Name: transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00
Duration: 9 min 3 s
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Este trabalho foi apoiado por doações da Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award to P.R.W. e uma doação irrestrita ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Washington University School of Medicine em St. Louis), National Glaucoma Research (um programa da BrightFocus Foundation) e do McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. é apoiado por um Prêmio Institucional do Serviço Nacional de Pesquisa T32 EY013360. Este trabalho também foi apoiado pelo Hope Center Viral Vectors Core da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

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Os autores não têm nada a revelar.

O procedimento de imagem de dois fótons aqui descrito permite a imagem longitudinal in vivo da retina do rato. Imagens repetíveis da mesma região da retina podem ser obtidas por um período contínuo de até 6 ou mais h sob isoflurano. O camundongo também pode ser fotografado em dias diferentes usando marcos celulares e vasculares para localizar a mesma área de imagem (Figura 3). O uso de uma imersão em gel transparente combinada com vidro de cobertura para esse fim já foi aplicado a uma série de procedimentos, incluindo visualização da retina para injeção sub-retiniana, modelos de lesão retiniana induzida por laser e imagem de fundode olho 20,21,22.
A anatomia do olho apresenta desafios únicos para a imagem in vivo, já que o alto poder óptico da córnea e da lente do mouse impede a imagem direta através da pupila sem correção. Vários outros métodos de imagem in vivo contam com o uso de uma lente de contato plano-côncava para correção da óptica anterior do olho de camundongo 7,17,18,19. Com apenas correção óptica na córnea, o alto poder óptico da lente do mouse resulta em uma quantidade inevitável de paralaxe, particularmente de estruturas no campo de varredura periférico, manifestando-se como alongamento e movimento de translação na dimensão X-Y em diferentes planos Z. Para minimizar a distorção relacionada à paralaxe de imagem nas dimensões X e Y, é crucial que o olho do rato seja orientado de tal forma que o plano tangente à retina na área de imagem seja perpendicular ao caminho da luz do microscópio. A configuração descrita aqui é propícia à manipulação precisa do ângulo do olho para alcançar esse alinhamento. Um suporte ajustável da cabeça do mouse que permite a rotação ao longo de dois eixos permite ajustes manuais fáceis do ângulo do olho à medida que o experimentador percorre a dimensão Z para minimizar a paralaxe. Essa inclinação também contorna o efeito de parada de campo da pupila para permitir a imagem de áreas maiores da retina. A contenção do suporte da cabeça também reduz muito os artefatos de movimento causados pela respiração.
Deve-se tomar cuidado para manter a clareza do olho do rato, pois a qualidade da imagem se deteriorará com a opacificação durante a imagem contínua. A reaplicação frequente de gel lubrificante durante a imagem e a aplicação de pomada após cada sessão de imagem ajudam a evitar que o olho seque e desenvolva opacidades. Algumas opacidades corneanas se resolverão espontaneamente após 24-48 h. O uso de gel transparente e vidro de cobertura, conforme descrito neste protocolo, proporciona qualidade de imagem e correção de aberração semelhantes às de uma lente de contato7, ao mesmo tempo em que permite ajustes mais fáceis do ângulo dos olhos sem a necessidade de realinhar o vidro de cobertura. Além disso, o gel proporciona hidratação contínua ao olho, possibilitando a realização de sessões de imagem aguda de até várias horas. Finalmente, uma vez que o vidro da tampa não entra em contato com a córnea, causa irritação mínima no olho que pode reduzir a clareza óptica para sessões de imagem repetidas.
Uma limitação dessa abordagem é o fato de que as aberrações ópticas não são totalmente corrigidas. Embora isso diminua severamente a resolução axial devido à paralaxe pesada, as medições quantitativas do soma podem ser obtidas em planos de imagem única. Deve-se notar que, como a intensidade do sinal de fluorescência dos neurônios da retina depende do alinhamento da amostra com esse método, os sensores baseados em razão de excitação e emissão são mais apropriados para experimentos que comparam amostras cronicamente em diferentes sessões de imagem. Uma abordagem para corrigir aberrações ópticas no nível do sistema é a óptica adaptativa, que permite a resolução subcelular na retina 8,9,14,21. No entanto, a óptica adaptativa requer equipamentos altamente especializados e ampla experiência para implementar.
