Name: transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina at JoVE.com

Bu çalışma, Körlüğü Önleme Araştırması Vakfı (P.R.W.'ye Kariyer Geliştirme Ödülü ve St. Louis'deki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne sınırsız bir hibe), Ulusal Glokom Araştırması (BrightFocus Vakfı'nın bir programı) ve McDonnell Hücresel ve Moleküler Nörobiyoloji Merkezi'nden gelen hibelerle desteklenmiştir. Z.W., Kurumsal Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü T32 EY013360 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Hope Center Viral Vectors Core tarafından da desteklendi.

<ol>
	<li>Smith, C. A., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+adeno-associated+viral+vector+labelled+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).</li><li>Liu, H., Ding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+experimental+glaucoma+animal+model:+A+comparison+of+microbead+injection+with+or+without+hydroxypropyl+methylcellulose.">Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).</li><li>Chauhan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+of+retinal+ganglion+cells+and+retinal+thickness+changes+following+optic+nerve+injury+in+mice.">Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice.</a> PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).</li><li>Leung, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+profile+of+retinal+ganglion+cell+damage+after+optic+nerve+crush+with+blue-light+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).</li><li>Murata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mouse+retinal+ganglion+cells+and+their+loss+in+vivo+by+a+fundus+camera+in+the+normal+and+ischemia-reperfusion+model.">Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).</li><li>Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+retinal+microglial+activation+during+neurodegeneration:+confocal+ophthalmoscopic+imaging+and+cell+morphometry+in+mouse+glaucoma.">In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).</li><li>Bremer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+Intravital+Imaging+of+the+Retina+Reveals+Long-term+Dynamics+of+Immune+Infiltration+and+Its+Effects+on+the+Glial+Network+in+Experimental+Autoimmune+Uveoretinitis,+without+Evident+Signs+of+Neuronal+Dysfunction+in+the+Ganglion+Cell+Layer.">Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer.</a> Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+two-photon+microscopy+enables+near-diffraction-limited+and+functional+retinal+imaging+in+vivo.">Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.</a> Light: Science &amp; Applications. 9, 79 (2020).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+cells+in+the+living+retina.">Imaging single cells in the living retina.</a> Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).</li><li>Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+photoreceptor+loss+revealed+with+adaptive+optics:+an+alternate+cause+of+color+blindness.">Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).</li><li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+mosaics+in+the+living+eye.">Imaging retinal mosaics in the living eye.</a> Eye. 25 (3), 301-308 (2011).</li><li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+retinal+pigment+epithelium+cells+in+age+related+macular+degeneration.">In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration.</a> Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+retinal+imaging+in+the+living+mouse+eye.">Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye.</a> Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Takeda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+mediate+non-cell-autonomous+cell+death+of+retinal+ganglion+cells.">Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells.</a> Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).</li><li>Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataract-preventing+contact+lens+for+in+vivo+imaging+of+mouse+retina.">Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina.</a> Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).</li><li>Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K., Weber, B. H. F., Langmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+two-photon+microscopy+imaging+of+mouse+retina+and+retinal+pigment+epithelium.">Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium.</a> Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. 1834, 333-343 (2019).</li><li>Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavefront+sensorless+adaptive+optics+fluorescence+biomicroscope+for+in+vivo+retinal+imaging+in+mice.">Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice.</a> Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).</li><li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium.">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).</li><li>Biss, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescent+imaging+of+the+mouse+retina+using+adaptive+optics.">In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics.</a> Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+laser-induced+choroidal+neovascularization.">A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Palczewska, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+infrared+vision+is+triggered+by+two-photon+chromophore+isomerization.">Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).</li><li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevating+Growth+Factor+Responsiveness+and+Axon+Regeneration+by+Modulating+Presynaptic+Inputs.">Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs.</a> Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).</li><li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre+recombinase+in+the+retina.">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li><li>Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axons+and+dendrites+originate+from+neuroepithelial-like+processes+of+retinal+bipolar+cells.">Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells.</a> Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+Cre-recombinase+specifically+in+M-+or+S-cone+photoreceptors.">Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).</li><li>Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrl-Cre+transgenic+mouse+mediates+loxP+recombination+in+developing+rod+photoreceptors.">Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors.</a> Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy:+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling.">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).</li><li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors:+cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision.">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li><li>Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).</li><li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina.">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+binary+labeling+of+retinal+neurons.">Genetically targeted binary labeling of retinal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).</li><li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+transduction+and+targeting+of+retinal+bipolar+cells+with+improved+mGluR6+promoters+in+rodents+and+primates.">AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates.</a> Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).</li><li>Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatility+of+AAV+vectors+for+retinal+gene+transfer.">Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer.</a> Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).</li><li>Yao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+proliferation+and+neurogenic+potential+of+Muller+glial+cells+via+a+Lin28/let-7+miRNA-dependent+pathway+in+adult+mammalian+retinas.">Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas.</a> Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recoverable+state+of+axon+injury+persists+for+hours+after+spinal+cord+contusion+in+vivo.">A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo.</a> Nature Communications. 5, 5683 (2014).</li><li>Cheung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+network+alterations+in+the+retina+of+patients+with+Alzheimer's+disease.">Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's &amp; Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).</li><li>Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pathologic+changes+in+multiple+sclerosis.">Retinal pathologic changes in multiple sclerosis.</a> Retina. 14 (5), 445-451 (1994).</li><li>Sung, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+retinal+thinning+as+a+biomarker+for+cognitive+impairment+in+de+novo+Parkinson's+disease.">Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada açıklanan iki fotonlu görüntüleme prosedürü, fare retinasının uzunlamasına in vivo görüntülenmesini sağlar. Aynı retina bölgesinin tekrarlanabilir görüntüleri, izofluran altında 6 veya daha fazla saate kadar sürekli bir süre boyunca elde edilebilir. Fare, aynı görüntüleme alanını bulmak için hücresel ve vasküler işaretler kullanılarak farklı günlerde de görüntülenebilir (Şekil 3). Bu amaçla kapak camı ile kombine edilmiş berrak bir jel daldırma kullanımı daha önce subretinal enjeksiyon için retinanın görselleştirilmesi, lazerle indüklenen retina hasarı modelleri ve fundus görüntüleme20,21,22 dahil olmak üzere bir dizi prosedüre uygulanmıştır.
