Name: transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award a P.R.W. e una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University School of Medicine di St. Louis), National DrDeramus Research (un programma della BrightFocus Foundation) e il McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. è supportato da un Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Questo lavoro è stato supportato anche dall'Hope Center Viral Vectors Core presso la Washington University School of Medicine.

<ol>
	<li>Smith, C. A., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+adeno-associated+viral+vector+labelled+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).</li><li>Liu, H., Ding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+experimental+glaucoma+animal+model:+A+comparison+of+microbead+injection+with+or+without+hydroxypropyl+methylcellulose.">Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).</li><li>Chauhan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+of+retinal+ganglion+cells+and+retinal+thickness+changes+following+optic+nerve+injury+in+mice.">Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice.</a> PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).</li><li>Leung, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+profile+of+retinal+ganglion+cell+damage+after+optic+nerve+crush+with+blue-light+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).</li><li>Murata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mouse+retinal+ganglion+cells+and+their+loss+in+vivo+by+a+fundus+camera+in+the+normal+and+ischemia-reperfusion+model.">Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).</li><li>Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+retinal+microglial+activation+during+neurodegeneration:+confocal+ophthalmoscopic+imaging+and+cell+morphometry+in+mouse+glaucoma.">In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).</li><li>Bremer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+Intravital+Imaging+of+the+Retina+Reveals+Long-term+Dynamics+of+Immune+Infiltration+and+Its+Effects+on+the+Glial+Network+in+Experimental+Autoimmune+Uveoretinitis,+without+Evident+Signs+of+Neuronal+Dysfunction+in+the+Ganglion+Cell+Layer.">Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer.</a> Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+two-photon+microscopy+enables+near-diffraction-limited+and+functional+retinal+imaging+in+vivo.">Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.</a> Light: Science &amp; Applications. 9, 79 (2020).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+cells+in+the+living+retina.">Imaging single cells in the living retina.</a> Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).</li><li>Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+photoreceptor+loss+revealed+with+adaptive+optics:+an+alternate+cause+of+color+blindness.">Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).</li><li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+mosaics+in+the+living+eye.">Imaging retinal mosaics in the living eye.</a> Eye. 25 (3), 301-308 (2011).</li><li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+retinal+pigment+epithelium+cells+in+age+related+macular+degeneration.">In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration.</a> Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+retinal+imaging+in+the+living+mouse+eye.">Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye.</a> Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Takeda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+non-cell-autonomous+cell+death+of+retinal+ganglion+cells.">Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells.</a> Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).</li><li>Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataract-preventing+contact+lens+for+in+vivo+imaging+of+mouse+retina.">Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina.</a> Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).</li><li>Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K., Weber, B. H. F., Langmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+two-photon+microscopy+imaging+of+mouse+retina+and+retinal+pigment+epithelium.">Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium.</a> Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. 1834, 333-343 (2019).</li><li>Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavefront+sensorless+adaptive+optics+fluorescence+biomicroscope+for+in+vivo+retinal+imaging+in+mice.">Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice.</a> Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).</li><li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium.">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).</li><li>Biss, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescent+imaging+of+the+mouse+retina+using+adaptive+optics.">In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics.</a> Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+laser-induced+choroidal+neovascularization.">A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Palczewska, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+infrared+vision+is+triggered+by+two-photon+chromophore+isomerization.">Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevating+Growth+Factor+Responsiveness+and+Axon+Regeneration+by+Modulating+Presynaptic+Inputs.">Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs.</a> Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).</li><li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre+recombinase+in+the+retina.">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li><li>Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axons+and+dendrites+originate+from+neuroepithelial-like+processes+of+retinal+bipolar+cells.">Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells.</a> Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+Cre-recombinase+specifically+in+M-+or+S-cone+photoreceptors.">Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).</li><li>Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrl-Cre+transgenic+mouse+mediates+loxP+recombination+in+developing+rod+photoreceptors.">Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors.</a> Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy:+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling.">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).</li><li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina.">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+binary+labeling+of+retinal+neurons.">Genetically targeted binary labeling of retinal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).</li><li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+transduction+and+targeting+of+retinal+bipolar+cells+with+improved+mGluR6+promoters+in+rodents+and+primates.">AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates.</a> Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).</li><li>Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+AAV+vectors+for+retinal+gene+transfer.">Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer.</a> Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).</li><li>Yao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+proliferation+and+neurogenic+potential+of+Muller+glial+cells+via+a+Lin28/let-7+miRNA-dependent+pathway+in+adult+mammalian+retinas.">Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas.</a> Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recoverable+state+of+axon+injury+persists+for+hours+after+spinal+cord+contusion+in+vivo.">A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo.</a> Nature Communications. 5, 5683 (2014).</li><li>Cheung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+network+alterations+in+the+retina+of+patients+with+Alzheimer's+disease.">Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).</li><li>Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pathologic+changes+in+multiple+sclerosis.">Retinal pathologic changes in multiple sclerosis.</a> Retina. 14 (5), 445-451 (1994).</li><li>Sung, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+retinal+thinning+as+a+biomarker+for+cognitive+impairment+in+de+novo+Parkinson's+disease.">Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La procedura di imaging a due fotoni qui descritta consente l'imaging longitudinale in vivo della retina del topo. Immagini ripetibili della stessa regione della retina possono essere ottenute per un periodo continuo fino a 6 o più ore sotto isoflurano. Il mouse può anche essere ripreso in giorni diversi utilizzando punti di riferimento cellulari e vascolari per localizzare la stessa area di imaging (Figura 3). L'uso di un'immersione in gel trasparente combinata con vetro di copertura per questo scopo è stato precedentemente applicato a una serie di procedure, tra cui la visualizzazione della retina per l'iniezione sottoretinica, modelli di lesioni retiniche indotte dal laser e fundus imaging20,21,22.