Abordagens alternativas para imagens de retina in vivo de dois fótons são a microscopia confocal ou a oftalmoscopia6. A abordagem aqui apresentada deve ser facilmente traduzível para microscopia de campo largo ou confocal. A imagem de fóton único é talvez mais robusta e representa menos risco de danificar a retina devido à alta energia do laser de dois fótons necessária para alcançar um efeito eficiente de dois fótons através da córnea e da lente do olho. Para evitar danos ao laser de dois fótons, o limiar para a potência máxima do laser deve ser determinado empiricamente examinando retinas inteiras após a conclusão de experimentos de imagem e imunocoloração para tipos de células nas camadas fotografadas. No sistema aqui apresentado, os RGCs foram rotulados com o marcador pan-RGC, Rbpms, e as densidades foram normais até 45 mW de potência de imagem, enquanto 55 mW causaram uma perda significativa de RGCs (não mostrado).
Uma desvantagem da imagem de fóton único é o fato de que essa abordagem estimulará fortemente os circuitos visuais nativos da retina em comparação com a imagem de dois fótons23. Experimentos anteriores usando montagens inteiras de retina ou preparações de óculos mostraram que a varredura a laser de dois fótons provoca uma ativação de circuito que é em grande parte transitória24. Aqui, a imagem da atividade do RGC com o sensor Ca 2+ Twitch2b mostra que o início da varredura a laser induz elevações de Ca 2+, que retornam à linha de base ao longo de5-20 s na maioria dos RGCs (Figura 8). Dado que a potência do laser neste protocolo está na faixa de experimentos anteriores relatando resposta à luz retiniana in vivo8, o método atualmente descrito é provavelmente passível de registros da atividade do circuito na retina. Tais considerações são importantes para experimentos que podem ser influenciados pela atividade do circuito.
Este protocolo demonstra imagens in vivo de dois tipos de neurônios da retina, RGCs e células amácrinas. Marcação semelhante de outros tipos de células principais pode ser alcançada, incluindo células horizontais (Cx57-Cre 25), células bipolares (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), fotorreceptores de cone (S- ou M-opsin-Cre 28), fotorreceptores de bastonetes (Nrl-Cre 29), glia de Müller (Foxg1-Cre 26) e pericitos (NG2-DsRed9). Camundongos transgênicos também estão disponíveis para rotular subconjuntos discretos de RGCs (por exemplo, KCNG4-Cre para αRGCs30; OPN4-Cre para ipRGCs31; JAM-B-CreER para J-RGCs 32) e células amácrinas (por exemplo, ChAT-Cre para células amácrinasstarburst 26 e drivers promotores de neuropeptídeos para vários subtipos de células amácrinas 3,34). Vetores virais podem ser usados para atingir populações celulares específicas em vez de camundongos transgênicos. Injeções intravítreas de AAV2 com um elemento promotor CAG onipresente rotulam quase exclusivamente RGCs, células amácrinas e células horizontais25. O emparelhamento do capsídeo modificado AAV2.7m8-Y444F com uma construção promotora mGluR6 modificada permite uma ampla marcação das células bipolares ON35. As injeções sub-retinianas de AAV levam a um enriquecimento dos fotorreceptores, com o sorotipo AAV2/5 tendo a maior eficiência de transdução36. Shh10, uma proteína modificada do capsídeo AAV6, emparelhada com elementos promotores de proteína ácida fibrilar glial, demonstrou ser específica para a glia de Müller37.