Gözün anatomisi, in vivo görüntüleme için benzersiz zorluklar sunar, çünkü fare korneasının ve lensin yüksek optik gücü, göz bebeğinin düzeltilmeden doğrudan görüntülenmesini engeller. Diğer bazı in vivo görüntüleme yöntemleri, fare gözünün ön optiklerinin düzeltilmesi için plano-içbükey kontakt lens kullanımına dayanır 7,17,18,19. Korneada sadece optik düzeltme ile, fare lensinin yüksek optik gücü, özellikle periferik tarama alanındaki yapıların kaçınılmaz miktarda paralaksına neden olur ve farklı Z-düzlemlerinde X-Y boyutunda gerilme ve translasyonel hareket olarak kendini gösterir. X ve Y boyutlarında görüntü paralaksına bağlı bozulmayı en aza indirmek için, fare gözünün görüntüleme alanındaki retinaya teğet düzlemin mikroskop ışık yoluna dik olacak şekilde yönlendirilmesi çok önemlidir. Burada açıklanan kurulum, bu hizalamayı elde etmek için göz açısının hassas bir şekilde manipüle edilmesine elverişlidir. İki eksen boyunca dönmeye izin veren ayarlanabilir bir fare kafası tutucusu, deneyci paralaksı en aza indirmek için Z boyutunda gezinirken göz açısının manuel olarak kolayca ayarlanmasını sağlar. Bu eğilme aynı zamanda retinanın daha geniş alanlarının görüntülenmesine izin vermek için göz bebeğinin alan durdurma etkisini de atlatmaktadır. Baş tutucunun kısıtlanması, solunumun neden olduğu hareket artefaktlarını da büyük ölçüde azaltır.
Sürekli görüntüleme sırasında opaklaştırma ile görüntü kalitesi bozulacağından, fare gözünün netliğini korumak için özen gösterilmelidir. Görüntüleme sırasında yağlayıcı jelin sık sık yeniden uygulanması ve her görüntüleme seansından sonra merhem uygulanması, gözün kurumasını ve opaklık geliştirmesini önlemeye yardımcı olur. Bazı kornea opasiteleri 24-48 saat sonra kendiliğinden düzelir. Bu protokolde açıklandığı gibi şeffaf jel ve kapak camının kullanılması, kontakt lens7 ile benzer görüntü kalitesi ve sapma düzeltmesi sağlarken, kapak camını yeniden hizalamanıza gerek kalmadan göz açısının daha kolay ayarlanmasını sağlar. Ek olarak, jel göze sürekli hidrasyon sağlar ve birkaç saate kadar akut görüntüleme seanslarının gerçekleştirilmesini mümkün kılar. Son olarak, kapak camı korneaya temas etmediğinden, tekrar görüntüleme seansları için optik netliği azaltabilecek gözde minimum tahrişe neden olur.
Bu yaklaşımın bir sınırlaması, optik sapmaların tamamen düzeltilmemesidir. Bu, ağır paralaks nedeniyle eksenel çözünürlüğü ciddi şekilde azaltırken, soma'nın kantitatif ölçümleri tek resimli düzlemlerde elde edilebilir. Retinal nöronların floresan sinyal yoğunluğu bu yöntemle numune hizalamasına bağlı olduğundan, uyarma ve emisyon oranımetrik tabanlı sensörlerin, farklı görüntüleme oturumlarında örnekleri kronik olarak karşılaştıran deneyler için daha uygun olduğu belirtilmelidir. Sistem düzeyinde optik anormallikleri düzeltmeye yönelik bir yaklaşım, retinadahücre altı çözünürlüğe izin veren adaptif optiktir 8,9,14,21. Bununla birlikte, uyarlanabilir optik, uygulanması için son derece özel ekipman ve kapsamlı uzmanlık gerektirir.
İki foton in vivo retinal görüntülemeye alternatif yaklaşımlar konfokal mikroskopi veya oftalmoskopidir6. Burada sunulan yaklaşım, geniş alan veya konfokal mikroskopiye kolayca çevrilebilir olmalıdır. Tek foton görüntüleme belki de daha sağlamdır ve gözün korneası ve merceği aracılığıyla verimli iki foton etkisi elde etmek için gerekli olan iki fotonlu lazerin yüksek enerjisi nedeniyle retinaya zarar verme riski daha azdır. İki fotonlu lazer hasarını önlemek için, maksimum lazer gücü eşiği, görüntüleme deneylerinin tamamlanmasından sonra tüm retinalar incelenerek ve görüntülenen katmanlardaki hücre tipleri için immün boyama yapılarak ampirik olarak belirlenmelidir. Burada sunulan sistemde, RGC'ler pan-RGC işaretleyicisi, Rbpms ile etiketlendi ve yoğunluklar 45 mW görüntüleme gücüne kadar normalken, 55 mW önemli bir RGC kaybına neden oldu (gösterilmedi).
