Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

الكتاب الاعتراف المصدر السويسري الخفيفة (Villigen، سويسرا) لتخصيص beamtime للمشروع على شعاع X10SA (PXII) وX06DA (PXIII)، الكسندرا بلوم لمساهمتها في صقل الهيكل، كلاريسا Worsdale لتسجيل الصوت وفرانسوا شنل (جامعة ستراسبورغ) لمساعدته في تحرير الفيديو وSFX. وقد دعم هذا العمل المركز الوطني الفرنسي للبحوث العلمية، جامعة ستراسبورغ، كونسورتيوم LabEx "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA)، وهو تمويل دكتوراه لR.dW من مبادرة التميز (IdEx) من جامعة ستراسبورغ في إطار البرنامج الوطني الفرنسي "Investissements d'Avenir"، وهو تمويل للدكتوراه إلى K.R. من الجامعة الفرنسية الألمانية (UFA-DFH، منح لا. CT-30-19)، دويتشه هيرشونغجسجيمينشافت (المنحة رقم Mo 634/10-1). استفاد المؤلفون من برنامج التعاون PROCOPE Hubert Curien (وزارة الشؤون الخارجية الفرنسية ودويتشر أكاديمير أوستاوشدينست).

1. إعداد تبلور المقايسات في ChipX
ملاحظة: يمكن الحصول على جهاز ChipX microfluidic من المؤلفين. يتم إعطاء وصف للرقاقة في الشكل 1. الحلول التي تحتوي على البلورة (أو عامل التبلور) المستخدمة في تحريك التبلور قد تكون ذات منشأ تجاري أو من إعداد المجرب.
<ol><li>تحميل عينة الجزيئات الحيوية ملاحظة: حجم العينة المطلوبة بالفعل لإجراء فحص مضادة للنشر الفردية في المقطع المستقيم لكل قناة من ChipX هو 300 nL. ولكن من أجل الراحة نقترح تحميل 5 ميكرولتر لملء تماما القنوات الثمانية مع الأخذ في الاعتبار طول متغير من قسم المنحني والأحجام مدخل الميت.<ol>
<li>Pipet 5 ميكرولتر من حلول الإنزيم باستخدام 10 ميكرولتر الأنابيب القياسية وتلميح.</li>
		<li>تقديم تلميح عموديا في مدخل العينة وحقن الحل حتى تمتلئ القنوات الثماني حتى نهاية عكسها (دخول خزان crystallant).</li>
		<li>حقن 1 ميكرولتر من زيت البارافين في مدخل العينة من أجل فصل القنوات عن بعضها البعض.</li>
		<li>استعادة حل إضافي في خزان crystallant في أقصى كل قناة باستخدام أنبوب 10 ميكرولتر القياسية.</li>
		<li>ختم مدخل العينة مع قطعة 1 سم × 1 سم من الشريط.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحميل حلول التبلور<ol>
<li>Pipet 5 ميكرولتر من محلول التبلور باستخدام 10 ميكرولتر الأنابيب القياسية وتلميح. يبلغ حجم الخزان 10 ميكرولتر، ولكن تحميل نصفه فقط يتجنب تجاوز التجاوز عند الختم بشريط ويسهل إضافة المزيد من ليغاند لإجراء تجارب النقع. إذا تم الحصول على ظروف التبلور الأولية عن طريق نشر البخار ، وزيادة تركيز crystallant بمعامل 1.5 - 2. حلول يمكن أن تكون مختلفة في كل خزان (في القضية المعروضة، 1 M ديامونيوم الهيدروجين الفوسفات، 100 mM خلات الصوديوم، تم استخدام 4.5 pH في جميع أنحاء).</li>
		<li>توجيه تلميح الأنابيب نحو دخول القناة في قمع شكل جزء من الخزان لتجنب تشكيل فقاعة الهواء عند ترسب الحل. هو منع الاتصال بين الاثنان حل وانتشار في القناة.</li>
		<li>حقن حل crystallant في الخزان.</li>
		<li>ختم الخزانات مع 2.5 سم × 1 سم قطعة من الشريط.</li>
		<li>احتضان رقاقة في 20 درجة مئوية (يمكن تعديل درجة الحرارة تبعا للهدف، وعادة بين 4 و 37 درجة مئوية 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. وضع العلامات البروتين مع كاربوإكسيرهودامين للكشف عن الفلوريسنس