A capacidade de observar células do sistema nervoso central com uma abordagem completamente não invasiva pode ser utilizada para estudar tanto as propriedades básicas dos circuitos neurais8, quanto os mecanismos de neurodegeneração 3,4,5,6,38. Muitas doenças cegantes têm como alvo populações celulares na retina, e abordagens de imagem in vivo em camundongos têm sido usadas para estudar lesão do nervo óptico 1,3,4, degeneração macular13, acidente vascular cerebral5, glaucoma 2,6 e uveíte7. Além disso, muitas condições neurodegenerativas do sistema nervoso central se manifestam na retina, incluindo a doença de Alzheimer39, a esclerose múltipla40 e a doença de Parkinson41. Portanto, esta técnica prontamente acessível para imagens in vivo da retina pode ser aplicada como uma ferramenta para estudar um amplo conjunto de condições neurodegenerativas.

A visualização in vivo do sistema nervoso central geralmente requer procedimentos invasivos, como afinamento do crânio e instalação de janelas de vidro ou lentes de relé óptico. A retina é a única estrutura do sistema nervoso que pode ser observada diretamente sem a necessidade de preparação invasiva, pois recebe nativamente luz do ambiente. A facilidade de acesso óptico à retina a torna um sistema modelo atraente para estudar o sistema nervoso central.
Imagens fluorescentes vivas da retina em camundongos têm sido usadas para rastrear a morte por RGC em modelos de glaucoma 1,2, lesão do nervo óptico 1,3,4 e acidente vascular cerebral5, bem como alterações na ativação microglial 6,7,8 e vasculatura9 em condições degenerativas. Sinais intrínsecos também podem ser utilizados para visualizar fotorreceptores 10,11,12 e células epiteliais pigmentares da retina 13. Muitas abordagens de imagens in vivo da retina utilizam dispositivos altamente especializados projetados especificamente para fins oftalmológicos6 ou sistemas ópticos altamente modificados para corrigir as aberrações nativas da córnea e do cristalino 8,9,11,12,13,14.
O presente protocolo demonstra uma abordagem à imagem in vivo de sinais fluorescentes na retina em resolução celular, utilizando um método básico de correção parcial da óptica anterior do olho do rato. Essa estratégia requer adaptações muito pequenas às configurações de microscópio multifóton que são comumente usadas para imagens in vivo do cérebro. Como essa abordagem é simples de configurar e os camundongos estão sob pouco estresse, é propício realizar experimentos de lapso de tempo ao longo de durações agudas e crônicas. Além disso, procedimentos genéticos e orgânicos baseados em corantes que rotulam componentes individuais da retina, incluindo RGCs, células amácrinas, micróglia e vasculatura, são compatíveis com essa técnica de imagem e permitem a observação in vivo de tipos e estruturas celulares críticas para a função da retina. Essas ferramentas podem ser adaptadas para rotular a maioria dos outros tipos de células neuronais, bem como componentes gliais e vasculares da retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>152440</td>
			<td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80950</td>
			<td>22G cemented needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV2)</td>
			<td>Hope Center Viral Core</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Air Pump</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0132</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Small Animal Anesthesia Device</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R500IE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFP/YFP filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>480/40, 505 long pass, 535/30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromoFlex - Two channel PMT detection unit</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPLG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>tp-700</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10713-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Filter Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DH1</td>
			<td>Holds coverslip over mouse eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ controller chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe-1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2090A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1677409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPGA module with digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Evacuation Apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R546W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Severe lubricant eye gel&#160;&#160;</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>(from local pharmacy)</td>
			<td>For use during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/Red filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>535/30, 560 long pass, 605/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>McKesson Medical and Surgical</td>
			<td>190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-101080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Main module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Scan Path</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope X galvo Module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>MP-100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji software</td>
			<td></td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (active scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32 to M26 adapter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M32M26S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai GUI software</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>R2015b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam (5 mg/mL)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NDC 0010-6013-01</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micorscope Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>46-404</td>
			<td>Mitutoyo WE715042319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Flaming/Brown Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bulldog hemostatic clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.05&#34; ID, 0.09&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Posts 1/2&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR3-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter kit</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>COO-LED3ULLGs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell amplifier</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>Model 302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1571001</td>
			<td>For eye immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red &#38; Far Red short pass filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>560 short pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating 1/2&#34; post clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage package</td>
			<td>Vidrio Technologies</td>
			<td>Freeware</td>
			<td>Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride solution, sterile (0.9%)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC 63323-186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Benchmate C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment</td>
			<td>Zoetisus</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoRack cooling system</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>ThermoRack 401</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoScope for In Vivo Imaging</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPVS-1200-00P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment</td>
			<td>Stye</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine HCl (20 mg/mL)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina

A retina transforma sinais de luz do ambiente em sinais elétricos que são propagados para o cérebro. As doenças da retina são prevalentes e causam deficiência visual e cegueira. Entender como essas doenças progridem é fundamental para formular novos tratamentos. A microscopia in vivo em modelos animais de doença é uma ferramenta poderosa para a compreensão da neurodegeneração e levou a um progresso importante em direção a tratamentos de condições que vão desde a doença de Alzheimer até o acidente vascular cerebral. Dado que a retina é a única estrutura do sistema nervoso central inerentemente acessível por abordagens ópticas, ela naturalmente se presta a imagens in vivo. No entanto, a óptica nativa do cristalino e da córnea apresenta alguns desafios para o acesso efetivo à imagem.