Tek fotonlu görüntülemenin bir dezavantajı, bu yaklaşımın retinanın doğal görsel devrelerini iki fotonlu görüntülemeye kıyasla çok ağır bir şekilde uyaracağı gerçeğidir23. Retinal bütünler veya vizör adaptörü preparatları kullanılarak yapılan önceki deneyler, iki fotonlu lazer taramanın büyük ölçüde geçici olan devre aktivasyonunu ortaya çıkardığını göstermiştir24. Burada, RGC aktivitesinin Ca 2+ sensörü Twitch2b ile görüntülenmesi, lazer taramanın başlangıcının, çoğu RGC'de 5-20 s boyunca taban çizgisine geri dönen Ca2+ yüksekliklerini indüklediğini göstermektedir (Şekil 8). Bu protokoldeki lazer gücünün, in vivo retinal ışık yanıtı8'i bildiren önceki deneyler aralığında olduğu göz önüne alındığında, şu anda açıklanan yöntem, retinadaki devre aktivitesinin kayıtlarına muhtemelen uygundur. Bu tür hususlar, devre aktivitesinden etkilenebilecek deneyler için önemlidir.
Bu protokol, iki tip retinal nöronun, RGC'lerin ve amakrin hücrelerin in vivo görüntülemesini gösterir. Yatay hücreler (Cx57-Cre 25), bipolar hücreler (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), koni fotoreseptörleri (S- veya M-opsin-Cre 28), çubuk fotoreseptörleri (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) ve perisitler (NG2-DsRed9) dahil olmak üzere diğer ana hücre tiplerinin benzer şekilde etiketlenmesi sağlanabilir. Transgenik fareler, RGC'lerin ayrı alt kümelerini etiketlemek için de mevcuttur (örneğin, αRGC'ler30 için KCNG4-Cre; ipRGC'ler için OPN4-Cre31; J-RGC'ler32 için JAM-B-CreER) ve amakrin hücreler (örneğin, starburst amacrine hücreleri26 için ChAT-Cre ve çeşitli amakrin hücre alt tipleri 3,34 için nöropeptid promotör sürücüleri). Viral vektörler, transgenik fareler yerine spesifik hücre popülasyonlarını hedeflemek için kullanılabilir. AAV2'nin her yerde bulunan bir CAG promotör elemanı ile intravitreal enjeksiyonları neredeyse sadece RGC'leri, amakrin hücreleri ve yatay hücreleri25'i etiketler. Modifiye edilmiş AAV2.7m8-Y444F kapsidin mühendislik ürünü bir mGluR6 promotör yapısı ile eşleştirilmesi, ON bipolar hücrelerin35 geniş bir şekilde etiketlenmesini sağlar. AAV'nin subretinal enjeksiyonları, fotoreseptörlerin zenginleşmesine yol açarken, serotip AAV2/5 en yüksek transdüksiyon verimliliğine sahiptir36. Glial fibriler asidik protein promotör elementleri ile eşleştirilen modifiye edilmiş bir AAV6 kapsid proteini olan Shh10, Müller glia37 için spesifik olarak gösterilmiştir.
Merkezi sinir sistemindeki hücreleri tamamen invaziv olmayan bir yaklaşımla gözlemleme yeteneği, hem nöral devrelerintemel özelliklerini 8 hem de nörodejenerasyon mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir 3,4,5,6,38. Birçok kör edici hastalık retinadaki hücresel popülasyonları hedef alır ve farelerde in vivo görüntüleme yaklaşımları optik sinir hasarı 1,3,4, makula dejenerasyonu13, inme5, glokom 2,6 ve üveit 7'yi incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, Alzheimer hastalığı39, multipl skleroz40 ve Parkinson hastalığı41 dahil olmak üzere retinada birçok merkezi sinir sistemi nörodejeneratif durumu ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, retinanın in vivo görüntülenmesi için kolayca erişilebilen bu teknik, geniş bir nörodejeneratif durum kümesini incelemek için bir araç olarak uygulanabilir.

Merkezi sinir sisteminin in vivo görselleştirilmesi genellikle kafatası inceltme ve cam pencerelerin veya optik röle lenslerinin takılması gibi invaziv prosedürler gerektirir. Retina, sinir sisteminde, doğal olarak çevreden ışık aldığı için invaziv preparata gerek kalmadan doğrudan gözlemlenebilen tek yapıdır. Retinaya optik erişim kolaylığı, onu merkezi sinir sistemini incelemek için çekici bir model sistem haline getirir.
Farelerde retinanın canlı floresan görüntülemesi, glokom 1,2, optik sinir hasarı 1,3,4 ve inme 5 modellerinde RGC ölümünü ve ayrıca dejeneratif koşullarda mikroglial aktivasyon 6,7,8 ve vaskülatür 9'daki değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır. İçsel sinyaller ayrıca fotoreseptörleri10,11,12 ve retinal pigment epitel hücrelerini görselleştirmek için de kullanılabilir13. Retinanın in vivo görüntülenmesine yönelik birçok yaklaşım, oftalmolojik amaçlar için özel olarak tasarlanmış son derece uzmanlaşmış cihazlar6 veya kornea ve lensin doğal anormalliklerini düzeltmek için yüksek oranda modifiye edilmiş optik sistemler kullanır 8,9,11,12,13,14.
