Name: recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Forfatterne takker Lynne Foster for teknisk assistanse i infeksjonseksperimenter, James Fitzpatrick ved Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) for tilgang til SEM, Scott Hultgren for UTI89kanR UPEC-stammen og David Hunstad for kritisk lesing av manuskriptet.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Graduate Research Fellowship til VPO # DGE - 1143954), av Center for Women's Infectious Disease Research ved Washington University School of Medicine (Pilot Research Award til NMG), av American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) og #14POST20020011 (NMG), og av National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) og NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, prosjekt II PI:ALL) og K01 DK110225-01A1 (NMG). Noen av dyreforsøkene ble utført i et anlegg støttet av NCRR-tilskudd C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; hvor SEM ble utført) og MSJ ble støttet av Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) og National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter knyttet til denne studien.

Det første kritiske trinnet i denne modellen for å identifisere mus som ikke har ryddet UPEC-bakteriuri under den primære UTI-fasen. Disse musene må fjernes fra forsøket, da de ellers ville forvirre frekvensen av UPEC-bakteriuri etter G. vaginalis-eksponering. Etter den første UPEC-inokulasjonen bør urin samles ukentlig for å overvåke bakteriell clearance. Omtrent 65-80% av C57BL/6 mus vil fjerne en UTI89kanR-infeksjon innen 4 uker. Andre innavlede musestammer har forskjellige tilbøyeligheter til UPEC-klaring42,43 og reservoardannelse og er derfor kanskje ikke egnet for denne modellen. Det andre kritiske punktet er at empiriske studier har fastslått at to sekvensielle inokulasjoner av G. vaginalis (enten 12 timer eller 1 wk fra hverandre) er nødvendige for å utløse betydelig reservoaroppkomst over bakgrunnen spontan fremvekst som oppstår i kontrollmus utsatt bare for PBS. Andre tidsperioder mellom de to sekvensielle eksponeringene er ikke testet, men kan gi lignende resultater. Det er viktig å merke seg at en reduksjon i UPEC blæretitere bare ble observert i modellen der G. vaginalis eksponeringer ble gitt 1 wk fra hverandre39. Mens mer enn to eksponeringer kan administreres, tyder empirisk bevis på at gjentatt kateterisering alene øker fremveksten, noe som kan forvirre tolkningen av resultatene eller kreve større antall dyr for å skille forskjeller mellom eksponeringsgrupper og kontroller. Til slutt har in situ blærefikseringsmetoden flere kritiske trinn. Noen ferdigheter er nødvendig for å sikre at fikseringsmiddelet forblir inne i de klemmede blærene. Deflaterte blærer vil være vanskeligere å avbilde med SEM. Det er også viktig å være veldig forsiktig når man inokulerer fikseringsmiddelet i blæren, da skraping av urotelet med det fikseringsholdige kateteret kan indusere urotelial eksfoliering uavhengig av hva som utløses av G. vaginalis. Alle konsentrasjoner nevnt i den fikserende cocktailen er endelige konsentrasjoner. Feil forhold mellom disse kan føre til utilstrekkelig fiksering og hevelse eller krymping av cellene. Fikseringsmidler bør varmes opp til fysiologiske temperaturer for å unngå temperatursjokk i celler og vev. Oppvarming gir også en liten forbedring av diffusjonshastigheten til fikseringsmidler gjennom plasmamembraner. Mens osmiumfarging ofte kan utelates for prøver utarbeidet for SEM-analyse, er det et viktig skritt i denne protokollen for å stabilisere lipider og forhindre sprekker i cellemembraner under kritisk punkttørking.