L'anatomia dell'occhio presenta sfide uniche per l'imaging in vivo, poiché l'elevata potenza ottica della cornea e della lente del topo impedisce l'imaging diretto attraverso la pupilla senza correzione. Diversi altri metodi di imaging in vivo si basano sull'uso di una lente a contatto plano-concava per la correzione dell'ottica anteriore dell'occhio del topo 7,17,18,19. Con la sola correzione ottica della cornea, l'elevata potenza ottica della lente del topo si traduce in una quantità inevitabile di parallasse, in particolare di strutture nel campo di scansione periferica, che si manifesta come allungamento e movimento traslazionale nella dimensione X-Y a diversi piani Z. Per ridurre al minimo la distorsione correlata alla parallasse dell'immagine nelle dimensioni X e Y, è fondamentale che l'occhio del topo sia orientato in modo tale che il piano tangente alla retina nell'area di imaging sia perpendicolare al percorso della luce del microscopio. La configurazione qui descritta favorisce la manipolazione precisa dell'angolo dell'occhio per ottenere questo allineamento. Un supporto regolabile per la testa del mouse che consente la rotazione lungo due assi consente una facile regolazione manuale dell'angolo dell'occhio mentre lo sperimentatore scorre attraverso la dimensione Z per ridurre al minimo la parallasse. Questa inclinazione aggira anche l'effetto di arresto del campo della pupilla per consentire l'imaging di aree più grandi della retina. Il sistema di ritenuta del supporto della testa riduce notevolmente anche gli artefatti di movimento causati dalla respirazione.
È necessario prestare attenzione per mantenere la chiarezza dell'occhio del mouse, poiché la qualità dell'immagine si deteriorerà con l'opacizzazione durante l'imaging continuo. La frequente riapplicazione del gel lubrificante durante l'imaging e l'applicazione di unguento dopo ogni sessione di imaging aiutano a prevenire l'asciugatura dell'occhio e lo sviluppo di opacità. Alcune opacità corneali si risolveranno spontaneamente dopo 24-48 h. L'uso di gel trasparente e vetro di copertura come descritto in questo protocollo fornisce una qualità dell'immagine e una correzione dell'aberrazione simili a quelle di una lente a contatto7, consentendo al contempo una regolazione più semplice dell'angolo dell'occhio senza la necessità di riallineare il vetro di copertura. Inoltre, il gel fornisce un'idratazione continua all'occhio, rendendo possibile eseguire sessioni di imaging acute fino a diverse ore. Infine, poiché il vetro di copertura non entra in contatto con la cornea, provoca un'irritazione minima all'occhio che può ridurre la chiarezza ottica per ripetere le sessioni di imaging.
Un limite di questo approccio è il fatto che le aberrazioni ottiche non sono completamente corrette. Mentre questo diminuisce notevolmente la risoluzione assiale a causa della parallasse pesante, le misurazioni quantitative del soma possono essere ottenute in piani a immagine singola. Va notato che, poiché l'intensità del segnale di fluorescenza dei neuroni retinici dipende dall'allineamento del campione con questo metodo, i sensori basati sull'eccitazione e sul rapporto di emissione sono più appropriati per gli esperimenti che confrontano i campioni cronicamente in diverse sessioni di imaging. Un approccio per correggere le aberrazioni ottiche a livello di sistema è l'ottica adattiva, che consente la risoluzione subcellulare nella retina 8,9,14,21. Tuttavia, l'ottica adattiva richiede attrezzature altamente specializzate e una vasta esperienza da implementare.