Mevcut protokol, retinadaki floresan sinyallerinin hücresel çözünürlükte in vivo görüntülenmesine, fare gözünün ön optikleri için kısmen düzeltilmesi için temel bir yöntem kullanan bir yaklaşım göstermektedir. Bu strateji, beynin in vivo görüntülemesi için yaygın olarak kullanılan multifoton mikroskop kurulumlarına çok küçük uyarlamalar gerektirir. Bu yaklaşımın kurulumu basit olduğundan ve fareler çok az stres altında olduğundan, hem akut hem de kronik süreler boyunca hızlandırılmış deneyler yapmak için elverişlidir. Ek olarak, RGC'ler, amakrin hücreler, mikroglia ve vaskülatür dahil olmak üzere bireysel retinal bileşenleri etiketleyen genetik ve organik boya bazlı prosedürler bu görüntüleme tekniğiyle uyumludur ve retina fonksiyonu için kritik olan hücre tiplerinin ve yapılarının in vivo olarak gözlemlenmesini sağlar. Bu araçlar, retinanın glial ve vasküler bileşenlerinin yanı sıra diğer nöronal hücre tiplerinin çoğunu etiketlemek için uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>152440</td>
			<td>Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80950</td>
			<td>22G cemented needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus (AAV2)</td>
			<td>Hope Center Viral Core</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Air Pump</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0132</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Small Animal Anesthesia Device</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R500IE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFP/YFP filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>480/40, 505 long pass, 535/30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromoFlex - Two channel PMT detection unit</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPLG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heating pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>tp-700</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cling film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10713-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Filter Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DH1</td>
			<td>Holds coverslip over mouse eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ controller chassis</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe-1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition device</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2090A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1677409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPGA module with digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI-5734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Evacuation Apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R546W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Severe lubricant eye gel&#160;&#160;</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>(from local pharmacy)</td>
			<td>For use during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/Red filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>535/30, 560 long pass, 605/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>McKesson Medical and Surgical</td>
			<td>190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-101080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Main module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope Scan Path</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MP-100406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperScope X galvo Module</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>MP-100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Fiji software</td>
			<td></td>
			<td>Freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (active scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging)</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R510-31S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32 to M26 adapter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M32M26S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai GUI software</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>R2015b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam (5 mg/mL)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>NDC 0010-6013-01</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micorscope Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>46-404</td>
			<td>Mitutoyo WE715042319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>Flaming/Brown Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bulldog hemostatic clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18053-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature EVA Tubing 0.05&#34; ID, 0.09&#34; OD</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>1883T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse head holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Posts 1/2&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR3-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter kit</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>COO-LED3ULLGs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6126</td>
			<td>For pupil dilator solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels cell amplifier</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>Model 302RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1571001</td>
			<td>For eye immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red &#38; Far Red short pass filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>custom</td>
			<td>560 short pass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating 1/2&#34; post clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage package</td>
			<td>Vidrio Technologies</td>
			<td>Freeware</td>
			<td>Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride solution, sterile (0.9%)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC 63323-186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Benchmate C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment</td>
			<td>Zoetisus</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoRack cooling system</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>ThermoRack 401</td>
			<td>Set to 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>016963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoScope for In Vivo Imaging</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>S-MPVS-1200-00P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment</td>
			<td>Stye</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use after imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine HCl (20 mg/mL)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina

Retina, çevreden gelen ışık sinyallerini beyne yayılan elektrik sinyallerine dönüştürür. Retina hastalıkları yaygındır ve görme bozukluğuna ve körlüğe neden olur. Bu tür hastalıkların nasıl ilerlediğini anlamak, yeni tedavilerin formüle edilmesinde kritik öneme sahiptir. Hayvan hastalık modellerinde in vivo mikroskopi, nörodejenerasyonu anlamak için güçlü bir araçtır ve Alzheimer hastalığından inmeye kadar değişen durumların tedavilerine yönelik önemli ilerlemelere yol açmıştır. Retinanın optik yaklaşımlarla doğal olarak erişilebilen tek merkezi sinir sistemi yapısı olduğu göz önüne alındığında, doğal olarak in vivo görüntülemeye doğru kendini ödünç verir. Bununla birlikte, lens ve korneanın doğal optikleri, etkili görüntüleme erişimi için bazı zorluklar ortaya koymaktadır.
Bu protokol, hücresel kohortların ve fare retinasındaki yapıların hücresel çözünürlükte in vivo iki fotonlu görüntülenmesi için hem akut hem de kronik süreli görüntüleme deneyleri için geçerli olan yöntemleri özetlemektedir. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri, transgenik fareler ve inorganik boyalar dahil olmak üzere bir dizi etiketleme tekniği kullanarak retinal ganglion hücresi (RGC), amakrin hücre, mikroglial ve vasküler görüntüleme örnekleri sunar. Önemli olarak, bu teknikler retinanın tüm hücre tiplerine uzanır ve ilgilenilen diğer hücresel popülasyonlara erişmek için önerilen yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, görüntüleme ve niceleme için manuel görüntü son işleme için örnek stratejiler de ayrıntılandırılmıştır. Bu teknikler sağlık ve hastalıkta retina fonksiyonu çalışmalarına doğrudan uygulanabilir.