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. يجب أن يتم ذلك قبل تحميل العينة لتسهيل الكشف عن البلورات في رقاقة باستخدام الفلوريسنس. وقد وصفت طريقة مفصلة من الملصقات الفلورية تتبع بوسي وزملاء العمل7. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
<ol><li>حل 5 ملغ من مسحوق استر كاربوإكسيرهودامين في 1 مل لامائية- ديتيل-فورنامميد، وتقسيم الحل في 0.6 ميكرولتر aliquots ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد 1 M Na-borate حُكم 8.75 الأسهم الحل.</li>
	<li>تخفيف المخزون لإعداد العازلة رد فعل في 0.05 M نا بورات درجة حُك 8.75.</li>
	<li>شطف عمود إزالة التشبع (7 كيلو ادا MWCO، 0.5 مل) مع 800 ميكرولتر من العازلة رد فعل.</li>
	<li>الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1400 س ز، وإزالة filtrate.</li>
	<li>كرر هذه العملية مرتين (الخطوات 2.4-2.5) لغسل العمود.</li>
	<li>إيداع 80 ميكرولتر من البروتين في المخزن المؤقت على العمود (يمكن تخفيف البروتين وصولا الى 1 ملغ / مل لزيادة حجم إذا لزم الأمر).</li>
	<li>جهاز طرد مركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1400 x ز. تهدف هذه الخطوة إلى نقل البروتين من المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت للتفاعل.</li>
	<li>استعادة تدفق من خلال (التي تحتوي على البروتين في العازلة رد فعل) ومزجها مع 0.6 ميكرولتر من حل كاربوإكسيرودامين.</li>
	<li>احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>وفي الوقت نفسه، شطف العمود 3 x مع المخزن العازلة، والطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1400 × ز وتجاهل الترشيح.</li>
	<li>إيداع حل رد الفعل على العمود.</li>
	<li>الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 1400 س ز واستعادة تدفق من خلال (أي، حل من البروتين المسمى في المخزن المؤقت لها).</li>
	<li>تكملة محلول البروتين الأسهم مع 0.1-1 ٪ (ث / ث) من البروتين المسمى.</li>
	<li>إعداد تبلور ChipX مقايسات كما هو موضح في القسم 1.</li>
	<li>تحقق من وجود بلورات البروتين في المقايسات عن طريق مثيرة التحقيق الفلورسنت مع مصدر ضوء الطول الموجي 520 نانومتر.</li>
</ol>3- مراقبة الكريستال
ملاحظة: يمكن معالجة جهاز ChipX دون عناية خاصة، حتى مع وجود بلورات في الداخل، إلا إذا كانت درجة الحرارة تحتاج إلى التحكم فيها.
<ol><li>استخدم أي منظار مجسم للتأكد من نتائج مقايسات التبلور في ChipX. بصمة لها أبعاد قياسية من شرائح المجهر ومتوافقة مع أي نظام وحامل الشريحة.</li>
	<li>تحقق من محتوى القنوات الدقيقة التي تبدأ من الخزان حيث تركيز crystallant هو الأعلى إلى مدخل العينة حيث التركيز crystallant هو أدنى. المادة ChipX شفافة للضوء المرئي، متوافق مع استخدام المستقطبات، وكذلك مع الإضاءة للأشعة فوق البنفسجية لتحديد الكريستال البروتين من قبل الفلورس8التربتوفان الجوهرية .</li>
	<li>تسجيل مواقع الكريستال باستخدام التسميات تنقش على طول القنوات أو وضع علامة مواقع الكريستال مع علامة دائمة عن طريق رسم نقاط اللون بجانبها على سطح رقاقة.</li>
</ol>4. كريستال نقع مع يغاندس
ملاحظة: هذا الإجراء اختياري. يتم استخدامه لإدخال الركائز، ركائز انزيم أو ذرات ثقيلة في بلورات وينبغي أن تنفذ على الأقل 24-48 ساعة قبل تحليل الأشعة السينية للسماح لانتشار المركب على طول القنوات وإلى البلورات.