Approcci alternativi all'imaging retinico in vivo a due fotoni sono la microscopia confocale o l'oftalmoscopia6. L'approccio qui presentato dovrebbe essere facilmente traducibile in microscopia a campo largo o confocale. L'imaging a singolo fotone è forse più robusto e presenta meno rischi di danneggiare la retina a causa dell'elevata energia del laser a due fotoni necessaria per ottenere un efficiente effetto a due fotoni attraverso la cornea e la lente dell'occhio. Per evitare danni laser a due fotoni, la soglia per la massima potenza laser dovrebbe essere determinata empiricamente esaminando le retine intere dopo il completamento degli esperimenti di imaging e l'immunocolorazione per i tipi di cellule negli strati ripresi. Nel sistema qui presentato, gli RGC sono stati etichettati con il marcatore pan-RGC, Rbpms, e le densità erano normali fino a 45 mW di potenza di imaging, mentre 55 mW hanno causato una significativa perdita di RGC (non mostrata).
Uno svantaggio dell'imaging a singolo fotone è il fatto che questo approccio stimolerà molto pesantemente i circuiti visivi nativi della retina rispetto all'imaging a due fotoni23. Precedenti esperimenti che utilizzano retinal wholemounts o preparazioni a coppa oculare hanno dimostrato che la scansione laser a due fotoni provoca l'attivazione del circuito che è in gran parte transitoria24. Qui, l'imaging dell'attività RGC con il sensore Ca 2+ Twitch2b mostra che l'inizio della scansione laser induce elevazioni di Ca 2+, che ritornano alla linea di base nel corso di5-20 s nella maggior parte degli RGC (Figura 8). Dato che la potenza del laser in questo protocollo è nell'intervallo di esperimenti precedenti che riportano la risposta alla luce retinica in vivo8, il metodo attualmente descritto è probabilmente suscettibile di registrazioni dell'attività del circuito nella retina. Tali considerazioni sono importanti per gli esperimenti che possono essere influenzati dall'attività del circuito.
Questo protocollo dimostra l'imaging in vivo di due tipi di neuroni retinici, RGC e cellule amacrine. È possibile ottenere una marcatura simile di altri tipi cellulari principali, tra cui cellule orizzontali (Cx57-Cre 25), cellule bipolari (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), fotorecettori dei coni (S- o M-opsina-Cre 28), fotorecettori dei bastoncelli (Nrl-Cre 29), glia di Müller (Foxg1-Cre 26) e periciti (NG2-DsRed9). Topi transgenici sono disponibili anche per marcare sottoinsiemi discreti di RGC (ad esempio, KCNG4-Cre per αRGC30; OPN4-Cre per ipRGC31; JAM-B-CreER per J-RGCs 32) e cellule amacrine (ad esempio, ChAT-Cre per cellule amacrine starburst26 e driver promotori di neuropeptidi per vari sottotipi di cellule amacrine 3,34). I vettori virali possono essere utilizzati per colpire specifiche popolazioni cellulari al posto dei topi transgenici. Le iniezioni intravitreali di AAV2 con un elemento promotore CAG onnipresente etichettano quasi esclusivamente RGC, cellule amacrine e cellule orizzontali25. L'accoppiamento del capside AAV2.7m8-Y444F modificato con un costrutto promotore mGluR6 ingegnerizzato consente un'ampia etichettatura delle cellule bipolari ON35. Le iniezioni sottoretiniche di AAV portano ad un arricchimento dei fotorecettori, con il sierotipo AAV2/5 che ha la più alta efficienza di trasduzione36. Shh10, una proteina del capside AAV6 modificata, accoppiata con elementi promotori della proteina acida fibrillare gliale si è dimostrata specifica per la glia37 di Müller.
La capacità di osservare le cellule del sistema nervoso centrale con un approccio completamente non invasivo può essere utilizzata per studiare sia le proprietà di base dei circuiti neurali8, sia i meccanismi di neurodegenerazione 3,4,5,6,38. Molte malattie accecanti colpiscono le popolazioni cellulari nella retina e approcci di imaging in vivo nei topi sono stati utilizzati per studiare la lesione del nervo ottico 1,3,4, la degenerazione maculare13, l'ictus5, il glaucoma 2,6 e l'uveite7. Inoltre, molte condizioni neurodegenerative del sistema nervoso centrale si manifestano nella retina, tra cui il morbo di Alzheimer39, la sclerosi multipla40 e il morbo di Parkinson41. Pertanto, questa tecnica facilmente accessibile per l'imaging in vivo della retina può essere applicata come strumento per studiare una vasta gamma di condizioni neurodegenerative.

La visualizzazione in vivo del sistema nervoso centrale richiede generalmente procedure invasive come l'assottigliamento del cranio e l'installazione di finestre di vetro o lenti a relè ottico. La retina è l'unica struttura del sistema nervoso che può essere osservata direttamente senza la necessità di una preparazione invasiva in quanto riceve nativamente luce dall'ambiente. La facilità di accesso ottico alla retina lo rende un sistema modello attraente per lo studio del sistema nervoso centrale.