Denne protokollen kan modifiseres for å teste andre UPEC- og / eller G. vaginalis-stammer for deres evne til å danne reservoarer og utløse deres fremvekst, henholdsvis. Andre eksperimentelle faktorer kan også legges til, for eksempel eksponering for andre vaginale bakterier (f.eks. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller varmedrept G. vaginalis, hvorav ingen viser patologi i denne modellen39. Ved valg av andre bakteriestammer som skal testes, er det viktig å påvise konsistent vekst slik at en standard inokulumkonsentrasjon kan brukes i alle forsøk. Veksten av JCP8151BSmR har blitt optimalisert i et anaerobt kammer. Denne stammen kan sannsynligvis dyrkes i et anaerobt GasPak-system, men dette vil kreve optimalisering for å sikre robust bakterievekst. Til slutt kan det være mulig å endre tidspunktet for visse trinn i modellen. For eksempel kan urin samles på tidligere tidspunkter under UPEC-reservoardannelsesfasen for å overvåke CFU eller vertsrespons. En negativ effekt av urinprøvetaking på tidlige tidspunkter (3, 6, 12 hpi) på infeksjonsprogresjon eller etablering av reservoarer er ikke observert i denne modellen. Fremveksten av UPEC-reservoarer er rapportert å oppstå etter to JCP8151BSmR-doser gitt 12 timer eller 1 wk, men andre tidsintervaller er ennå ikke testet. Det kan også være mulig å redusere den totale tiden for modellen ved å redusere UPEC-reservoardannelsesfasen til 2 uker (i stedet for 4 uker), siden mange av musene fjerner bakteriuri på dette tidspunktet. Tidligere studier som undersøkte UPEC-fremveksten etter blæreeksponering for kjemiske eksfolieringsmidler, brukte en 1 eller 2 wk UPEC reservoardannelsesfase17,18. Imidlertid kan redusert tid for UPEC-bakteriuriclearance komme på bekostning av å kreve at flere dyr skal kastes fra forsøket. Endelig kan SEM-analyse av blæren utføres ved flere tidspunkter for å observere varigheten av effekten av G. vaginalis på urotelet.
Når det gjelder feilsøking, er det noen viktige hensyn spesielt med hensyn til blæren SEM analyse. Avhengig av musebakgrunnen som brukes og mengden betennelse tilstede, vil noen blærer presentere med svært tynne vegger. Disse blærene har en tendens til å krølle seg mer under kritisk punkttørking og kan resultere i en cowrie skalllignende form. Hvis dette skjer, er den beste metoden å kutte den skallformede blæren i to langs det krøllede grensesnittet og deretter en gang til for å fjerne hoveddelen av det overhengende vevet. Skjæring fungerer best med et PTFE-belagt tveegget barberblad. Overflødig fett kan noen ganger oppløses under osmiumfargingstrinnene. Dette kan resultere i uønskede uoppløselige fettdråper som kanskje ikke vaskes av under skyllings- og dehydreringstrinnene, og som kan sette seg på blæreoverflaten under påfølgende tørking. Disse dråpene kan vises som enten små kuler eller skivelignende strukturer spredt over prøven (figur 4D). Dette kan reduseres ved å sikre at så mye fettvev fjernes fra rundt blæren som mulig. Platina kan erstattes med iridiumbelegg, men tykkelsen bør holdes på et minimum for å redusere maskeringen av fine strukturelle detaljer. Bruk av et roterende trinn under belegg anbefales på det sterkeste.
