스가 초기에 UPEC에 감염되어야합니다. 또한, 통계적 유의성을 검출하는데 필요한 생물학적 반복실험을 달성하기 위해 다수의 실험이 요구될 가능성이 높다. 노출이 1 wk 간격으로 주어졌을 때, UPEC 출현은 PBS에 노출된 마우스의 14%에서 발생하였다(도 3B). 따라서, PBS 대조군에 비해 G. 질염 노출 마우스에서 UPEC rUTI의 유의한 증가를 검출(0.8; 알파=0.05[일방적]으로 구동)하는 것은 각 노출 그룹에 대해 적어도 40마리의 마우스의 누적 총합을 시험해야 한다. 또 다른 고려 사항은 이러한 실험이 비용이 많이 들고 노동 집약적이라는 것입니다. 마우스는 UPEC 클리어런스를 위해 매주 모니터링해야하며 실험 시간은 G. vaginalis가 12 시간 프레임에서 두 번 또는 1 주 간격으로 두 번 주어 졌는지 여부에 따라 4-5 주입니다. SEM은 노동 집약적이며 현미경 가용성 및 서비스 요금에 따라 비용이 많이 들 수 있습니다. SEM을 위해 전체 방광을 준비하는 것은 분석을위한 풍부한 물질을 제공하지만 단점은 각 방광을 분석하는 데 시간이 많이 걸릴 수 있다는 것입니다. 따라서, 소변 및 조직 역가에 사용되는 더 높은 동물 수와 비교하여 제한된 수의 방광만이 SEM에 의해 분석될 수 있을 가능성이 있다. 또한, 방광 "컵"의 곡면의 고품질 이미지를 얻으려면 가시성을 저해 할 수있는 그림자로 인한 기술이 필요합니다. 방광 SEM은 비뇨 생식기 각질 제거를 시각화하는 데 유용한 도구이지만,이 방법은 크게 질적입니다. 샘플이 둥근 모양으로 고정되어 있고 고정제에 글루타르알데히드를 사용하기 때문에 광 현미경을 통해 형광 발현 박테리아를 스크리닝하는 것은 불가능합니다. 면역 염색 및 화학 염료는 대부분의 항원과 오스뮴을 가교시키고 항원 부위를 가리고 조직을 어둡게하는 글루타르 알데히드의 사용으로 인해이 과정과 양립 할 수 없습니다. 즉, SEM 기술은 세포 크기48,49와 같은 추가적인 프로브를 사용하지 않고 정량적으로 평가할 수 있는 파라미터에 유용하다.
이 모델은 앞서 설명한 방법 이상의 몇 가지 이점을 제공합니다. 그것은 방광 저장소에서 출현으로 인한 UPEC rUTI의 메커니즘을 검사 할 수 있으며, 외부 소스에서 방광으로 재 도입되는 것과는 대조적입니다. 방광 저장소에서 출현으로 인한 rUTI의 다른 모델은 화학 약제 (프로타민 설페이트 또는 키토산)를 사용하여 비뇨 생식기 박리17,18을 유발하며, 이는 여성에서 rUTI의 트리거가 아닙니다. G. 질염은 일부 여성23,26에서 카테터 삽입 또는 초음부 흡인을 통해 방광에서 직접 수집 된 소변에서 검출 된 널리 퍼진 비뇨 생식기 박테리아입니다. 이 사실은 BV (G. 질이 질에서 자란다)와 UTI 사이의 알려진 연관성과 결합하여 G. vaginalis가 rUTI의 임상적으로 그럴듯한 방아쇠임을 시사한다. 마지막으로, 현장 방광 고정 방법은 방광 초구조를 보존하고 손상을 제한하여 방광 층이 서로 분리되지 않도록합니다. 우로텔륨을 시각화하기 위한 이전의 방법들은 전통적으로 사용자가 고정제(48)에서 뻗은 방광을 침수하기 전에 방광을 무균적으로 수확, 이분, 스트레치 및 해부 트레이 상에 핀핑한다. 이 방법은 매우 평평한 샘플을 초래하지만 조직의 고르거나 자연스러운 스트레칭을 보장하지 않으며 연신 (주름이 심한 조직을 초래)이있는 영역을 초래할 수 있으며 방광층 분리를 일으킬 수 있습니다. 또한, 조직을 스트레칭하고 고정시키는 방광의 이러한 물리적 조작은 비뇨 생식기 박리를 포함한 손상을 일으킬 수 있습니다. 또 다른 방법은 파라핀에 묻히고 마이크로톰으로 얇은 절편을 얻기 전에 고정제로 방광을 잠수시키는 것입니다. 얇은 절편은 박테리아와 숙주 단백질 국소화를 검사하는 면역 조직 화학 실험에 매우 중요하지만 얇은 섹션은 비뇨 생식기 표면의 시각화를 허용하지 않습니다. 이 SEM 방법을 사용하면 전체 방광의 표면을 한 번에 검사 할 수 있습니다.