L'imaging fluorescente dal vivo della retina nei topi è stato utilizzato per tracciare la morte RGC in modelli di glaucoma 1,2, danno del nervo ottico 1,3,4 e ictus5, nonché cambiamenti nell'attivazione microgliale 6,7,8 e nella vascolarizzazione 9 in condizioni degenerative. I segnali intrinseci possono anche essere utilizzati per visualizzare i fotorecettori 10,11,12 e le cellule epiteliali pigmentate retiniche 13. Molti approcci all'imaging in vivo della retina utilizzano dispositivi altamente specializzati specificamente progettati per scopi oftalmologici6 o sistemi ottici altamente modificati per correggere le aberrazioni native della cornea e del cristallino 8,9,11,12,13,14.
Il presente protocollo dimostra un approccio all'imaging in vivo di segnali fluorescenti nella retina a risoluzione cellulare, utilizzando un metodo di base per correggere parzialmente l'ottica anteriore dell'occhio del topo. Questa strategia richiede adattamenti molto minori alle configurazioni del microscopio multifotone che sono comunemente utilizzate per l'imaging in vivo del cervello. Poiché questo approccio è semplice da configurare e i topi sono sottoposti a poco stress, è favorevole eseguire esperimenti time-lapse su entrambe le durate acute e croniche. Inoltre, le procedure genetiche e organiche basate su coloranti che etichettano i singoli componenti della retina, tra cui RGC, cellule amacrine, microglia e vascolarizzazione, sono compatibili con questa tecnica di imaging e consentono l'osservazione in vivo di tipi e strutture cellulari critiche per la funzione retinica. Questi strumenti possono essere adattati per etichettare la maggior parte degli altri tipi di cellule neuronali e le componenti gliali e vascolari della retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>152440</td>
			<td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80950</td>
			<td>22G cemented needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV2)</td>
			<td>Hope Center Viral Core</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Air Pump</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0132</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Small Animal Anesthesia Device</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R500IE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFP/YFP filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>480/40, 505 long pass, 535/30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromoFlex - Two channel PMT detection unit</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPLG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>tp-700</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10713-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Filter Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DH1</td>
			<td>Holds coverslip over mouse eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ controller chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe-1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2090A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1677409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPGA module with digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Evacuation Apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R546W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Severe lubricant eye gel&#160;&#160;</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>(from local pharmacy)</td>
			<td>For use during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/Red filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>535/30, 560 long pass, 605/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>McKesson Medical and Surgical</td>
			<td>190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-101080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Main module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Scan Path</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope X galvo Module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>MP-100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji software</td>
			<td></td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (active scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32 to M26 adapter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M32M26S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai GUI software</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>R2015b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam (5 mg/mL)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NDC 0010-6013-01</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micorscope Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>46-404</td>
			<td>Mitutoyo WE715042319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Flaming/Brown Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bulldog hemostatic clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.05&#34; ID, 0.09&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Posts 1/2&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR3-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter kit</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>COO-LED3ULLGs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell amplifier</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>Model 302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1571001</td>
			<td>For eye immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red &#38; Far Red short pass filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>560 short pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating 1/2&#34; post clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage package</td>
			<td>Vidrio Technologies</td>
			<td>Freeware</td>
			<td>Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride solution, sterile (0.9%)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC 63323-186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Benchmate C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment</td>
			<td>Zoetisus</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoRack cooling system</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>ThermoRack 401</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoScope for In Vivo Imaging</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPVS-1200-00P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment</td>
			<td>Stye</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine HCl (20 mg/mL)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina

La retina trasforma i segnali luminosi dall'ambiente in segnali elettrici che vengono propagati al cervello. Le malattie della retina sono prevalenti e causano disabilità visiva e cecità. Capire come tali malattie progrediscono è fondamentale per formulare nuovi trattamenti. La microscopia in vivo in modelli animali di malattia è un potente strumento per comprendere la neurodegenerazione e ha portato a importanti progressi verso il trattamento di condizioni che vanno dal morbo di Alzheimer all'ictus. Dato che la retina è l'unica struttura del sistema nervoso centrale intrinsecamente accessibile da approcci ottici, si presta naturalmente all'imaging in vivo. Tuttavia, l'ottica nativa della lente e della cornea presenta alcune sfide per un accesso efficace alle immagini.