<ol><li>قم بإزالة شريط الختم بلطف من الخزانات.</li>
	<li>إضافة ما يصل إلى 5 ميكرولتر من حل ليجوند في واحد أو عدة خزانات باستخدام 10 ميكروبيت ميكروبيت μl (في المثال، 3 ميكرولتر من 10 mM cytidine-5'-[(α,β)-ميثيلينو] تم إضافة حل ثلاثي الفوسفات (CMPcPP) لتحقيق تركيز نهائي من 3.75 mM). CMPcPP هو التناظرية غير المائية من CTP، الركيزة الطبيعية للانزيم.</li>
	<li>ختم الخزانات مع 2.5 سم × 1 سم قطعة من الشريط.</li>
	<li>احتضان رقاقة تحت درجة حرارة تسيطر عليها لمدة 24-48 ساعة للسماح نشر ليغاند على طول قنوات الشريحة.</li>
</ol>5. الكريستال التحليل عن طريق البلورات التسلسلي
ملاحظة: يجب أن يتم تكييف هذا الجزء من البروتوكول بناءً على إعداد خط الشعاع وخصائص الانعراج للبلورات. ولا تعطى سوى مؤشرات عامة للتحليل البلوري استنادا إلى التجارب التي أجريت في خط شعاع X06DA (SLS، Villigen، سويسرا).
<ol><li>ChipX تصاعد على goniometer خط شعاع ملاحظة: يتم توفير الملف للطباعة ثلاثية الأبعاد حامل ChipX في المرجع4.<ol>
<li>إيقاف تشغيل طائرة التبريد من خط شعاع. يتم إجراء التحليل هنا في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>جبل ChipX على حامل مخصص مع قناة تحتوي على بلورات ليتم تحليلها في مركز الحامل. لا يتطلب حامل ChipX4 أي برغي أو جزء إضافي ، لأنه تم تصميمه لتوفير تناسب مثالي لـ ChipX.</li>
		<li>إرفاق حامل إلى goniometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جمع البيانات<ol>
<li>توجيه طبقة سميكة (الطبقة العليا، الشكل 1)من ChipX (في هذه التسميات التوجه على طول القنوات هي مباشرة للقراءة باستخدام الكاميرا توسيط من شعاع)، نحو شعاع المباشر والوجه أنحف وراء الكريستال لتقليل التوهين من إشارة diffracted كما هو موضح في المرجع3.</li>
		<li>لتجنب اصطدام ChipX مع المواد المحيطة (شعاع، coll)، تقييد حركات الغدد الغدد الغدد العصبية في نطاق ±30 درجة (0° المقابلة للقنوات يجري عمودي على شعاع الأشعة السينية).</li>
		<li>العثور على بلورات الموقف مع مساعدة من التسميات تنقش على طول القنوات.</li>
		<li>حدد موضع الكريستال.</li>
		<li>مركز الكريستال إما عن طريق معيار الشبكة جرعة منخفضة / فحص النقطية أو إجراء بنقرة واحدة (الفيديو يظهر مثالا على فحص الشبكة).</li>
		<li>جمع بيانات الحيود داخل نطاق -30 ° / +30 درجة.</li>
		<li>إعادة تشغيل الإجراء في الخطوات 5.2.4-5.2.6 على بلورة أخرى في نفس القناة بعد ترجمة الشريحة.</li>
		<li>يدوياً إعادة تنظيم قناة ChipX أخرى في مركز حاملها والاستمرار في جمع البيانات على بلورات موجودة في هذه القناة.</li>
		<li>استخدام حزم البلورية القياسية والإجراءات لمعالجة ودمج البيانات، ثم حل وتحسين الهيكل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization.">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization.">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li><li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification.">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li><li>Betat, H., Rammelt, C., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+nucleotidyltransferases:+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization.">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li><li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