En begrensning ved denne modellen er at den krever et stort antall mus. Bare 65-80% av C57BL/6 mus vil fjerne upec bakteriuri og være egnet for påfølgende G. vaginalis eller PBS inokulasjon (se figur 2C). For å oppnå 10-12 mus per gruppe (G. vaginalis inokulasjon vs. PBS), bør ~ 30 mus i utgangspunktet infiseres med UPEC. Videre er det sannsynligvis nødvendig med flere eksperimenter for å oppnå de biologiske replikasjonene som er nødvendige for å oppdage statistisk signifikans. Når eksponeringer ble gitt 1 wk fra hverandre, oppstod UPEC hos 14% av musene utsatt for PBS (figur 3B). For å oppdage en signifikant økning i UPEC rUTI i G. vaginalis-eksponerte mus i forhold til PBS-kontroller (drevet ved 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) må man derfor teste en kumulativ total på minst 40 mus for hver eksponeringsgruppe. En ekstra vurdering er at disse eksperimentene er dyre og arbeidskrevende. Mus må overvåkes ukentlig for UPEC-clearance, og det eksperimentelle tidsforløpet er 4-5 wk, avhengig av om G. vaginalis gis to ganger i en tidsramme på 12 timer eller to ganger 1 wk fra hverandre. SEM er arbeidskrevende og kan være kostbart, avhengig av tilgjengeligheten av mikroskop og serviceavgifter. Å forberede hele blæren for SEM gir rikelig materiale for analyse, men ulempen er at det kan være tidkrevende å analysere hver blære. Dermed er det sannsynlig at bare et begrenset antall blærer kan analyseres med SEM sammenlignet med de høyere dyretallene som brukes til urin- og vevstitere. I tillegg krever det å skaffe høykvalitetsbilder av de buede overflatene til blærens "kopper" ferdigheter på grunn av skygger som kan hindre synlighet. Selv om blære SEM er et nyttig verktøy for å visualisere urotelial eksfoliering, er denne metoden i stor grad kvalitativ. Fordi prøven er festet i en rund form, og på grunn av bruk av glutaraldehyd i fiksativet, er det ikke mulig å screene for fluorescerende bakterier via lysmikroskopi. Immunostaining og kjemiske fargestoffer er uforenlige med denne prosessen på grunn av bruk av glutaraldehyd som vil kryssbinde de fleste antigener og osmium, og som vil maskere antigensteder og mørke vevet. Når det er sagt, er SEM-teknikken nyttig for parametere som kan evalueres kvantitativt uten bruk av ekstra sonder, for eksempel cellestørrelse 48,49.
Denne modellen gir flere fordeler utover tidligere beskrevne metoder. Det tillater undersøkelse av mekanismer for UPEC rUTI forårsaket av fremvekst fra blærereservoarer, i motsetning til gjeninnføring i blæren fra en ekstern kilde. Andre modeller av rUTI på grunn av fremvekst fra blærereservoarer bruker kjemiske midler (protaminsulfat eller kitosan) for å forårsake urotelial eksfoliering 17,18, som ikke ville være utløsere av rUTI hos kvinner. G. vaginalis er en utbredt urogenital bakterie som er påvist i urin hentet direkte fra blæren via kateterisering eller suprapubisk aspirasjon hos noen kvinner23,26. Dette faktum, kombinert med den kjente sammenhengen mellom BV (hvor G. vaginalis vokser i skjeden) og UTI, antyder at G. vaginalis er en klinisk plausibel utløser av rUTI. Til slutt bevarer in situ blærefikseringsmetoden blærens ultrastruktur og begrenser skade, slik at blærelagene ikke skiller seg fra hverandre. Tidligere metoder for å visualisere urotelet har tradisjonelt fått brukeren til å høste, skjære, strekke og feste blæren aseptisk på et disseksjonsbrett før han senker den strakte blæren ifikseringsmiddel 48. Denne metoden resulterer i en veldig flat prøve, men sikrer ikke jevn eller naturlig strekking av vevet og kan resultere i områder som er over og under strukket (noe som resulterer i svært rynket vev) og kan forårsake blærelagsseparasjon. I tillegg kan disse fysiske manipulasjonene av blæren for å strekke og pinne vevet forårsake skade, inkludert urotelial peeling. En annen metode er å senke intakte blærer i fikseringsmiddel før de legges inn i parafin og får tynne seksjoner med en mikrotom. Tynne seksjoner er uvurderlige for immunhistokjemieksperimenter for å undersøke bakterier og vertsproteinlokalisering, men en tynn seksjon tillater ikke visualisering av uroteloverflaten. Denne SEM-metoden gjør det mulig å undersøke overflaten av hele blæren samtidig.