Çeşitli transgenik, viral vektör veya inorganik boya etiketleme yaklaşımları, temel bir çoklu foton mikroskobunun basit bir adaptasyonunu kullanarak çeşitli retinal hücre tiplerini ve yapılarını in vivo olarak görselleştirmek için kullanılabilir. RGC'leri ve amakrin hücreleri görselleştirmek için, sırasıyla VGlut2-Cre ve VGat-Cre transgenik farelerine, camgöbeği ve sarı floresan proteinleri (sırasıyla CFP ve YFP) içeren sitoplazmik floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir Ca2+ sensörü olan Twitch2b'yi kodlayan Cre'ye bağımlı bir AAV ekspresyon yapısının intravitreal enjeksiyonu verildi ve troponin15'in Ca2 + bağlanma alanı . VGlut2-Cre farelerde, RGC somalar açıkça ayırt edilebilir ve aksonların fasikülleri sıklıkla belirgindir (Şekil 3).
Aksonların yörüngesinin ve vaskülatürün negatif görüntüsünün, kronik görüntüleme deneylerinde bir dönüm noktası olarak yararlı olan VGlut2-Cre farelerinde optik sinir kafasını tanımlamayı çok kolay hale getirdiği belirtilmelidir (Şekil 3). Her ne kadar amakrin hücreler RGC'lerden daha az parlak görünse de, muhtemelen daha küçük soma boyutları ve / veya daha az verimli AAV transdüksiyonları nedeniyle, somaları hala iç nükleer tabakada kolayca görülebilir. RGC'lerin aksine, amakrin hücreli nöritler iç pleksiform tabakalarda daha sık görülür (Şekil 4). Retinal mikroglia, Cx3cr1-GFP transgenik fare hattı6'da görüntülenebilir. Mikroglia, vaskülatür ile ilişkilidir ve hızlandırılmış görüntüleme deneylerinde aynı bölgeyi bulmayı mümkün kılar.
Bu yaklaşım, ince mikroglia süreçlerinin dinamiklerini, tek düzlemli görüntülerde daha iyi uzamsal çözünürlüğe sahip bir prosedürü veya bireysel hücrelere odaklanarak maksimum yoğunluklu projeksiyonların hazırlanıp hazırlanmadığını izlemek için kullanılabilir (Şekil 5). Fare merceğindeki optik sapmanın neden olduğu zayıf eksenel çözünürlük, z boyutundaki ince ayrıntıların incelenmesini engeller. Bu görüntüleme tekniğinin hücresel ultrayapıdaki dejeneratif değişiklikleri gözlemleyip gözlemleyemeyeceğini belirlemek için, eksitotoksik lezyonu indüklemek için vitreusa 1 μL 50 mM N-metil-D-aspartat (NMDA) enjekte edildi. Enjeksiyondan bir gün sonra, mikroglia önceki raporlara göre kısa süreçler veya amip morfolojisi gösterdi (Şekil 5)16. Cx3cr1-GFP transgenik hattındaki hücrelerin, hücresel kohort boyunca, floresan protein ekspresyon kasetlerinin AAV aracılı dağıtımı ile yapılan deneylerden daha düzgün ve eksiksiz floresan protein ekspresyonu sergilediği belirtilmelidir. Deneyler tasarlanırken çeşitli ve seyrek ile tam ve tekdüze etiketlemenin faydaları göz önünde bulundurulmalıdır.
Retinal vaskülatürü dahaönce tarif edildiği gibi 8 olarak etiketlemek için, farelere görüntülemeden 30-60 dakika önce 200 μL Evans mavi boya (steril salinde 20 mg / mL) ile intraperitoneal olarak enjekte edildi. Bu, optik sinir kafasından çıkan kan damarlarının güçlü bir şekilde etiketlenmesine yol açtı (Şekil 6). Şaşırtıcı bir şekilde, tek bir enjeksiyonun floresan sinyali en az yedi gün boyunca devam etti. İn vivo görüntülerin boyutlarını tahmin etmek için iki farklı yöntem kullanıldı. İlk olarak, aynı retinal bölgeler konfokal mikroskopi kullanılarak düzleştirilmiş retinal bütünlüklerde in vivo ve fiksasyondan sonra görüntülendi (Şekil 7). Dört farklı in vivo örnekten rastgele hücre çiftleri seçildi ve hücre çiftleri arasındaki gerçek mesafe konfokal taramalarda ölçüldü ve 1x dijital büyütme ile ortalama 0.99 μm'lik bir piksel boyutu elde etmek için in vivo piksel mesafesi ile eşleştirildi. İn vivo görüntüleri konfokal bütünmonte taramalarla ilişkilendiren benzer yöntemlerin kullanılması, tek bir kafa pozisyonunun kabaca 650mm2'lik bir retina yaması üzerinde görüntülemeye izin verdiğini ortaya koymuştur.