Questo protocollo delinea i metodi per l'imaging in vivo a due fotoni di coorti e strutture cellulari nella retina del topo a risoluzione cellulare, applicabile sia per esperimenti di imaging di durata acuta che cronica. Presenta esempi di cellule gangliari retiniche (RGC), cellule amacrine, microglia e imaging vascolare utilizzando una serie di tecniche di etichettatura tra cui vettori di virus adeno-associati (AAV), topi transgenici e coloranti inorganici. È importante sottolineare che queste tecniche si estendono a tutti i tipi di cellule della retina e vengono descritti i metodi suggeriti per accedere ad altre popolazioni cellulari di interesse. Vengono inoltre illustrate in dettaglio le strategie di esempio per la post-elaborazione manuale delle immagini per la visualizzazione e la quantificazione. Queste tecniche sono direttamente applicabili agli studi sulla funzione retinica in salute e malattia.

Vari approcci transgenici, vettoriali virali o di marcatura inorganica possono essere utilizzati per visualizzare specificamente diversi tipi e strutture di cellule retiniche in vivo utilizzando un semplice adattamento di un microscopio multifotone di base. Per visualizzare RGC e cellule amacrine, i topi transgenici VGlut2-Cre e VGat-Cre, rispettivamente, hanno ricevuto un'iniezione intravitreale di un costrutto di espressione AAV Cre-dipendente che codifica Twitch2b, un sensore Ca 2+ basato su Ca 2+ di risonanza di fluorescenza citoplasmatica (FRET) che contiene proteine fluorescenti ciano e gialle (CFP e YFP, rispettivamente) e il dominio di legame Ca2+ della troponina15. . Nei topi VGlut2-Cre, i somi RGC sono chiaramente distinguibili e i fascicoli degli assoni sono spesso evidenti (Figura 3).
Va notato che la traiettoria degli assoni e l'immagine negativa della vascolarizzazione rendono molto semplice identificare la testa del nervo ottico nei topi VGlut2-Cre, che è utile come punto di riferimento negli esperimenti di imaging cronico (Figura 3). Sebbene le cellule amacrine appaiano meno luminose delle RGC, probabilmente a causa della loro dimensione più piccola del soma e/o della trasduzione AAV meno efficiente, i loro somi sono ancora facilmente evidenti nello strato nucleare interno. A differenza delle RGC, i neuriti delle cellule amacrine sono più spesso osservati negli strati plessiformi interni (Figura 4). La microglia retinica può essere ripresanella linea 6 del topo transgenico Cx3cr1-GFP. La microglia si associa alla vascolarizzazione, rendendo possibile trovare la stessa regione negli esperimenti di imaging time-lapse.
Questo approccio può essere utilizzato per tracciare la dinamica dei processi di microglia fine, una procedura che ha una migliore risoluzione spaziale nelle immagini a piano singolo, o se vengono preparate proiezioni di massima intensità concentrandosi sulle singole cellule (Figura 5). La scarsa risoluzione assiale causata dall'aberrazione ottica attraverso la lente del mouse preclude l'esame di dettagli fini nella dimensione z. Per determinare se questa tecnica di imaging può osservare cambiamenti degenerativi nell'ultrastruttura cellulare, 1 μL di 50 mM N-metil-D-aspartato (NMDA) è stato iniettato nel vitreo per indurre una lesione eccitotossica. Un giorno dopo l'iniezione, la microglia ha mostrato processi brevi o morfologia ameboide (Figura 5) in conformità con i rapporti precedenti16. Va notato che le cellule della linea transgenica Cx3cr1-GFP hanno mostrato un'espressione proteica fluorescente più uniforme e completa in tutta la coorte cellulare rispetto agli esperimenti con somministrazione mediata da AAV di cassette di espressione proteica fluorescente. I vantaggi di un'etichettatura varia e sparsa rispetto a un'etichettatura completa e uniforme dovrebbero essere considerati quando si progettano esperimenti.
Per marcare la vascolarizzazione retinica come descritto in precedenza8, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 200 μL di colorante blu di Evans (20 mg / ml in soluzione salina sterile) 30-60 minuti prima dell'imaging. Ciò ha portato a una forte etichettatura dei vasi sanguigni provenienti dalla testa del nervo ottico (Figura 6). Sorprendentemente, il segnale fluorescente di una singola iniezione è persistito per almeno sette giorni. Sono stati utilizzati due metodi distinti per stimare le dimensioni delle immagini in vivo. In primo luogo, le stesse regioni retiniche sono state visualizzate in vivo e dopo la fissazione in interi retinici appiattiti utilizzando la microscopia confocale (Figura 7). Sono state selezionate coppie di cellule casuali da quattro diversi campioni in vivo e la vera distanza tra le coppie di cellule è stata misurata in scansioni confocali e abbinata alla distanza dei pixel in vivo per ottenere una dimensione media dei pixel di 0,99 μm con ingrandimento digitale 1x. Utilizzando metodi simili correlando le immagini in vivo con le scansioni confocali wholemount ha rivelato che una singola posizione della testa consente di visualizzare immagini su una patch di retina di circa 650 mm2 .