Som beskrevet inkluderer fremtidige anvendelser av denne modellen testing av andre UPEC-stammer for å avgjøre om de danner intracellulære reservoarer og testing av andre G. vaginalis-stammer for å vurdere om de fremkaller eksfoliering og UPEC-fremvekst for å forårsake rUTI. Andre musestammer utover C57BL / 6 mus kan også testes, selv om mus med høy tilbøyelighet til å utvikle kronisk blærebetennelse (som mus på C3H-bakgrunn) ikke anbefales, siden for mange mus må kastes fra forsøket. En ekstra fordel med C57BL/6 mus er at mange genetiske knockoutstammer er kommersielt tilgjengelige. Slike stammer gir mulighet for å avhøre vertsfaktorene som er involvert i reservoardannelse og/eller fremvekst.

Urinveisinfeksjoner (UTI) pålegger en betydelig helsebelastning over hele verden, noe som påvirker livskvaliteten til millioner av mennesker hvert år, spesielt kvinner1. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) er den hyppigste årsaken til UVI1. Mange pasienter (ca. 20-30%) som utvikler UVI vil oppleve en tilbakevendende UVI (rUTI) innen 6 måneder til tross for antibiotikamediert clearance av den første infeksjonen. Dessverre lider så mange som 5% av premenopausale kvinner av 3 eller flere rUTI hvert år 3,4. Sekvensielle episoder av rUTI kan skyldes vedvarende samme UPEC-stamme fra indekstilfellet 5,6,7,8. Data fra menneskelige prøver og musemodeller tyder på at rUTI med samme belastning kan være forårsaket av UPEC som bor i hvilende reservoarer i blæren. Hos mennesker ble UPEC påvist i epitelceller og blærebiopsier hos pasienter med UVI 9,10,11,12,13. Studier på C57BL/6 mus har vist at noen stammer av UPEC kan etablere hvilende intracellulære reservoarer i blæren, som detektert ved fluorescensmikroskopi og ved homogenisering og kultur av blærevev, som opprettholdes i flere måneder etter oppløsning av bakteriuri 14,15,16. Behandling av blæren med midler som induserer eksfoliering av blæreepitelet (urotel), f.eks. protaminsulfat17 eller kitosan18, utløser fremveksten av UPEC fra reservoarer for å forårsake rUTI. Disse dataene antyder at hos kvinner som har blære UPEC-reservoarer fra en tidligere infeksjon, kan blæreeksponeringer som fører til urotelial eksfoliering utløse rUTI.
Det er økende bevis på at vaginal mikrobiota bidrar til urinveisinfeksjon 19,20. Gardnerella vaginalis er et hyppig medlem av både vaginal og urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I skjeden er tilstedeværelsen av høye nivåer av G. vaginalis forbundet med en mikrobiell dysbiose kjent som bakteriell vaginose (BV), som påvirker ~ 30% av kvinnene 30,31,32. Kvinner med BV har høyere risiko for å oppleve UTI sammenlignet med kvinner med et vaginalt samfunn dominert av Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musemodeller forårsaker G. vaginalis epiteleksfoliering både i vagina38 og i blæren39. I C57BL/6 mus som har UPEC-blærereservoarer, resulterer to sekvensielle blæreeksponeringer for G. vaginalis - men ikke for PBS - i gjenkomst av UPEC fra reservoarer for å forårsake UPEC rUTI. Fremveksten fremgår av utseendet av UPEC-titere i urin fra mus som tidligere hadde løst UPEC-bakteriuri og en påfølgende reduksjon i UPEC-blærehomogenattitere ved ofring sammenlignet med PBS-eksponerte kontrolldyr39. Interessant nok er det ikke en varig kolonisering av G. vaginalis i blæren. I de aller fleste tilfeller er to korte eksponeringer, hver med mindre enn 12 (h) levedyktig G. vaginalis i urin, tilstrekkelig til å fremkalle urotelial peeling og fremme rUTI.