البروتوكولات الحالية في البلورات الحيوية تنطوي على إعداد البلورات باستخدام أساليب مثل نشر بخار أو دفعة13،14، ونقلها إلى microloop لتبريد15،16 قبل إجراء تحليل الحيود في طائرة النيتروجين في ظروف التبريد. في المقابل، لا يمكن تبريد الكريستال المباشر في ChipX3 ولا يمكن استخراج البلورات من قناتها microfluidic، والتي يمكن رؤيتها على أنها قيود على هذا الإعداد. ومع ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في المقالة يوفر خط أنابيب متكامل تماما لتحديد الهياكل الكريستالية في درجة حرارة الغرفة (أي في ظروف أكثر فسيولوجية). على الرغم من أن جمع البيانات في درجة حرارة الغرفة يسبب زيادة في الأضرار الإشعاعية19، فإن هذا التأثير يقابله وقت الحصول السريع على البيانات (يتم جمع دوران 60 درجة كحد أقصى على كل بلورة) وعن طريق دمج العديد من مجموعات البيانات الجزئية. تم تحسين كل من ChipX تصميم والمادية للحد من خلفية التشتت وإشارة الانعراج التوهين3، ويمكن إجراء جمع البيانات على بلورات مع أبعاد تعادل نصف حجم القنوات (40 μm)4.
لتلخيص، المزايا الرئيسية للبروتوكول هي التالية. يتم إنتاج البلورات في بيئة خالية من الحمل الحراري (قنوات microfluidic) ، وهو أمر موات للغاية لنمو بلورات عالية الجودة. طريقة الانتشار المضاد التي تنفذ في ChipX فعالة جدا في فحص المشهد الفائق التشبع؛ انتشار البلورات في قناة رقاقة يخلق تركيز وموجة التشبع الفائق التي تساعد على تحديد النوي المناسب وظروف النمو5. يتم التعامل مع بلورات أبدا مباشرة، ولكن يتم تحليلها في الموقع، داخل رقاقة، والتي تحافظ على خصائصها الحيود الحقيقي (أي، لا يغير الفسيفساء الكريستال عن طريق التفاعل المادي أو cryocooling)20. ويتم تحليل الحيود على سلسلة من البلورات الموزعة على طول قنوات الشريحة مع التعرض لجرعات منخفضة لتقليل الأضرار الإشعاعية، ويتم تجميع مجموعة بيانات كاملة عن طريق دمج البيانات الجزئية من السلسلة. إن البصمة القياسية والتصميم البسيط لـ ChipX سيسمحان في المستقبل بأتمتة كاملة لجمع البيانات في الموقع باستخدام مرافق السنكروترون أو XFEL. يتم تنفيذ كافة خطوات البروتوكول في ChipX. من وجهة نظر المجرب ، إعداد رقاقة بسيطة وسهلة لتنفيذ مع pipets القياسية ولا يتطلب أي معدات إضافية. إن اتصال القناة الشبيه بالشجرة عند مدخل العينة يقلل من حجم التخزين الميت في النظام، وهو أمر مهم عند العمل مع عينات يصعب تنقيةها أو التي لا تتوفر إلا بكمية محدودة.
في الختام، فإن نهج مختبر على رقاقة تنفيذها في ChipX يبسط و تصغير بكفاءة عملية التبلور عن طريق مكافحة الانتشار وتحديد بنية الكريستال، مما يسمح للانتقال من العينة إلى هيكلها 3D في جهاز واحد. وهو قابل للتطبيق على نطاق واسع ويقدم حلا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لتحقيقات الروتيني للتحريات الروتينية للبلورات الحيوية في درجة حرارة الغرفة.