Este protocolo descreve métodos para imagens in vivo de dois fótons de coortes e estruturas celulares na retina de camundongos em resolução celular, aplicáveis a experimentos de imagem de duração aguda e crônica. Ele apresenta exemplos de células ganglionares da retina (RGC), células amácrinas, microgliais e imagens vasculares usando um conjunto de técnicas de marcação, incluindo vetores de vírus adenoassociados (AAV), camundongos transgênicos e corantes inorgânicos. É importante ressaltar que essas técnicas se estendem a todos os tipos de células da retina, e os métodos sugeridos para acessar outras populações celulares de interesse são descritos. Também são detalhados exemplos de estratégias para pós-processamento manual de imagens para exibição e quantificação. Essas técnicas são diretamente aplicáveis aos estudos da função retiniana na saúde e na doença.

Várias abordagens transgênicas, vetoriais virais ou de marcação de corantes inorgânicos podem ser usadas para visualizar especificamente vários tipos e estruturas de células da retina in vivo usando uma adaptação simples de um microscópio multifóton básico. Para visualizar RGCs e células amácrinas, camundongos transgênicos VGlut2-Cre e VGat-Cre, respectivamente, receberam uma injeção intravítrea de um construto de expressão AAV dependente de Cre que codifica Twitch2b, um sensor Ca 2+ baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência citoplasmática (FRET) que contém proteínas fluorescentes ciano e amarela (CFP e YFP, respectivamente) e o domínio de ligação Ca2+ da troponina15 . Em camundongos VGlut2-Cre, os somas RGC são claramente discerníveis, e os fascículos dos axônios são frequentemente aparentes (Figura 3).
Deve-se notar que a trajetória dos axônios e a imagem negativa da vasculatura tornam muito simples identificar a cabeça do nervo óptico em camundongos VGlut2-Cre, o que é útil como um marco em experimentos crônicos de imagem (Figura 3). Embora as células amácrinas pareçam menos brilhantes do que as RGCs, possivelmente devido ao seu menor tamanho de soma e / ou transdução de AAV menos eficiente, seus somas ainda são prontamente aparentes na camada nuclear interna. Em contraste com os RGCs, os neurites de células amácrinas são mais frequentemente observados nas camadas plexiformes internas (Figura 4). A micróglia retiniana pode ser fotografada na linha6 transgênica de camundongos Cx3cr1-GFP. A micróglia associa-se à vasculatura, tornando possível encontrar a mesma região em experimentos de imagem de lapso de tempo.