Denne protokollen beskriver en musemodell av rUTI forårsaket av UPEC bosatt i intracellulære blærereservoarer, ved bruk av G. vaginalis blæreinokulasjon for å utløse tilbakefallet. Fremskrittet oppnådd av denne modellen er at G. vaginalis er en klinisk relevant biologisk utløser av rUTI sammenlignet med tidligere brukte kjemiske midler. Videre tillater den relativt kortvarige overlevelsen av G. vaginalis i musens urinveier undersøkelse av virkningen av forbigående mikrobielle eksponeringer på urotelet, som kan oppstå etter seksuell aktivitet. I tillegg til å skissere rUTI-modellen, beskriver denne protokollen også metoder for urincytologi og in situ blærefiksering og avbildning av urotelet ved skanning av elektronmikroskopi (SEM).
Denne protokollen av G. vaginalis-indusert tilbakevendende UPEC UTI bruker UPEC-stamme UTI89 med en kanamycinresistenskassett (UTI89kanR)40. Ikke alle stammer av UPEC testet var i stand til å danne intracellulære bakteriesamfunn under det akutte infeksjonsstadiet hos mus41 , og det er ennå ikke kjent om alle stammer av UPEC har evnen til å danne latente intracellulære reservoarer. Reservoardannelse bør bekreftes før bruk av andre UPEC-stammer i modellen. Denne protokollen bruker et spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induksjon av rUTI ved JCP8151BSmR krever to sekvensielle G. vaginalis-inokulasjoner , gitt enten 12 timer eller 7 dager (d) fra hverandre39. Hvorvidt andre G. vaginalis-stammer induserer eksfoliering og /eller UPEC rUTI, gjenstår å bli bestemt med denne modellen. Det er viktig å bruke UPEC- og G. vaginalis-stammer med kjent antibiotikaresistens (som kanamycin eller spektinomycin for UPEC og streptomycin for G. vaginalis) fordi antibiotika kan tilsettes agarplater for å forhindre vekst av endogen musemikrobiota som ellers kan forstyrre oppregning av kolonidannende enheter (CFU) for å overvåke infeksjon. Dette er spesielt viktig for dyrking av urinprøver, fordi museurin ofte inneholder andre bakterier som kan vokse over på kulturplater uten antibiotika. Opprinnelsen til disse endogene bakteriene i museurin er ukjent, men reflekterer sannsynligvis periuretrale og urogenitale bakterier som ble plukket opp under urininnsamling.
G. vaginalis er en fakultativ anaerob bakterie, og derfor beskriver denne protokollen voksende G. vaginalis JCP8151BSmR i et anaerobt kammer. Hvis et anaerobt kammer ikke er tilgjengelig, kan andre metoder for å opprettholde anaerobe vekstforhold (for eksempel en GasPak-pose i en lufttett beholder) benyttes. Alternativt vil noen stammer av G. vaginalis (inkludert JCP8151BSmR) vokse i en standard vevskulturinkubator (5% CO2). Akkurat som bruk av andre G. vaginalis-stammer enn JCP8151BSmR krever testing for å sikre at bakteriene oppfører seg på samme måte i denne modellen, krever endrede vekstforhold empirisk bestemmelse av ideelle varigheter for kultur (på plater og i væske) og optisk tetthet (OD) 600 ekvivalenter for å oppnå ønskede levedyktige inokulumkonsentrasjoner. Videre er det ikke kjent om vekstforhold påvirker patobiologien til G. vaginalis.