설명된 바와 같이, 이 모델의 향후 적용에는 다른 UPEC 균주가 세포 내 저장소를 형성하는지 여부를 결정하기 위해 테스트하고 다른 G. 질 균주를 테스트하여 rUTI를 유발하는 각질 제거 및 UPEC 출현을 유도하는지 여부를 평가하는 것이 포함됩니다 . C57BL/6 마우스 이외의 다른 마우스 균주도 검사할 수 있지만, 만성 방광염이 발병하는 경향이 높은 마우스(예: C3H 배경의 마우스)는 실험에서 도태해야 하므로 권장되지 않습니다. C57BL/6 마우스의 추가적인 이점은 많은 유전적 녹아웃 균주가 상업적으로 입수가능하다는 것이다. 이러한 균주는 저수지 형성 및/또는 출현과 관련된 숙주 인자를 심문할 기회를 제공한다.

요로 감염 (UTI)은 전 세계적으로 상당한 의료 부담을 부과하여 매년 수백만 명의 사람들, 특히 여성1의 삶의 질에 영향을 미칩니다. 비뇨 병원성 대장균 (UPEC)은 UTI1의 가장 빈번한 원인입니다. UTI를 개발하는 많은 환자 (약 20-30 %)는 초기 감염2의 항생제 매개 허가에도 불구하고 6 개월 이내에 재발 성 UTI (rUTI)를 경험할 것입니다. 불행히도, 폐경 전 여성의 5 %가 매년 3,4 개 이상의 rUTI로 고통받습니다. rUTI의 순차 적 에피소드는 인덱스 케이스 5,6,7,8로부터의 동일한 UPEC 균주의 지속성에 의해 야기될 수 있다. 인간 샘플 및 마우스 모델의 데이터는 동일한 균주 rUTI가 방광의 정지 저수지 내에 거주하는 UPEC에 의해 발생할 수 있음을 시사합니다. 인간에서, UPEC는 UTI 9,10,11,12,13 환자의 상피 세포 및 방광 생검에서 검출되었다. C57BL / 6 마우스에 대한 연구에 따르면 UPEC의 일부 균주는 형광 현미경 검사와 방광 조직의 균질화 및 배양에 의해 검출 된 바와 같이 방광에 정동작 세포 내 저장소를 설치할 수 있음을 입증했으며, 이는 세균뇨14,15,16의 분해 후 몇 달 동안 유지됩니다. 방광 상피 (urothelium)의 각질 제거를 유도하는 약제로 방광을 치료, 예를 들어 프로타민 설페이트17 또는 키토산18, rUTI를 일으키는 저장소에서 UPEC의 출현을 트리거. 이러한 데이터는 이전 감염으로부터 방광 UPEC 저수지를 보유하고있는 여성에서 비뇨 생식기 박리로 이어지는 방광 노출이 rUTI를 유발할 수 있음을 시사합니다.
질 microbiota가 요로 감염에 기여한다는 증거가 증가하고 있습니다19,20. Gardnerella 질은 질 및 비뇨기 microbiota21,22,23,24,25,26,27,28,29의 빈번한 구성원입니다. 질에서 높은 수준의 G. 질염의 존재는 세균성 질염 (BV)으로 알려진 미생물 dysbiosis와 관련이 있으며, 이는 여성 30,31,32의 ~30 %에 영향을 미칩니다. BV를 가진 여성은 락토바실러스33,34,35,36,37에 의해 지배되는 질 공동체를 가진 여성에 비해 UTI를 경험할 위험이 더 높습니다. 마우스 모델에서, G. 질리스는 질(38) 및 방광(39) 둘 다에서 상피 각질 제거를 일으킨다. UPEC 방광 저장소를 보유하고있는 C57BL / 6 마우스에서 G. 질염에 대한 두 번의 순차적 방광 노출은 PBS가 아닌 저장소에서 UPEC가 다시 출현하여 UPEC rUTI를 유발합니다. 출현은 이전에 UPEC 세균뇨를 해결한 마우스로부터의 소변에서 UPEC 역가의 출현 및 PBS 노출 대조군 동물39에 비해 희생시 UPEC 방광 균질물 역가의 후속 감소에 의해 입증된다. 흥미롭게도, 방광에 G. 질염에 의한 지속적인 식민지화는 없습니다. 대다수의 경우, 소변에서 생존 가능한 G. 질염의 12 (h) 미만을 가진 두 번의 짧은 노출은 비뇨 생식기 박리를 유도하고 rUTI를 촉진하기에 충분합니다.