البلورات هو وسيلة لفك العمارة 3D من الجزيئات الحيوية البيولوجية. هذا الأخير مهم لفهم كيفية اختيار الانزيم ومعالجته ركائزه. يتطلب تحديد بنية بلورية تبلور الجزيئات المستهدفة وتكييف البلورات لتحليلها بواسطة الحيود بالأشعة السينية1. كل من إعداد البلورات والتعامل معها هي خطوات حاسمة ولكن حساسة التي يمكن أن تؤثر على خصائص الجودة والنقود الكريستال، وبالتالي، دقة (أي دقة) من هيكل 3D الناتجة. لتسهيل إعداد بلورات عالية الجودة والقضاء على التعامل غير الضروري للحفاظ على خصائصها الحيود ، قمنا بتصميم جهاز microfluidic سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات يسمى ChipX2،3،4.
في هذه المقالة، سوف نبين كيفية تحميل محلول البروتين في قنوات ChipX باستخدام المواد المختبرية التقليدية لإعداد البلورات عن طريق مكافحة الانتشار. يوفر أسلوب التبلور هذا فحصًا فعالًا للتشبع الزائد وظروف النوى المحتملة على طول القنوات الدقيقة التي تحتوي على محلول الإنزيم بسبب تدرج التركيز الناتج عن انتشار عامل التبلور5،6.
إعداد رقاقة بسيطة، ويستخدم الأنابيب المختبر القياسية فقط ولا يتطلب أي معدات مكلفة. عندما نمت بلورات في ChipX، يمكن إدخال يغاندس من الانزيم عن طريق الانتشار. ثم يتم جمع بيانات الحيود في درجة حرارة الغرفة على سلسلة من البلورات الموجودة في قنوات الشريحة باستخدام مصدر الأشعة السينية السنكروترون. أدت الدراسة الهيكلية الموصوفة هنا إلى تحديد هياكل إنزيم نضوج الـ TRNA في شكله apo وفي التعقيد مع تناظرية لركيزة CTP التي أدخلتها القعقعة. هذا البروتين يسمى CCA إضافة انزيم البلمرة CCA ثلاثي النوكليوتيد الذيل في نهاية 3 'من tRNAs. المقارنة بين الصورتين ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها بواسطة البلورات التسلسلية تكشف عن التغيرات التشكلية المحلية المتعلقة بربط الرباط في الظروف التي هي أكثر فسيولوجية من تلك المستخدمة في البلورات الجليدية. البروتوكول الموصوف في هذا الفيديو ينطبق بشكل عام على أي جزيء حيوي ، أي بروتين أو حمض نووي أو مركب متعدد المكونات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

إعداد بلورات التألق جيدا والتعامل معها قبل تحليل الأشعة السينية خطوتين حاسمة من الدراسات البيولوجية الاكريكرولوجية. نحن نصف رقاقة microfluidic تنوعا التي تمكن من إنتاج بلورات عن طريق طريقة فعالة لمكافحة نشر. البيئة الخالية من الحمل الحراري التي توفرها القنوات microfluidic مثالية لنمو الكريستال ومفيدة لنشر الركيزة في الموقع النشط للأنزيم البلورية. هنا طبقنا هذا النهج على إنزيم CCA-إضافة من البكتيريا النفسية Planococcus halocryophilus في المثال المقدم. بعد التبلور ونشر الركيزة / نقع، تم تحديد هيكل الكريستال من الانزيم:الركيزة مجمع في درجة حرارة الغرفة عن طريق البلورات التسلسلي وتحليل بلورات متعددة مباشرة داخل رقاقة. يحافظ الإجراء بأكمله على خصائص الحيود الأصلية للعينات لأنه لا يتطلب معالجة بلورية.

تم تصميم رقاقة microfluidic الموصوفة هنا لتمكين الإعداد السهل من مقايسات التبلور والتحليل البلوري في درجة حرارة الغرفة. تم تطبيق الإجراء الموصوف أعلاه وفي الفيديو في إطار التوصيف الهيكلي للإنزيمات التي تضيف CCA من البكتيريا المتكيفة مع البكتيريا Planococcus halocryophilus. ينتمي هذا الإنزيم إلى عائلة البوليميراز الأساسية التي تحفز الإضافة المتسلسلة لتسلسل CCA 3 على tRNAs باستخدام CTP و ATP9،10.