Til slutt, når man vurderer om man skal bruke denne modellen, bør forskere være oppmerksomme på at det kan kreve større antall dyr per gruppe enn typiske UTI-musemodeller. Dette er delvis fordi induksjon av rUTI krever at musene løser UPEC-bakteriuri forårsaket av den første infeksjonen i blæren. Dermed er enhver mus som ikke klarer å fjerne bakteriuri (en fenotype som vanligvis indikerer pågående nyreinfeksjon) ikke inkludert i rUTI-fasen av protokollen. Antall mus som trengs for å drive disse studiene påvirkes også av frekvensen av "spontan" UPEC-fremvekst i urin (12-14% i gjennomsnitt). Til slutt har forskjellige musestammer forskjellige tilbøyeligheter til å utvikle kronisk bakteriuri versus intracellulær reservoardannelse42,43. Ved bruk av andre musestammer enn C57BL/6 i denne modellen må det bekreftes at dyrene utvikler hvilende UPEC intracellulære reservoarer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Tilbakevendende urinveisinfeksjoner (rUTI) forårsaket av uropatogen Escherichia coli (UPEC) er vanlige og kostbare. Tidligere artikler som beskriver modeller av UVI hos hann- og hunnmus har illustrert prosedyrene for bakteriell inokulasjon og oppregning i urin og vev. Under en innledende blæreinfeksjon hos C57BL/6 mus etablerer UPEC latente reservoarer inne i blæreepitelceller som vedvarer etter clearance av UPEC-bakteriuri. Denne modellen bygger på disse studiene for å undersøke rUTI forårsaket av fremveksten av UPEC fra latente blærereservoarer. Den urogenitale bakterien Gardnerella vaginalis brukes som utløser av rUTI i denne modellen fordi den ofte er tilstede i urogenitale kanaler hos kvinner, spesielt i sammenheng med vaginal dysbiose som har vært assosiert med UTI. I tillegg beskrives også en metode for in situ blærefiksering etterfulgt av scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse av blærevev, med potensiell anvendelse på andre studier som involverer blæren.

Etter inokulasjon kan UPEC-titere påvises i urin (figur 2B). Unnlatelse av å plate urinprøver på selektive medier som inneholder kanamycin, vil sannsynligvis føre til overvekst av endogen musemikrobiota som forurenser urinen. Nivået av UPEC-bakteriuri vil sannsynligvis være høyt på dag 1 og kan øke i løpet av den første uken før det avtar ved senere tidspunkter (figur 2C). Omtrent 65-80% av musene vil ikke ha noen påviselig UPEC i urinen med 28 dpi (figur 2C, grønn sirkel). Disse musene kan brukes i de påfølgende trinnene i modellen. Mus som forblir bakteriuriske (figur 2C, rød ellipse) bør elimineres fra forsøket.
To sekvensielle G. vaginaliseksponeringer gitt 12 timer (figur 3A) eller 1 wk fra hverandre (figur 3B) resulterer i fremveksten av UPEC fra intracellulære reservoarer for å forårsake tilbakevendende bakteriuri. Både nivået av UPEC-bakteriuri (Mann-Whitney-test) og fraksjonen av mus som viser UPEC rUTI (Fishers eksakte test) er signifikant høyere hos mus utsatt for G. vaginalis sammenlignet med PBS-kontrollgruppen. Urincytologianalyse påviser PMN i urin fra G. vaginalis-eksponerte mus som viste UPEC-fremvekst (figur 3C). I modellen med to eksponeringer gitt 1 wk fra hverandre, er UPEC-titere i blærevev lavere i G. vaginalis-eksponerte mus sammenlignet med PBS (figur 3D), antagelig på grunn av fremveksten av UPEC fra reservoarer og påfølgende clearance.