Essa abordagem pode ser usada para rastrear a dinâmica de processos de micróglias finas, um procedimento que tem melhor resolução espacial em imagens de plano único, ou se projeções de intensidade máxima são preparadas com foco em células individuais (Figura 5). A baixa resolução axial causada pela aberração óptica através da lente do mouse impede o exame de detalhes finos na dimensão z. Para determinar se esta técnica de imagem pode observar alterações degenerativas na ultraestrutura celular, 1 μL de 50 mM de N-metil-D-aspartato (NMDA) foi injetado no vítreo para induzir lesão excitotóxica. Um dia após a injeção, a micróglia demonstrou processos curtos ou morfologia ameboide (Figura 5) de acordo com relatos anteriores16. Deve-se notar que as células da linhagem transgênica Cx3cr1-GFP exibiram expressão proteica fluorescente mais uniforme e completa em toda a coorte celular do que em experimentos com entrega mediada por AAV de fluorescentes de expressão proteica. Os benefícios de uma rotulagem variada e esparsa versus completa e uniforme devem ser considerados ao projetar experimentos.
Para marcar a vasculatura da retina como descrito anteriormente8, camundongos foram injetados por via intraperitoneal com 200 μL de corante azul de Evans (20 mg/mL em solução salina estéril) 30-60 min antes da imagem. Isso levou a uma forte marcação dos vasos sanguíneos que emanam da cabeça do nervo óptico (Figura 6). Surpreendentemente, o sinal fluorescente de uma única injeção persistiu por pelo menos sete dias. Dois métodos distintos foram utilizados para estimar as dimensões das imagens in vivo. Primeiramente, as mesmas regiões da retina foram fotografadas in vivo e após fixação em todo-achatadas da retina por microscopia confocal (Figura 7). Pares de células aleatórias foram selecionados a partir de quatro diferentes amostras in vivo, e a distância verdadeira entre os pares de células foi medida em varreduras confocais e combinada com a distância de pixels in vivo para obter um tamanho médio de pixel de 0,99 μm com ampliação digital de 1x. O uso de métodos semelhantes correlacionando imagens in vivo com varreduras confocais de montagem completa revelou que uma única posição da cabeça permite a obtenção de imagens sobre um pedaço de retina de aproximadamente 650 mm2 .
O reposicionamento do suporte da cabeça ao longo de um eixo de torção pode permitir o acesso a uma região linear da retina de 2,2 mm de comprimento (não mostrada). Além disso, microesferas fluorescentes de 1 ou 2 μm de diâmetro foram injetadas nos olhos de camundongos e seu diâmetro foi medido como meio máximo de largura total de varreduras de linha a partir de imagens in vivo com zoom digital de 10x. Isso deu uma estimativa de tamanho de pixel um pouco maior, mas com mais variância (Figura 7). No geral, a imagem confocal de amostras inteiras após a conclusão de experimentos in vivo é o método mais consistente para atribuir escala a imagens individuais, pois a variância nas propriedades da córnea e da lente pode alterar a escala de imagem de amostra para amostra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Figura 1: Esquema de caminho de luz. Os componentes básicos do microscópio de dois fótons usados neste protocolo consistem em uma célula de Pockels para modular a potência do laser, um par de lentes para reduzir o diâmetro do feixe de laser para corresponder à abertura traseira da objetiva do microscópio e um par de espelhos de varredura galvo para direção do feixe. Um par de espelhos de direção está presente antes de cada componente óptico principal. O foco é controlado por um motor que aciona a montagem objetiva. O caminho da luz de emissão pode ser personalizado para diferentes fluoróforos, trocando os filtros dicroicos e de barreira. Uma configuração geral para imagens ciano/amarelas/vermelhas é exibida na qual um espelho dicroico de passagem curta direciona a luz vermelha para o primeiro PMT, e um espelho dicroico de passagem longa emparelhado com filtros passa-banda apropriados é usado para separar as emissões ciano e amarela. Abreviação: PMT = tubo fotomultiplicador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Figura 2: Posicionamento de camundongos para imagens in vivo. Para posicionar o mouse com a pupila no eixo com o caminho da luz, o rato anestesiado é primeiro contido em um suporte de cabeça, a cabeça é girada e angulada, uma grande gota de gel lubrificante para os olhos é colocada no olho e o mouse é colocado no palco. Uma