이 프로토콜은 재발을 촉발시키기 위해 G. 질 방광 접종을 사용하여 세포 내 방광 저장소에 상주하는 UPEC에 의해 야기된 rUTI의 마우스 모델을 기술한다. 이 모델에 의해 달성 된 진보는 G. 질염 이 이전에 사용 된 화학 약품과 비교하여 rUTI의 임상 적으로 관련된 생물학적 트리거라는 것입니다. 또한, 마우스 요로에서 G. 질 의 비교적 수명이 짧은 생존은 성행위 후에 발생할 수있는 것처럼 일시적인 미생물 노출이 비뇨 생식기에 미치는 영향을 검사 할 수있게합니다. rUTI 모델을 개괄하는 것 외에도, 이 프로토콜은 주사 전자 현미경(SEM)에 의한 소변 세포학 및 계내 방광 고정 및 요로텔륨의 이미징을 위한 방법을 기술한다.
G. 질리스-유도된 재발성 UPEC UTI의 이 프로토콜은 카나마이신 내성 카세트(UTI89kanR)40을 담은 UPEC 균주 UTI89를 사용한다. UPEC 시험의 모든 균주가 마우스41에서 급성 감염 단계 동안 세포 내 박테리아 군집을 형성 할 수있는 것은 아니며 UPEC의 모든 균주가 잠복 세포 내 저장소를 형성 할 수있는 능력을 갖는지는 아직 알려지지 않았습니다. 저수지 형성은 모델에서 다른 UPEC 균주를 사용하기 전에 확인되어야 한다. 이 프로토콜은 자발적인 스트렙토마이신 내성 G. 질 단리물, JCP8151BSmR38을 사용한다. JCP8151BSmR에 의한 rUTI의 유도는 12 h 또는 7 일 (d) 간격으로 주어진 두 개의 순차적 인 G. 질 접종을 필요로한다 (d)39. 다른 G. 질 균주가 각질 제거 및/또는 UPEC rUTI를 유도하는지 여부는 이 모델로 결정되어야 한다. 항생제 내성이 알려진 UPEC 및 G. 질 균주 (예 : UPEC의 경우 카나 마이신 또는 스펙티노마이신 및 G. vaginalis의 경우 스트렙토 마이신)를 사용하는 것이 필수적인데, 이는 항생제를 한천 플레이트에 첨가하여 감염을 모니터링하기 위해 콜로니 형성 단위 (CFU)를 열거하는 것을 방해 할 수있는 내인성 마우스 미생물의 성장을 방지 할 수 있기 때문입니다. 이것은 마우스 소변이 항생제없이 배양 접시에서 자랄 수있는 다른 박테리아를 자주 포함하기 때문에 소변 표본을 배양하는 데 특히 중요합니다. 마우스 소변에서 이러한 내인성 박테리아의 기원은 알려지지 않았지만 소변 수집 중에 포착 된 요도 및 비뇨 생식기 박테리아를 반영 할 가능성이 큽니다.
G. 질리스는 교수성 혐기성 박테리아이며, 따라서, 이 프로토콜은 혐기성 챔버에서 G. 질 JCP8151BSmR을 성장시키는 것을 기술한다. 혐기성 챔버를 사용할 수없는 경우 혐기성 성장 조건을 유지하기위한 다른 방법 (예 : 밀폐 용기의 GasPak 파우치)을 사용할 수 있습니다. 대안적으로, G. 질염의 일부 균주 (JCP8151BSmR 포함)는 표준 조직-배양 배양기 (5%CO2)에서 성장할 것이다. JCP8151BSmR 이외의 G. vaginalis 균주를 사용하는 것이 박테리아가이 모델에서 유사하게 행동하는지 확인하기 위해 테스트가 필요한 것처럼, 성장 조건을 변경하려면 원하는 생존 가능한 접종 농도를 달성하기 위해 배양을위한 이상적인 지속 기간 (플레이트 및 액체) 및 광학 밀도 (OD) 600 등가물의 경험적 결정이 필요합니다. 더욱이, 성장 조건이 G. vaginalis의 병리학에 영향을 미치는지 여부는 알려져 있지 않다.