Kafa tutucunun bir burulma ekseni boyunca yeniden konumlandırılması, retinanın 2,2 mm uzunluğundaki doğrusal bir bölgesine erişime izin verebilir (gösterilmemiştir). Ayrıca, farelerin gözlerine 1 veya 2 μm çapında floresan mikrosferler enjekte edildi ve çapları, 10x dijital yakınlaştırma ile in vivo görüntülerden tam genişlikte yarım maksimum çizgi taraması olarak ölçüldü. Bu, biraz daha büyük bir piksel boyutu tahmini verdi, ancak daha fazla varyans ile (Şekil 7). Genel olarak, in vivo deneylerin tamamlanmasından sonra tüm numunelerin konfokal görüntülemesi, kornea ve lens özelliklerindeki varyans, numuneden numuneye görüntü ölçeğini değiştirebileceğinden, bireysel görüntülere ölçek atamak için en tutarlı yöntemdir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg"> Şekil 1: Işık yolu şeması. Bu protokolde kullanılan iki fotonlu mikroskobun temel bileşenleri, lazer gücünü modüle etmek için bir Pockels Hücresi, mikroskop hedefinin arka açıklığına uyacak şekilde lazer ışını çapını azaltmak için bir lens çifti ve ışın yönlendirme için bir çift galvo tarama aynasından oluşur. Her ana optik bileşenden önce bir çift direksiyon aynası bulunur. Odak, objektif montajı yönlendiren bir motor tarafından kontrol edilir. Emisyon ışık yolu, dikroik ve bariyer filtreleri değiştirilerek farklı floroforlar için özelleştirilebilir. Camgöbeği/sarı/kırmızı görüntüleme için genel bir kurulum, kısa geçişli dikroik aynanın kırmızı ışığı ilk PMT'ye yönlendirdiği ve camgöbeği ve sarı emisyonları ayırmak için uygun bant geçiş filtreleriyle eşleştirilmiş uzun geçişli dikroik aynanın kullanıldığı bir kurulum görüntülenir. Kısaltma: PMT = fotoçarpan tüpü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg"> Resim 2: Fareleri in vivo görüntüleme için konumlandırma. Fareyi göz bebeği ile ışık yolu ile eksen üzerinde konumlandırmak için, anestezi uygulanan fare önce bir kafa tutucusunda tutulur, kafa döndürülür ve açılı, göze büyük bir damla yağlayıcı göz jeli yerleştirilir ve fare sahneye yerleştirilir. Işık yoluna dik olan kapak fişi tutucusuna bir kapak kayması monte edilir ve göze doğru indirilir. Örtü kayması, kornea veya fare kafasına (solda) temas etmemelidir, bu da örtü kayması saptırılırsa belirgin olacaktır. Bununla birlikte, kapak kayması, damlacıktan feragat etmesini önlemek için yeterince yakın olmalıdır (sağda), çünkü bunun numune üzerinde büyütücü bir etkisi olacaktır. Jel daldırma uygulandıktan ve kapak kayması sabitlendikten sonra, aşama doğrudan mikroskop hedefinin altında yerinde hareket ettirilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg"> Şekil 3: Retinal ganglion hücrelerinin görüntülenmesi. Görüntü görüntüleme için, ilgilenilen hücreleri içeren z-düzlemleri ile maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturulur ve sonuçta ortaya çıkan görüntüler PMT çekim gürültüsünü gidermek için medyan filtrelenir. AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b'nin VGlut2-Cre transgenik farelere, özellikle CFP sinyaline enjekte edilmesiyle etiketlenen retinal ganglion hücrelerinin iki örneği gösterilmiştir. Görüntüler dört gün arayla yapılan seanslarda elde edildi ve optik sinir başının yakınındaki aynı bölgeye dönmek için vasküler işaretler kullanıldı. Optik sinir kafası görüntünün altına doğru yönlendirilir. Her iki örnek de oryantasyonda bir miktar farklılık gösterse de (yoğunluğu azalmış bölgeler oklarla gösterilir), çoğu hücre her iki zaman noktasında da bulunur. Ölçek çubuğu = yaklaşık 50 μm. Kısaltmalar: PMT = fotoçarpan tüpü; AAV = adeno ilişkili virüs; EF1α = uzama faktörü-1alfa; FLEX = flip-eksizyon; VGlut2 = veziküler glutamat taşıyıcı 2; CFP = camgöbeği floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg"> Şekil 4: Amakrin hücrelerin görüntülenmesi. Amakrin hücreleri, VGat-Cre transgenik farelere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b enjekte edilerek etiketlendi. Twitch 2b'nin CFP sinyali özellikle gösterilmiştir. İç nükleer tabakanın derinliklerine odaklanan küçük maksimum yoğunluklu projeksiyonlar amakrin hücre somalarını gösterirken, iç pleksiforma odaklanmak amakrin hücre nöritlerini (ok) çözer. Optik sinir başı görüntünün sağına doğru yönlendirilir. Ölçek çubuğu = yaklaşık 50 μm. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; EF1α = uzama faktörü-1alfa; FLEX = flip-eksizyon; VGat = veziküler gama aminobütirik asit taşıyıcısı; CFP = camgöbeği floresan proteini; INL = iç nükleer tabaka; IPL = iç pleksiform tabaka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg"> Şekil 5: Görüntüleme mikrogliası. Transgenik fare hattı Cx3cr1-GFP, mikrogliayı etiketlemek için kullanıldı. Tam tarama hacminin maksimum yoğunluklu bir projeksiyonu, bazıları çözülebilecek ince proses ayrıntılarına sahip birçok mikroglia gösterir. Alanın sol alt köşesindeki hücrelerin, bu bölgedeki paralaks nedeniyle maksimum projeksiyonda sağ üste doğru olanlardan daha az bozulmaya sahip olduğunu unutmayın. Sadece ilgilenilen hücreyi içeren maksimum yoğunluklu projeksiyonlar bu paralaksı önemli ölçüde azaltır (merkez, karşılık gelen renklerde kutulu). Ayrıca, bu görüntüleme stratejisi ince mikroglia sürecinin yeniden şekillendirilmesinin dinamiklerini (alt paneller) belgeleyebilir. Karşılaştırmalı olarak, birçok mikroglia, eksitotoksik bir lezyondan bir gün sonra, 50 mM NMDA intravitreal enjeksiyonu ile kısa süreçler veya amip morfolojisi ile görülebilir (sağda). Ölçek çubuğu = yaklaşık 50 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; Cx3cr1 = Cx3 kemokin reseptörü 1; NMDA = N-metil-D-aspartat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg"> Şekil 6: Vasküler yer işaretlerini etiketleme. Farelere, ilk görüntüleme seansından 30-60 dakika önce intraperitoneal olarak 200 μL 20 mg / mL Evans mavisi enjekte edildi. Tam kalınlıktaki maksimum yoğunluklu projeksiyonlar, retina vaskülatüründe en az yedi gün boyunca devam eden kalıcı floresan gösterir. Ölçek çubuğu = yaklaşık 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg"> Şekil 7: Görüntü boyutları. VGlut2-Cre transgenik farelere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b enjekte edilerek etiketlenen retinal ganglion hücreleri in vivo olarak görüntülendi ve aynı bölge daha sonra fiksasyon ve retinanın tamamen hazırlanmasından sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülendi. Her ikisi için de sarı floresan protein kanalı gösterilmiştir. Renkli ok çiftleri her iki preparatta da aynı hücreyi gösterir (üst paneller). 2 μm çapında floresan mikrosferlerin tek düzlemli görüntüsü intravitreal olarak enjekte edildi ve in vivo olarak görüntülendi (sol alt panel). Mikrosferler yerleşmedi ve bu nedenle eksenel çözünürlüğün ölçülmesini imkansız kılan sürekli hareket halindeydi. Piksel boyutları, in vivo floresan mikrosferlerin tam genişlikte yarı maksimum ölçümlerinden veya grup başına 2-4 retinadan alınan korelasyonel konfokal ölçümlerden (sağ altta) hesaplanmıştır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; EF1α = uzama faktörü-1alfa; FLEX = flip-eksizyon; VGlut2 = veziküler glutamat taşıyıcı 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg"> Şekil 8: İki foton taraması ile indüklenen kalsiyum aktivitesi. VGlut2-Cre transgenik farelere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b enjekte edilerek etiketlenen retinal ganglion hücreleri, YFP, 4.22 Hz'de bir zaman serisi olarak tek bir düzlemde görüntülenen sahte renkli macenta ve CFP yeşilidir. Tüm RGC'ler benzer bir başlangıç YFP / CFP oranına sahipti. Çoğu FRET oranında bir artışla yanıt verdi (turuncu hücre hariç) ve biri zaman serisi boyunca (sarı hücre) yüksek bir YFP / CFP oranını korudu. YFP/CFP oranları ilk kare ortalamasına normalleştirildi ve renkli daireler renkli izlerle eşleşti. Yıldız işaretleri, solda görüntülenen temsili resimlerle zaman noktalarını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; EF1α = uzama faktörü-1alfa; FLEX = flip-eksizyon; VGlut2 = veziküler glutamat taşıyıcı 2; YFP = sarı floresan protein; CFP = camgöbeği floresan proteini; RGC'ler = retinal ganglion hücreleri; FRET = floresan rezonans enerji transferi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina at JoVE.com

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Retina hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için kullanılan bu yöntem, oftalmolojik hastalıkların araştırılmasına ve retinanın normal fonksiyonlarının anlaşılmasına olanak sağlar. Bu yöntem, iki foton mikroskopisi ile retinanın in vivo görüntülenmesine basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Fareyi düzgün bir şekilde stabilize etmek, in vivo görüntülerde kaliteli görüntüler elde etmenin anahtarıdır.Fareyi baş tutucuya yerleştirme alıştırması yapın ve görüntü almaya çalışmadan önce prosedürle rahat olun. Onaylanmış hayvan kullanım protokolüne göre hayvanı sakinleştirin. Öğrenci dilatasyon çözeltisi uygulayın ve öğrencilerin genişlemesine izin vermek için fareyi beş dakika karanlıkta bırakın.Alt kulak kanalı pimini içe doğru uzatılmış pozisyonda ve üst kulak kanalı pimini çekilmiş pozisyonda sabitleyin. Kulaklık çubuğu yataydan aşağıya 60 derecelik bir açıyla eğilene kadar kafa tutucunun ana kolunu döndürün. Fare ısırık çubuğuna bakarken, bir kulağınızı, pimi kulak kanalına takılı olacak şekilde genişletilmiş alt pime monte edin.