tampa é montada no suporte da tampa perpendicular ao caminho da luz e abaixada em direção ao olho. A tampa não deve entrar em contato com a córnea ou a cabeça do rato (esquerda), o que será evidente se a tampa for desviada. No entanto, a folha de cobertura também deve estar perto o suficiente para evitar a cintura da gota (à direita), porque isso terá um efeito de desampliação na amostra. Depois de aplicar a imersão em gel e fixar a tampa, o estágio deve ser movido no lugar diretamente sob a objetiva do microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Figura 3: Imagem das células ganglionares da retina. Para exibição de imagens, projeções de intensidade máxima com os planos z contendo células de interesse são criadas e as imagens resultantes são filtradas pela mediana para remover o ruído de disparo PMT. Dois exemplos de células ganglionares da retina marcadas pela injeção de AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b em camundongos transgênicos VGlut2-Cre são mostrados, especificamente o sinal CFP. As imagens foram adquiridas em sessões com quatro dias de intervalo, e marcos vasculares foram utilizados para retornar à mesma região próxima à cabeça do nervo óptico. A cabeça do nervo óptico é orientada para a parte inferior da imagem. Embora ambas as amostras apresentem alguma variância na orientação (regiões com intensidade diminuída são indicadas com setas), a maioria das células está presente em ambos os momentos. Barra de escala = aproximadamente 50 μm. Abreviaturas: PMT = tubo fotomultiplicador; AAV = vírus adenoassociado; EF1α = fator de alongamento-1alfa; FLEX = excisão por flip; VGlut2 = transportador vesicular de glutamato 2; CFP = proteína fluorescente ciano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Figura 4: Imagem de células amácrinas. As células amácrinas foram marcadas injetando-se AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b em camundongos transgênicos VGat-Cre. O sinal CFP do Twitch 2b é mostrado especificamente. Pequenas projeções de intensidade máxima focadas nas profundezas da camada nuclear interna indicam somas de células amácrinas, enquanto o foco no plexiforme interno resolve neurites de células amácrinas (seta). A cabeça do nervo óptico é orientada para a direita da imagem. Barra de escala = aproximadamente 50 μm. Abreviaturas: AAV = vírus adenoassociado; EF1α = fator de alongamento-1alfa; FLEX = excisão por flip; VGat = transportador vesicular de ácido gama aminobutírico; CFP = proteína fluorescente ciano; INL = camada nuclear interna; IPL = camada plexiforme interna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Figura 5: Microglia de imagem. A linhagem transgênica de camundongos Cx3cr1-GFP foi utilizada para marcar a micróglia. Uma projeção de intensidade máxima do volume total de varredura mostra muitas micróglias, algumas com detalhes finos do processo que podem ser resolvidos. Note-se que as células em direção ao canto inferior esquerdo do campo têm menos distorção na projeção máxima do que aquelas em direção ao canto superior direito devido à paralaxe nesta região. Projeções de intensidade máxima contendo apenas a célula de interesse reduzem significativamente essa paralaxe (centro, encaixotada nas cores correspondentes). Além disso, esta estratégia de imagem pode documentar a dinâmica do processo de remodelação da micróglia fina (painéis inferiores). Comparativamente, muitas micróglias podem ser observadas com processos curtos ou morfologia ameboide um dia após uma lesão excitotóxica por injeção intravítrea de NMDA de 50 mM (à direita). Barra de escala = aproximadamente 50 μm. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; Cx3cr1 = receptor de quimiocina Cx3 1; NMDA = N-metil-D-aspartato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Figura 6: Rotulagem dos marcos vasculares. Os camundongos foram injetados com 200 μL de 20 mg/mL de azul de Evans por via intraperitoneal 30-60 min antes da primeira sessão de imagem. Projeções de intensidade máxima de espessura total demonstram fluorescência duradoura na vasculatura da retina que persistiu por pelo menos sete dias. Barra de escala = aproximadamente 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Figura 7: Dimensões da imagem. Células ganglionares da retina marcadas pela injeção de AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b em camundongos transgênicos VGlut2-Cre foram fotografadas in vivo, e a mesma região foi então fotografada por microscopia