마지막으로,이 모델을 활용할지 여부를 고려할 때, 연구자들은 일반적인 UTI 마우스 모델보다 그룹 당 더 많은 수의 동물을 요구할 수 있음을 알아야합니다. 이것은 부분적으로 rUTI의 유도가 마우스가 방광의 초기 감염으로 인한 UPEC 박테리아를 해결하도록 요구하기 때문입니다. 따라서, 세균뇨를 제거하지 못하는 임의의 마우스 (일반적으로 진행중인 신장 감염을 나타내는 표현형)는 프로토콜의 rUTI 단계에 포함되지 않는다. 이러한 연구에 필요한 생쥐의 수는 또한 소변으로 "자발적인"UPEC 출현률 (평균 12-14 %)에 의해 영향을받습니다. 마지막으로, 상이한 마우스 균주는 만성 세균뇨 대 세포내 저수지 형성(42,43)을 발달시키기 위한 상이한 성향을 갖는다. 이 모델에서 C57BL/6 이외의 마우스 균주를 사용하는 경우, 동물이 정지된 UPEC 세포 내 저장소를 개발한다는 것을 확인해야 한다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

비뇨기병원성 에스케리치아 콜리 (UPEC)에 의한 재발성 요로 감염(rUTI)은 흔하고 비용이 많이 듭니다. 수컷 및 암컷 마우스에서 UTI의 모델을 설명하는 이전 기사는 소변과 조직에서 박테리아 접종 및 열거를위한 절차를 설명했습니다. C57BL / 6 마우스에서 초기 방광 감염 동안, UPEC는 UPEC 세균뇨의 클리어런스 후 지속되는 방광 상피 세포 내부에 잠복 저장소를 설치합니다. 이 모델은 잠복 방광 저수지 내에서 UPEC의 출현으로 인한 rUTI를 조사하기 위해 이러한 연구를 기반으로합니다. 비뇨 생식기 박테리아 Gardnerella vaginalis 는 여성의 비뇨 생식기, 특히 UTI와 관련된 질 dysbiosis의 맥락에서 자주 존재하기 때문에이 모델에서 rUTI의 방아쇠로 사용됩니다. 또한, 방광 조직의 주사 전자 현미경 (SEM) 분석에 이어 계내 방광 고정을위한 방법도 설명되며, 방광과 관련된 다른 연구에 잠재적 인 적용이 가능합니다.

접종 후, UPEC 역가는 소변에서 검출가능하다(도 2B). 카나마이신을 함유하는 선택적 배지에 소변 샘플을 플레이트화하지 않으면 소변을 오염시키는 내인성 마우스 미생물의 과증식이 발생할 가능성이 큽니다. UPEC 세균뇨의 수준은 1일째에 높을 가능성이 높으며 이후 시간대에 감소하기 전에 첫 주 동안 증가할 수 있습니다(그림 2C). 마우스의 약 65-80%는 28dpi만큼 소변에서 검출 가능한 UPEC를 갖지 않을 것이다(그림 2C, 녹색 원). 이들 마우스는 모델의 후속 단계에서 사용될 수 있다. 박테리아로 남아있는 마우스(도 2C, 적색 타원)는 실험에서 제거되어야 한다.
12 h (그림 3A) 또는 1 wk 간격 (그림 3B)을 감안할 때 두 번의 순차적 인 G. 질 노출은 재발 성 세균뇨를 유발하기 위해 세포 내 저장소에서 UPEC가 출현하는 결과를 초래합니다. UPEC 세균뇨의 수준(만-휘트니 테스트)과 UPEC rUTI(피셔의 정확한 시험)를 표시하는 마우스의 분획 모두 PBS 대조군에 비해 G. 질염에 노출된 마우스에서 유의하게 더 높다. 소변 세포학 분석은 UPEC 출현을 나타냈던 G. 질리에 노출된 마우스로부터 소변에서 PMN을 검출한다(도 3C). 1 wk 간격으로 주어진 두 번의 노출을 갖는 모델에서, 방광 조직에서의 UPEC 역가는 PBS에 비해 G. 질리스-노출된 마우스에서 더 낮으며(도 3D), 아마도 저장소로부터의 UPEC의 출현 및 후속 클리어런스로 인한 것으로 추정된다.