Il riposizionamento del supporto della testa lungo un asse torsionale può consentire l'accesso a una regione lineare della retina di 2,2 mm di lunghezza (non mostrata). Inoltre, microsfere fluorescenti di 1 o 2 μm di diametro sono state iniettate negli occhi dei topi e il loro diametro è stato misurato come metà larghezza completa delle scansioni di linea da immagini in vivo con zoom digitale 10x. Ciò ha fornito una stima delle dimensioni dei pixel leggermente più grande, ma con una maggiore varianza (Figura 7). Nel complesso, l'imaging confocale di campioni interi dopo il completamento degli esperimenti in vivo è il metodo più coerente per assegnare la scala alle singole immagini, poiché la varianza nelle proprietà corneali e del cristallino può alterare la scala dell'immagine da campione a campione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Figura 1: Schema del percorso luminoso. I componenti di base del microscopio a due fotoni utilizzati in questo protocollo consistono in una cella di Pockels per modulare la potenza del laser, una coppia di lenti per ridurre il diametro del raggio laser per abbinare l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio e una coppia di specchi a scansione galvo per la direzione del fascio. Una coppia di specchietti retrovisori dello sterzo è presente prima di ogni componente ottico principale. La messa a fuoco è controllata da un motore che aziona il supporto dell'obiettivo. Il percorso della luce di emissione può essere personalizzato per diversi fluorofori sostituendo i filtri dicroici e barriera. Viene visualizzata una configurazione generale per l'imaging ciano/giallo/rosso in cui uno specchio dicroico a passaggio corto dirige la luce rossa al primo PMT e uno specchio dicroico a passaggio lungo abbinato a filtri passa-banda appropriati viene utilizzato per separare le emissioni ciano e gialle. Abbreviazione: PMT = tubo fotomoltiplicatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Figura 2: Posizionamento dei topi per l'imaging in vivo. Per posizionare il mouse con la pupilla sull'asse con il percorso della luce, il topo anestetizzato viene prima trattenuto in un supporto per la testa, la testa viene ruotata e angolata, una grande goccia di gel per gli occhi lubrificante viene posizionata sull'occhio e il mouse viene posizionato sul palco. Un coprislip è montato nel supporto del coprislip perpendicolare al percorso della luce e abbassato verso l'occhio. Il coprislip non deve entrare in contatto con la cornea o la testa del topo (a sinistra), il che sarà evidente se il coprislip viene deviato. Tuttavia, il foglietto di copertura dovrebbe anche essere abbastanza vicino da evitare la perdita della goccia (a destra), perché ciò avrà un effetto demagnificante sul campione. Dopo aver applicato l'immersione in gel e fissato il vetrino, il palco deve essere spostato in posizione direttamente sotto l'obiettivo del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Figura 3: Imaging delle cellule gangliari retiniche. Per la visualizzazione delle immagini, vengono create proiezioni di massima intensità con i piani z contenenti celle di interesse e le immagini risultanti vengono filtrate medianamente per rimuovere il rumore di ripresa PMT. Vengono mostrati due esempi di cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre, in particolare il segnale CFP. Le immagini sono state acquisite durante le sessioni a quattro giorni di distanza l'una dall'altra e sono stati utilizzati punti di riferimento vascolari per tornare nella stessa regione vicino alla testa del nervo ottico. La testa del nervo ottico è orientata verso la parte inferiore dell'immagine. Sebbene entrambi i campioni mostrino una certa varianza nell'orientamento (le regioni con intensità ridotta sono indicate con frecce), la maggior parte delle celle è presente in entrambi i punti temporali. Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: PMT = tubo fotomoltiplicatore; AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2; CFP = proteina fluorescente ciano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Figura 4: Imaging delle cellule amacrine. Le cellule di amacrine sono state marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGat-Cre. Il segnale CFP di Twitch 2b è specificamente mostrato. Piccole proiezioni di intensità massima focalizzate sulle profondità dello strato nucleare interno indicano somi a cellule amacrine, mentre concentrandosi sul plessiforme interno si risolvono i neuriti delle cellule amacrine (freccia). La testa del nervo ottico è orientata verso destra dell'immagine. Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGat = trasportatore vescicolare dell'acido gamma aminobutirrico; CFP = proteina fluorescente ciano; INL = strato nucleare interno; IPL = strato plessiforme interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Figura 5: Imaging delle microglia. La linea di topi transgenici Cx3cr1-GFP è stata utilizzata per marcare le microglia. Una proiezione di massima intensità dell'intero volume di scansione mostra molte microglia, alcune con dettagli di processo fini che possono essere risolti. Si noti che le celle verso la parte inferiore sinistra del campo hanno meno distorsione nella proiezione massima rispetto a quelle verso l'alto a destra a causa della parallasse in questa regione. Le proiezioni di intensità massima contenenti solo la cella di interesse riducono significativamente questa parallasse (al centro, inscatolata nei colori corrispondenti). Inoltre, questa strategia di imaging può documentare la dinamica del rimodellamento del processo di microglia fine (pannelli inferiori). Comparativamente, molte microglia possono essere osservate con processi brevi o morfologia ameboide un giorno dopo una lesione eccitotossica mediante iniezione intravitreale di 50 mM NMDA (a destra). Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; Cx3cr1 = recettore 1 delle chemochine Cx3; NMDA = N-metil-D-aspartato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Figura 6: Etichettatura dei punti di riferimento vascolari. Ai topi sono stati iniettati 200 μL di 20 mg/mL di blu di Evans per via intraperitoneale 30-60 minuti prima della prima sessione di imaging. Le proiezioni di intensità massima a tutto spessore dimostrano una fluorescenza duratura nel sistema colarizzatore retinico che persiste per almeno sette giorni. Barra di scala = circa 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Figura 7: Dimensioni dell'immagine. Le cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre sono state visualizzate in vivo e la stessa regione è stata quindi ripresa mediante microscopia a scansione laser confocale dopo la fissazione e la preparazione completa della retina. Il canale proteico fluorescente giallo è mostrato per entrambi. Le coppie di frecce colorate indicano la stessa cella in entrambi i preparati (pannelli superiori). Immagine a piano singolo di microsfere fluorescenti di 2 μm di diametro iniettate per via intravitreale e riprese in vivo (pannello in basso a sinistra). Le microsfere non si depositavano e quindi erano in costante movimento rendendo impossibile la misurazione della risoluzione assiale. Dimensioni dei pixel calcolate da misurazioni a mezza larghezza massima di microsfere fluorescenti in vivo o misurazioni confocali correlate prese da 2-4 retine per gruppo (in basso a destra). Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Figura 8: Attività del calcio indotta dalla scansione a due fotoni. Cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre, YFP è pseudocolorato magenta e verde CFP, ripreso in un singolo piano come serie temporale a 4,22 Hz. Tutti gli RGC avevano un rapporto YFP/CFP iniziale simile. La maggior parte ha risposto con un aumento del rapporto FRET (esclusa la cella arancione) e uno ha mantenuto un elevato rapporto YFP / CFP durante le serie temporali (cella gialla). I rapporti YFP/CFP sono stati normalizzati alla media del primo fotogramma e i cerchi colorati corrispondono alle tracce colorate. Gli asterischi indicano punti temporali con immagini rappresentative visualizzate a sinistra. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2; YFP = proteina fluorescente gialla; CFP = proteina fluorescente ciano; RGC = cellule gangliari retiniche; FRET = trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina at JoVE.com

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Questo metodo di imaging in vivo delle cellule retiniche consente di indagare sulle malattie oftalmologiche e di comprendere le normali funzioni della retina. Questo metodo fornisce un approccio semplice e altamente riproducibile all'imaging in vivo della retina mediante microscopia a due fotoni. Stabilizzare correttamente il mouse è la chiave per ottenere immagini in vivo di qualità.Esercitati a posizionare il mouse nel supporto della testa e prendi confidenza con la procedura prima di provare ad acquisire immagini. Sedare l'animale secondo il protocollo di utilizzo degli animali approvato. Applicare la soluzione di dilatazione della pupilla e lasciare il mouse al buio per cinque minuti per consentire alle pupille di dilatarsi.Fissare il perno del condotto uditivo inferiore nella posizione estesa verso l'interno e il perno del condotto uditivo superiore nella posizione ritirata. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la barra dell'auricolare non viene inclinata di 60 gradi sotto l'orizzontale. Con il mouse rivolto verso la barra del morso, montare un orecchio sul perno inferiore esteso con il perno inserito nel condotto uditivo.Dopo aver allentato la vite che fissa il perno del condotto uditivo superiore, estendere il perno nell'altro condotto uditivo e stringere nuovamente la vite per fissare la testa. Assicurarsi che il mouse sia saldamente nel supporto della testina. Premere verso il basso sulla parte superiore della testa.Il mouse deve rimanere saldamente nelle barre auricolari e la sua testa deve ruotare liberamente attorno all'asse dei canali uditivi. Con la barra del morso posizionata verso la testa del topo, sollevare delicatamente la testa del topo per consentire agli incisivi mascellari di essere abbassati nel supporto della barra del morso e ritrarre la barra del morso con forza delicata per fissare la testa. Utilizzare la vite per fissare la barra del morso in posizione e posizionare il mouse e il supporto sul palco del microscopio.Applicare colliri lubrificanti su entrambi gli occhi del mouse. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la pupilla di un occhio è orientata in linea con il percorso della luce e posizionare un coprifiltro numero 1,5 nel portafiltro compatto. Dopo aver fissato il supporto allo stadio del microscopio, abbassare il coprislip fino a quando non entra in contatto con il gel per gli occhi lubrificante senza toccare la cornea e regolare lo stadio nella dimensione X-Y e nella posizione Z dell'obiettivo fino a quando la luce di eccitazione a campo largo copre completamente la cornea.Utilizzare l'oculare per continuare a regolare la posizione Z fino a quando le cellule fluorescenti o le strutture della retina non vengono messe a fuoco, aumentando l'illuminatore di epifluorescenza se necessario per risolvere singole cellule o strutture di interesse. Ottimizzare l'allineamento della retina con il percorso della luce di imaging. Regolare l'angolo della testa fino a quando non si verifica solo l'espansione o la contrazione della luce sfocata quando si cambia il piano focale, riducendo al minimo le distorsioni X-Y.Quindi, spegnere l'illuminatore a epifluorescenza e chiudere l'otturatore dell'illuminatore. Per l'imaging a due fotoni, seguire tutti i protocolli di sicurezza laser istituzionali. Spegnere e coprire tutta la luce ambientale e passare il percorso della luce di eccitazione al laser e il percorso della luce di emissione ai PMT.Nel software di acquisizione immagini, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512 e la media dei fotogrammi su tre. Impostare lo Z-stepping in modo che inizi dalla parte superiore della pila e progredisca verso il basso, riducendo al minimo l'attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori. Accendere e abilitare i PMT e regolare la tensione a 680 volt.Abilita gli otturatori di imaging ed emissione. Inizia un'anteprima dell'immagine dal vivo del tessuto target, a partire da una potenza laser dell'1%, e regola automaticamente la luminosità del display per visualizzare le cellule o le strutture di interesse. Se il tessuto bersaglio è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare i 45 milliwatt.Manovra lo stadio del microscopio nella direzione X-Y per centrare l'area di imaging desiderata e naviga verso il piano Z con le strutture di interesse a fuoco. Per un esperimento time-lapse cronico, aprire un'immagine ottenuta in precedenza da utilizzare come riferimento per le celle di interesse, avendo cura che l'angolo di imaging nell'immagine corrente sia simile a quello delle immagini precedenti. Quindi, passare ai piani Z superiore e inferiore di interesse per impostare i limiti Z dello stack di immagini e acquisire l'immagine.Quando tutte le immagini sono state acquisite, disattivare i PMT e l'otturatore laser. Passare il percorso della luce di eccitazione all'illuminazione a epifluorescenza e il percorso della luce di emissione all'oculare. Quindi, uscire dal software di acquisizione delle immagini, spegnere il laser nell'interfaccia del computer e spegnere l'hardware in ordine di avvio inverso, ad eccezione dell'apparecchiatura sempre attiva.Al termine dell'analisi, rimuovere il mouse dal supporto della testa e utilizzare un fazzoletto privo di lanugine per rimuovere delicatamente il gel per gli occhi. Quindi, applicare un unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a circolazione di acqua calda a 37 gradi Celsius con monitoraggio fino a completa recumbency, prima di riportare il mouse nel suo alloggiamento. Nei topi VGlut-2-Cre, i somi delle cellule gangliari retiniche sono chiaramente distinguibili e i fasci assoni sono spesso evidenti.La traiettoria degli assoni e l'immagine negativa della vascolarizzazione facilitano l'identificazione della testa del nervo ottico nei topi VGlut-2-Cre, che è utile come punto di riferimento negli esperimenti di imaging cronico. In contrasto con le cellule gangliari retiniche, i neuriti delle cellule amacrine sono più spesso osservati negli strati plessiformi interni. Un giorno dopo l'iniezione intraoculare di NMDA, la microglia retinica mostra processi brevi o morfologia ameboide in conformità con i rapporti precedenti.La somministrazione del colorante blu di Evans tramite una singola iniezione intraperitoneale da 30 a 60 minuti prima dell'imaging induce una forte etichettatura dei vasi sanguigni emanati dalla testa del nervo ottico che persiste per almeno sette giorni. Dopo la fissazione, la vera distanza tra le coppie di cellule all'interno di interi supporti retinici appiattiti può essere misurata in scansioni confocali e abbinata alle distanze dei pixel in vivo per determinare la dimensione media dei pixel delle immagini in vivo. Le microsfere fluorescenti iniettate negli occhi dei topi consentono la misurazione del diametro della microsfera in vivo, fornendo una stima delle dimensioni dei pixel leggermente più grande ma con una maggiore varianza.L'imaging in vivo può essere abbinato ad analisi istologiche come l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ. Questi metodi possono identificare specifici tipi di cellule ed esaminare l'espressione genica delle cellule visualizzate.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...