تم استخدام الشريحة لأول مرة لإعداد بلورات الإنزيم للتحليل الهيكلي من خلال طريقة الانتشار المضاد. وتحقيقا لهذه الغاية، تم تحميل محلول الإنزيم في القنوات الثمانية microfluidic (غرف التبلور) عن طريق حقنة واحدة في مدخل العينة من رقاقة (انظر الشكل 1). وقد استخدم الانزيم في 5.5 ملغ / مل في المخزن المؤقت يحتوي على 20 mM تريس / HCl 7.5، 200 mM NaCl و 5 mM MgCl2. وقد تم تنفيذ هذه الخطوة يدويا مع معيار 10 ميكروبيت μl. ثم أودعت حلول التبلور (100 mM خلات الصوديوم pH 4.5،1 M ديامونيوم فوسفات الهيدروجين) في الخزانات في الطرف الآخر من القنوات.
الإجراء التحميل هو واضح ولا يستغرق أكثر من خمس دقائق(الشكل 2). ثم ينتشر crystallant في القنوات، ويخلق تدرج التركيز الذي يؤدي نوات الكريستال والنمو. يتطور هذا التدرج بشكل ديناميكي ويستكشف سلسلة متصلة من الدول التشبع الفائق5،6 حتى تصل إلى توازن تركيز crystallant بين القنوات والخزان. وعادة ما يتم فحص الفحوصات البلورية تحت المنظار على مدى فترة 2 -4 أسابيع لتتبع نمو البلورات. ظهرت بلورات Bipyramidal من إنزيم CCA-إضافة في جميع أنحاء القنوات بعد بضعة أيام من الحضانة في 20 درجة مئوية(الشكل 3). اختياري الفلورسنت وضع العلامات7 من البروتين يسهل كثيرا تحديد بلورات البروتين والتمييز ضدهم من بلورات الملح (الشكل 4).
لقد استغللنا البيئة المنتشرة في قنوات الرقائق لتقديم الركيزة إلى الإنزيم الذي يبني البلورات. وفي هذه الحالة، تمت إضافة CMPcPP، وهو تناظري من CTP، إلى حلول الخزانات بتركيز نهائي قدره 3.75 mM(الشكل 5). تم إجراء هذه الإضافة قبل يومين من التحليل البلوري للسماح لـ CMPcPP بالوصول إلى موقع الحفز والإنزيم ، كما أكد في وقت لاحق من قبل البنية البلورية (انظر أدناه).
نحن تصنيع حامل رقاقة (الشكل 6) في حمض polylactic باستخدام طابعة 3D. يتيح الحامل تركيب الشريحة على الـ goniometer باستخدام رؤوس مغناطيسية قياسية. وبالتالي يمكن وضع رقاقة بسهولة وترجمتها في شعاع الأشعة السينية لجلب البلورات في موقف الحيود. وينبغي تكييف استراتيجية جمع البيانات تبعاً لخصائص خط الشعاع وخصائص الكريستال. وفي حالة الإنزيم الذي يضيف CCA، تم جمع البيانات في خطوط الشعاع X06DA وX10SA، ومصدر الضوء السويسري (SLS)، مع طول موجي للأشعة السينية يبلغ 1.0 و بيلاتوس 2M-F و 6M كاشفات بكسل، على التوالي. تم جمع 30-60 درجة من الدوران على كل بلورة في درجة حرارة الغرفة مع صور من 0.1 درجة أو 0.2 درجة و 0.1 s التعرض (انظر الجدول 1). تمت معالجة مجموعات البيانات الجزئية بشكل فردي وتم قطعها عندما بدأت دقة أنماط الانعراج في التحلل بسبب تلف الإشعاع (تم اكتشافها من خلال انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0"> و CC1/2، وزيادة في R meas في القشرة عالية الدقة). وقد أعيد تشكيل مجموعات البيانات الكاملة عن طريق دمج البيانات من 5 بلورات(الجدول 1). تم اشتقاق الهياكل الكريستالية عن طريق الاستبدال الجزيئي باستخدام حزم crystallographic القياسية والإجراءات اللازمة لتجهيز البيانات11 و12. المقارنة بين هياكل الإنزيم ومركبته مع CMPcPP يكشف عن التكيف التشكل المحلية التي ترافق الربط الركيزة في الموقع النشط للانزيم CCA إضافة (الشكل 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg"> الشكل 1: تصميم ChipX. رقاقة يتكون من طبقة أعلى مصنوعة من COC (سمك: 1 مم) التي يتم فيها طبع ثماني قنوات microfluidic والخزانات. يتم إغلاق الشريحة بأكملها مع طبقة من COC (سمك: 0.1 ملم). وترتبط جميع القنوات بمدخل واحد على الجانب الأيسر لحقن العينة في وقت واحد وإلى الخزانات الفردية على الجانب الأيمن التي يتم فيها إيداع حلول التبلور. القنوات، التي تشكل غرف التبلور الفعلي للرقاقة، هي 4 سم طويلة ولها مقطع عرضي من 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر. ChipX لديه حجم شريحة المجهر القياسية (7.5 سم × 2.5 سم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg"> الشكل 2: إعداد تبلور في 1 ChipX. 