Üst kulak kanalı pimini sabitleyen vidayı gevşettikten sonra, pimi diğer kulak kanalına uzatın ve kafayı sabitlemek için vidayı yeniden sıkın. Farenin baş tutucusunda güvenli olduğundan emin olun. Başın üstüne bastırın.Fare kulak çubuklarında güvenli bir şekilde kalmalı ve başı kulak kanallarının ekseni etrafında serbestçe dönmelidir. Isırma çubuğu farenin başına doğru konumlandırıldığında, maksiller kesici dişlerin ısırık çubuğu tutucusuna indirilmesine izin vermek için farenin başını yavaşça kaldırın ve kafayı sabitlemek için ısırık çubuğunu yumuşak bir kuvvetle geri çekin. Isırık çubuğunu yerine sabitlemek için vidayı kullanın ve fareyi ve tutucuyu mikroskop aşamasına yerleştirin.Farenin her iki gözüne de kayganlaştırıcı göz damlaları uygulayın. Bir gözün göz bebeği ışık yoluna göre yönlendirilene kadar kafa tutucunun ana kolunu döndürün ve kompakt filtre tutucusuna 1,5 numaralı bir kapak kayışı yerleştirin. Tutucuyu mikroskop aşamasına sabitledikten sonra, örtü kapağını korneaya dokunmadan yağlayıcı göz jeline temas edene kadar indirin ve geniş alan uyarma ışığı korneayı tamamen kaplayana kadar sahneyi X-Y boyutunda ve objektif Z konumunda ayarlayın.Retinadaki floresan hücreler veya yapılar odaklanana kadar Z-pozisyonunu ayarlamaya devam etmek için göz merceğini kullanın ve ilgilenilen tek tek hücreleri veya yapıları çözmek için gerektiğinde epifloresan aydınlatıcıyı artırın. Retinanın görüntüleme ışığı yolu ile hizalanmasına ince ayar yapın. Odak düzlemini değiştirirken odak dışı ışıkta yalnızca genişleme veya büzülme meydana gelene kadar kafa açısını ayarlayın ve X-Y bozulmalarını en aza indirin.Ardından, epifloresan aydınlatıcıyı kapatın ve aydınlatıcı deklanşörünü kapatın. İki fotonlu görüntüleme için, tüm kurumsal lazer güvenlik protokollerini izleyin. Tüm ortam ışığını kapatıp örtün ve uyarma ışığı yolunu lazere ve emisyon ışığı yolunu PMT'lere çevirin.Görüntü alma yazılımında, kare boyutunu 512 x 512 ve kare ortalamasını üç olarak ayarlayın. Z-adımını yığının tepesinden başlayacak ve aşağıya doğru ilerleyecek şekilde ayarlayın, böylece fotoreseptörlerin iki fotonlu lazer aktivasyonunu en aza indirin. PMT'leri açıp etkinleştirin ve voltajı 680 volta ayarlayın.Görüntüleme ve emisyon panjurlarını etkinleştirin. Hedef dokunun %1 lazer gücünden başlayarak canlı görüntü önizlemesine başlayın ve ilgilenilen hücreleri veya yapıları görselleştirmek için ekran parlaklığını otomatik olarak ayarlayın. Hedef doku loş veya belirsizse, yapılar 45 miliwatt'ı geçmeden görünür hale gelene kadar lazer güç yüzdesini artırın.İstenilen bir görüntüleme alanını ortalamak için mikroskop aşamasını X-Y yönünde manevra yapın ve odakta ilgilenilen yapılarla Z-düzlemine gidin. Kronik bir hızlandırılmış deney için, daha önce elde edilmiş bir görüntüyü, geçerli görüntüdeki görüntüleme açısının önceki görüntülerinkine benzer olmasına dikkat ederek, ilgili hücreler için referans olarak kullanmak üzere açın. Ardından, görüntüleme yığınının Z sınırlarını ayarlamak ve görüntüyü almak için ilgilendiğiniz en üstteki ve en alttaki Z düzlemlerine gidin.Tüm görüntüler elde edildiğinde, PMT'leri ve lazer deklanşörü devre dışı bırakın. Uyarma ışığı yolunu epifloresan aydınlatmaya ve emisyon ışığı yolunu göz merceğine geri döndürün. Ardından, görüntü alma yazılımından çıkın, bilgisayar arabirimindeki lazeri kapatın ve her zaman açık olan donanım dışında donanımı ters başlatma sırasına göre kapatın.Analizin sonunda, fareyi baş tutucudan çıkarın ve göz jelini nazikçe çıkarmak için tüy bırakmayan bir doku kullanın. Daha sonra, her iki göze de kayganlaştırıcı göz merhemi uygulayın ve fareyi, fareyi muhafazasına geri döndürmeden önce, tam yaslanıncaya kadar izleyen, 37 santigrat derece ılık su sirkülasyonlu bir ısıtma yastığına yerleştirin. VGlut-2-Cre farelerde, retinal ganglion hücreli somalar açıkça fark edilebilir ve akson fasikülleri sıklıkla belirgindir.Aksonların yörüngesi ve vaskülatürün negatif görüntüsü, VGlut-2-Cre farelerde optik sinir başının tanımlanmasını kolaylaştırır ve bu da kronik görüntüleme deneylerinde bir dönüm noktası olarak yararlıdır. Retinal ganglion hücrelerinin aksine, amakrin hücre nöritleri iç pleksiform tabakalarda daha sık görülür. Göz içi NMDA enjeksiyonundan bir gün sonra, retinal mikroglia önceki raporlara göre kısa süreçler veya amip morfolojisi gösterir.Evans mavi boyasının, görüntülemeden 30 ila 60 dakika önce tek bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilmesi, optik sinir kafasından çıkan ve en az yedi gün boyunca devam eden kan damarlarının güçlü bir şekilde etiketlenmesine neden olur. Fiksasyondan sonra, düzleştirilmiş retinal bütün montajlardaki hücre çiftleri arasındaki gerçek mesafe, konfokal taramalarda ölçülebilir ve in vivo görüntülerin ortalama piksel boyutunu belirlemek için in vivo piksel mesafeleriyle eşleştirilebilir. Farelerin gözlerine enjekte edilen floresan mikrosferler, mikrosfer çapının in vivo olarak ölçülmesine izin verir, bu da biraz daha büyük bir piksel boyutu tahmini verir, ancak daha fazla varyans ile.İn vivo görüntüleme, immün boyama ve in situ hibridizasyon gibi histolojik analizlerle eşleştirilebilir. Bu yöntemler spesifik hücre tiplerini tanımlayabilir ve görüntülenen hücrelerin gen ekspresyonunu inceleyebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...