Visualisering av in situ-fast blærevev ved SEM avslører store overfladiske paraply urotelceller som fôrer blæreoverflaten i kontrollmus utsatt bare for PBS (figur 4A). Urotelial eksfoliering påvises ved tap av overfladiske paraplyceller, som avslører mindre underliggende overgangsepitelceller hos mus eksponert for G. vaginalis (figur 4B). Tidlig etter UPEC-inokulasjon under etablering av intracellulære reservoarer, er UPEC synlig på urotelet og filamentering ut av eksfolierende celler (figur 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figur 2. Overvåking av UPEC-titere i urin i fase 1 (reservoardannelse). (A) Skjematisk av kolonidannende enheter (CFU) plating. (B) Representativt bilde av UPEC-titere i urin på LB+kanamycin. Svarte sirkler indikerer urinprøveflekker som bør telles for å beregne CFU / ml. (C) Tidsforløp for UPEC-bakteriuri hos C57BL/6 mus. Hver linje representerer en individuell mus, som sporer UPEC-urintiterne over tid. Stiplet linje angir deteksjonsgrensen (1000 CFU/ml). Rød ellipse indikerer fire mus (av 20) som ikke klarte å løse UPEC-bakteriuri og derfor ikke ville bli brukt til G. vaginalis-indusert rUTI-modellen. Omvendt indikerer grønn sirkel mus som løste UPEC-bakteriuri og fortsatte til påfølgende faser. (D) Tabell over data som brukes til å generere graf i panel C. Gul, detekterbar CFU; grønn, ingen CFU. (E) Randomisering av mus til eksponeringsgrupper basert på tidspunktet da UPEC CFU ikke lenger ble påvist i urin ("Day resolved"). Musenumrene i venstre kolonne i panel D er de samme musenumrene som er gitt i panel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figur 3. G. vaginalis utløser UPEC rUTI. UPEC-titere i urin etter to sekvensielle urinveiseksponeringer for PBS (sirkler) eller G. vaginalis (Gvag; kvadrater) gitt 12 timer (A) eller 1 wk (B) fra hverandre. Hvert symbol representerer en individuell mus. Den høyeste CFU/ml UPEC som oppdages fra hver mus mellom 1-3 d etter den andre eksponeringen, plottes. Mus uten påviselig bakteriuri plottes ved deteksjonsgrensen (stiplet linje). (C) Urincytologianalyse som viser UPEC (pilspisser) og polymorfonukleære (PMN) celler (piler). Skala bar = 20 μm. (D) UPEC-titere i blærevev samlet 3 d etter to sekvensielle urinveiseksponeringer gitt 1 wk fra hverandre. Hvert symbol representerer en annen mus og nuller er plottet på grensen for deteksjon (stiplet linje). I A, B og D er boksene i første og tredje kvartil med median markert og værhår fra min til maks. Mann-Whitney U tester * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figur 4. SEM analyse av blærer fast in situ. Blærer ble samlet fra mus 3 timer etter to eksponeringer (12 timer fra hverandre) til PBS (A) eller G. vaginalis (C). Stiplede linjer illustrerer en enkelt urinepitelcelle, som er mindre i G. vaginalis-eksponerte blærer fordi de store overfladiske cellene har eksfoliert bort og avslørt det underliggende overgangsepitelet. (B) Blære samlet 6 timer etter første inokulasjon med UPEC, under fase 1 av modellen, som viser urotelial eksfoliering og ekstracellulær UPEC. (D) Eksempel på uoppløselige fettdråper tilstede på blæreoverflaten. Skalastengene er 20 μm i hovedbildene og 2 μm i innfellingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

En musemodell av uropatogen E. coli (UPEC) transuretral inokulasjon for å etablere latente intracellulære blærereservoarer og påfølgende blæreeksponering for G. vaginalis for å indusere tilbakevendende UPEC UTI er demonstrert. Det er også påvist oppregning av bakterier, urincytologi og in situ blærefiksering og prosessering for skanningelektronmikroskopi.

Tilbakevendende Escherichia coli urinveisinfeksjon utløst av Gardnerella vaginalis Blære eksponering hos mus

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Tilbakevendende Herpes stromal keratitt i Mus, en modell for å studere menneskelig HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasiv Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infeksjon i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinveisinfeksjon i en liten dyr modell: Transurethral Catheterization mannlige og kvinnelige mus

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning av enterohemorrhagiske Escherichia Coli kolonisering i Murine vert av ikke-invasiv i Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En lettvinte protokoll for å generere Site-Specifically Acetylated proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enkelt intracellulær bakteriell samfunn generert fra en Murine modell av urinveisinfeksjon for nedstrøms encellede analyse

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...