SEM에 의한 계내 고정 방광 조직의 시각화는 PBS에만 노출된 대조군 마우스에서 방광 표면을 라이닝하는 큰 피상적 우산 비뇨생식기 세포를 드러낸다(도 4A). Urothelial 각질 제거는 표면 우산 세포의 손실에 의해 입증되며, G. 질 염에 노출 된 마우스에서 더 작은 기저 과도기 상피 세포를 드러냅니다 (그림 4B). 세포 내 저장소의 확립 동안 UPEC 접종 초기에 UPEC는 각질 제거 세포 밖으로 우로텔륨 및 필라멘트에서 볼 수 있습니다 (그림 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> 그림 2. 1 단계 (저수지 형성) 동안 소변에서 UPEC 역가를 모니터링합니다. (A) 콜로니 형성 단위 (CFU) 도금의 개략도. (B) LB+카나마이신에 대한 소변에서 UPEC 역가의 대표적인 이미지. 검은 원은 CFU / mL를 계산하기 위해 계산해야하는 소변 샘플 반점을 나타냅니다. (C) C57BL/6 마우스에서 UPEC 세균뇨증의 시간 경과. 각 라인은 개별 마우스를 나타내며, 시간에 따른 UPEC 소변 역가를 추적합니다. 점선은 검출 한계(1000 CFU/mL)를 나타냅니다. 적색 타원은 UPEC 세균뇨를 해결하지 못한 네 마리의 마우스 (20 마리 중)를 나타내며 따라서 G. vaginalis-induced rUTI 모델에는 사용되지 않을 것입니다. 반대로, 녹색 원은 UPEC 세균뇨를 해결하고 후속 단계로 진행한 마우스를 나타냅니다. (d) 패널 C. 노란색, 검출가능한 CFU에서 그래프를 생성하는데 사용된 데이터의 표; 녹색, CFU 없음. (e) UPEC CFU가 소변에서 더 이상 검출되지 않은 시점을 기준으로 마우스를 노출 그룹으로 무작위화("해결일"). 패널 D의 왼쪽 열에 있는 마우스 번호는 패널 E에 제공된 마우스 번호와 동일합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> 그림 3. G. 질염은 UPEC rUTI를 유발합니다. PBS (원) 또는 G. 질 (Gvag; 사각형)에 두 개의 순차적 요로 노출에 이어 소변에서 UPEC 역가는 12 h (A) 또는 1 주 (B) 간격으로 주어진다. 각 기호는 개별 마우스를 나타냅니다. 두 번째 노출 후 1-3d 사이의 각 마우스에서 검출된 가장 높은 CFU/mL UPEC가 플롯됩니다. 검출 가능한 세균뇨가 없는 마우스는 검출 한계(점선)로 플롯팅된다. (C) UPEC (화살촉) 및 다형성 핵 (PMN) 세포 (화살표)를 보여주는 소변 세포학 분석. 스케일 바 = 20 μm. (d) 방광 조직에서의 UPEC 역가는 1 wk 간격으로 주어진 두 개의 순차적 요로 노출 후 3 d를 수집하였다. 각 기호는 서로 다른 마우스를 나타내며 0은 감지 한계(점선)에 플롯됩니다. A, B 및 D에서 상자는 첫 번째 및 세 번째 사분위수에 있으며 중앙값은 최소값에서 최대로 표시됩니다. Mann-Whitney U 테스트 * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> 그림 4. 방광의 SEM 분석은 제자리에서 고정. 방광은 PBS (A) 또는 G. 질 (C)에 두 번 노출 (12 시간 간격) 후 3 h 후에 마우스로부터 수집되었다. 점선은 단일 요로 상피 세포를 보여 주며, 이는 큰 표면 세포가 각질 제거되어 근본적인 과도기 상피를 드러내기 때문에 G. 질 노출 방광에서 더 작 습니다. (b) 방광은 UPEC로 초기 접종 후 6 시간 후, 모델의 1 단계 동안 수집하여 비뇨 생식기 박리 및 세포외 UPEC를 보여줍니다. (d) 방광 표면에 존재하는 불용성 지방 액적의 예. 스케일 바는 메인 이미지에서 20μm, 인셋에서 2μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

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