confocal de varredura a laser após fixação e preparação integral da retina. O canal de proteína fluorescente amarela é mostrado para ambos. Pares de setas coloridas indicam a mesma célula em ambas as preparações (painéis superiores). Imagem de plano único de microesferas fluorescentes de 2 μm de diâmetro injetadas intravitalmente e fotografadas in vivo (painel inferior esquerdo). As microesferas não se assentaram e, portanto, estavam em constante movimento, impossibilitando a medição da resolução axial. Tamanhos de pixel calculados a partir de medições de largura total de meio máximo de microesferas fluorescentes in vivo ou medições confocais correlativas tomadas de 2-4 retinas por grupo (canto inferior direito). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: AAV = vírus adenoassociado; EF1α = fator de alongamento-1alfa; FLEX = excisão por flip; VGlut2 = transportador vesicular de glutamato 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Figura 8: Atividade de cálcio induzida pela varredura de dois fótons. Células ganglionares da retina marcadas pela injeção de AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b em camundongos transgênicos VGlut2-Cre, YFP é magenta pseudocolorido e CFP verde, fotografado em um único plano como uma série temporal a 4,22 Hz. Todos os RGCs apresentaram uma relação YFP/CFP inicial semelhante. A maioria respondeu com um aumento na relação FRET (excluindo a célula laranja), e um manteve uma alta relação YFP/CFP ao longo da série temporal (célula amarela). As relações YFP/CFP foram normalizadas para a média do primeiro quadro, e os círculos coloridos correspondem aos traços coloridos. Os asteriscos indicam pontos de tempo com imagens representativas exibidas à esquerda. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: AAV = vírus adenoassociado; EF1α = fator de alongamento-1alfa; FLEX = excisão por flip; VGlut2 = transportador vesicular de glutamato 2; YFP = proteína fluorescente amarela; CFP = proteína fluorescente ciano; RGCs = células ganglionares da retina; FRET = transferência de energia de ressonância de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Este método de imagem in vivo de células da retina permite investigações de doenças oftalmológicas e compreensão das funções normais da retina. Este método fornece uma abordagem direta e altamente reprodutível para imagens in vivo da retina por microscopia de dois fótons. Estabilizar adequadamente o mouse é fundamental para obter imagens in vivo de qualidade.Pratique a colocação do mouse no suporte da cabeça e fique confortável com o procedimento antes de tentar adquirir imagens. Sedar o animal de acordo com o protocolo de utilização animal aprovado. Aplique a solução de dilatação da pupila e deixe o rato no escuro durante cinco minutos para permitir que as pupilas se dilatem.Prenda o pino do canal auditivo inferior na posição estendida para dentro e o pino do canal auditivo superior na posição retirada. Gire o braço principal do suporte da cabeça até que a barra do fone de ouvido esteja inclinada em um ângulo de 60 graus abaixo da horizontal. Com o rato virado para a barra de mordida, monte uma orelha no pino inferior estendido com o pino inserido no canal auditivo.Depois de soltar o parafuso que prende o pino do canal auditivo superior, estenda o pino para o outro canal auditivo e aperte novamente o parafuso para prender a cabeça. Certifique-se de que o rato está seguro no suporte da cabeça. Pressione para baixo no topo da cabeça.O rato deve ficar firmemente nas barras auriculares e sua cabeça deve girar livremente em torno do eixo dos canais auditivos. Com a barra de mordida posicionada em direção à cabeça do rato, eleve suavemente a cabeça do rato para permitir que os incisivos maxilares sejam abaixados para o suporte da barra de mordida e retraia a barra de mordida com força suave para fixar a cabeça. Use o parafuso para fixar a barra de mordida na posição e coloque o mouse e o suporte no palco do microscópio.Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos do rato. Gire o braço principal do suporte de cabeça até que a pupila de um olho esteja orientada de acordo com o caminho da luz e coloque uma tampa de número 1,5 no suporte de filtro compacto. Depois de prender o suporte ao estágio do microscópio, abaixe a tampa até que ela entre em contato com o gel ocular lubrificante sem tocar na córnea e ajuste o estágio na dimensão X-Y e na posição Z objetiva até que a luz de excitação de campo largo cubra totalmente a córnea.Use a ocular para continuar a ajustar a posição Z até que as células ou estruturas fluorescentes da retina entrem em foco, aumentando o iluminador de epifluorescência conforme necessário para resolver células ou estruturas individuais de interesse. Ajuste o alinhamento da retina com o caminho da luz de imagem. Ajuste o ângulo da cabeça até que ocorra apenas a expansão ou contração da luz fora de foco ao alterar o plano focal, minimizando as distorções X-Y.Em seguida, desligue o iluminador de epifluorescência e feche o obturador do iluminador. Para imagens de dois fótons, siga todos os protocolos institucionais de segurança a laser. Desligue e cubra toda a luz ambiente e alterne o caminho da luz de excitação para o laser e o caminho da luz de emissão para os PMTs.No software de aquisição de imagens, defina o tamanho do quadro para 512 por 512 e a média de quadros para três. Defina o passo Z para começar no topo da pilha e progredir para baixo, minimizando a ativação a laser de dois fótons dos fotorreceptores. Ligue e ative os PMTs e ajuste a tensão para 680 volts.Ative os obturadores de imagem e emissão. Inicie uma visualização de imagem ao vivo do tecido alvo, começando com uma potência de laser de 1%, e ajuste automaticamente o brilho da tela para visualizar as células ou estruturas de interesse. Se o tecido alvo estiver escuro ou pouco claro, aumente a porcentagem de potência do laser até que as estruturas se tornem visíveis sem ultrapassar 45 miliwatts.Manobrar o estágio do microscópio na direção X-Y para se concentrar em uma área de imagem desejada e navegar até o plano Z com as estruturas de interesse em foco. Para um experimento crônico de lapso de tempo, abra uma imagem previamente obtida para usar como referência para as células de interesse, cuidando para que o ângulo de imagem na imagem atual seja semelhante ao das imagens anteriores. Em seguida, navegue até os planos Z superiores e inferiores de interesse para definir os limites Z da pilha de imagens e adquirir a imagem.Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, desative os PMTs e o obturador a laser. Mude o caminho da luz de excitação para a iluminação de epifluorescência e o caminho da luz de emissão de volta para a ocular. Em seguida, saia do software de aquisição de imagem, desligue o laser na interface do computador e desligue o hardware em ordem de inicialização inversa, com exceção do equipamento sempre ativo.No final da análise, remova o rato do suporte da cabeça e utilize um tecido sem fiapos para remover suavemente o gel para os olhos. Em seguida, aplique pomada ocular lubrificante em ambos os olhos e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento circulante de água quente de 37 graus Celsius com monitoramento até a decúbito total, antes de retornar o mouse à sua carcaça. Em camundongos VGlut-2-Cre, os somas de células ganglionares da retina são claramente discerníveis e os fascículos axônicos são frequentemente aparentes.A trajetória dos axônios e a imagem negativa da vasculatura facilitam a identificação da cabeça do nervo óptico em camundongos VGlut-2-Cre, o que é útil como um marco em experimentos de imagem crônica. Em contraste com as células ganglionares da retina, os neurites de células amácrinas são mais frequentemente observados nas camadas plexiformes internas. Um dia após a injeção intraocular de NMDA, a micróglia retiniana demonstra processos curtos ou morfologia ameboide de acordo com relatórios anteriores.A administração do corante azul de Evans através de uma única injeção intraperitoneal 30 a 60 minutos antes da imagem induz uma forte marcação dos vasos sanguíneos que emanam da cabeça do nervo óptico que persiste por pelo menos sete dias. Após a fixação, a distância real entre os pares de células dentro de montagens inteiras de retina achatadas pode ser medida em varreduras confocais e combinada com distâncias de pixels in vivo para determinar o tamanho médio de pixels de imagens in vivo. Microesferas fluorescentes injetadas nos olhos de camundongos permitem a medição do diâmetro da microesfera in vivo, dando uma estimativa de tamanho de pixel um pouco maior, mas com mais variância.A imagem in vivo pode ser emparelhada com análises histológicas, como imunocoloração e hibridização in situ. Esses métodos podem identificar tipos específicos de células e examinar a expressão gênica de células fotografadas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...