1) إيداع 5-6 ميكرولتر من حلول انزيم باستخدام معيار 10 ميكرولتر الأنابيب وتلميح. 2) تقديم تلميح عموديا في مدخل العينة وحقن الحل في القنوات الثمانية. 3) Pipet 1 ميكرولتر من زيت البارافين. 4) تقديم تلميح عموديا في مدخل العينة وحقن النفط من أجل فصل القنوات عن بعضها البعض. 5) ختم مدخل مع قطعة من الشريط. 6) Pipet 5 ميكرولتر من حل التبلور باستخدام معيار 10 ميكرولتر الأنابيب وتلميح. يمكن أن تكون الحلول مختلفة في كل خزان (على سبيل المثال، من مجموعة فحص). 7) توجيه تلميح الأنابيب نحو دخول القناة في قمع على شكل جزء من الخزان (لتجنب تشكيل فقاعة الهواء على ترسب الحل) وحقن حل crystallant في الخزان. 8) ختم الخزانات مع قطعة من الشريط واحتضان رقاقة في درجة حرارة تسيطر عليها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg"> الشكل 3: بلورات من CCA إضافة انزيم نمت عن طريق مكافحة الانتشار في قنوات microfluidic من ChipX. شريط مقياس هو 0.1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">ملم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg"> الشكل 4: إجراء البلورة. 1) إزالة الشريط بلطف من الخزانات. 2) إيداع ما يصل إلى 5 ميكرولتر من حل ligand باستخدام 10 ميكروبيت μl. 3) إضافة ليغاند إلى واحد أو عدة خزانات. 4) ختم مرة أخرى الخزانات مع قطعة من الشريط واحتضان رقاقة تحت درجة حرارة تسيطر عليها لمدة 24-48 ساعة قبل جمع البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg"> الشكل 5: تتبع الفلورسنت وسم يميز البروتين (يسار) من الملح (يمين) بلورات. يحتوي محلول الإنزيم CCA-إضافة 0.4 ٪ (ث / ث) من البروتين المسمى مع كاربوإكسيرودامين. على اليمين، يتم إضاءة البلورات بمصدر ضوء طول موجي يبلغ 520 نانومتر ويتم التقاط الصورة مع فلتر تمرير منخفض عند 550 نانومتر (LP550); (inset) هيكل كاربوإكسيرهودامين-succinimidyl استر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg"> الشكل 6: (يسار) رسم حامل ChipX و (يمين) ChipX التي شنت على goniometer من خط شعاع X06DA في SLS (Villigen، سويسرا) لتحليل البلورة المسلسل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg"> الشكل 7: مقارنة بينCCA-إضافة إنزيم بالموقع في شكل apo (في الوردي) وفي المجمع مع CTP التناظرية (باللون الأخضر). على الرغم من أن التشكل العام للأنزيم لا يتأثر ، فإن ربط ليغاند CMPcPP يصاحبه إعادة تنظيم طفيفة للسلاسل الجانبية في الموقع النشط. خريطة كثافة الإلكترون 2Fo-Fc (باللون الأزرق) هي مخطط 1.2 sigma. يؤكد الاختلاف الإلكترون كثافة خريطة في 4 سيغما (باللون الأخضر) وجود ليغاند في الموقع النشط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>عينة متبلورة</td>
			<td>إنزيم CCA-إضافة</td>
			<td>إنزيم CCA- إضافة + CMPcPP</td>
		</tr>
<tr>
<td>تحليل الكريستال</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>خط شعاع الأشعة السينية</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA</td>
		</tr>
<tr>
<td>الطول الموجي (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>درجة الحرارة (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>بيلاتوس 2M-F</td>
			<td>بيلاتوس 6M</td>
		</tr>
<tr>
<td>الكريستال للكشف عن بعد (مم)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>بلورات جمعت</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>بلورات مختارة</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>نطاق الدوران لكل صورة (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>وقت التعرض لكل صورة (ق)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا. من الصور المحددة</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموع نطاق التناوب (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجموعة الفضاء</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>
أ، ج (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوسط الفسيفساء (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>نطاق القرار (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>العدد الإجمالي من انعكاسات</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا. من انعكاسات فريدة من نوعها</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
<tr>
<td>اكتمال (٪)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>التكرار</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>رِيَس (٪)</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (٪) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>عامل B الإجمالي من مؤامرة ويلسون (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصقل البلوري</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>لا. من الانعكاسات، مجموعة العمل / مجموعة اختبار</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rcryst النهائي (٪ / Rالحرة (٪)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>لا. من الذرات غير H: عموما / البروتين / ligand / المذيبات</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>R.m.s. انحرافات للسندات (Å) / زوايا (°)</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوسط العوامل B (Å2):إجمالي / بروتين / ليغاند / المذيبات</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>مؤامرة راماشاندران: الأكثر تفضيلاً (٪) / مسموح به (٪ )</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>معرف PDB</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1:إحصاءات جمع البيانات وتنقيحها
§ التكرار مستقلة Rmeas = Σhkl(N / N - 1)1 /2Σط | ط(hkl)-- < I(hkl)>| / ΣhklΣط ط(hkl) ، حيث N هو تعدد البيانات 17.
تم تضمين البيانات مع انخفاض <I/σ(I)> في الغلاف الخارجي (<2.0) على أساس معيار CC1/2 (الارتباط بين نصفين عشوائيين من مجموعة البيانات > 50٪). كما اقترح Karplus & ديديريشس 18.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

يوصف جهاز microfluidic متعدد الاستخدامات الذي يمكّن من تبلور إنزيم باستخدام طريقة الانتشار المضاد ، وإدخال الركيزة في البلورات عن طريق النقع ، وتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد للأنزيم: مجمع الركيزة من خلال تحليل متسلسل للبلورات داخل الشريحة في درجة حرارة الغرفة.

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

مرحبا، ومرحبا بكم في الهندسة المعمارية المختبرية والتفاعل من RNA في معهد البيولوجيا الجزيئية وخلية في ستراسبورغ. إن زراعة بلورات جيدة التغوط هي خطوة حاسمة في أي دراسة بلورية. في هذا الفيديو، سوف نبرهن على استخدام أداة جديدة microfluidic لزراعة بلورات من الجزيئات الحيوية وتحديد هيكلها ثلاثي الأبعاد عن طريق الحيود في الموقع بالأشعة السينية.الجهاز microfluidic يسمى ChipX يقدم العديد من المزايا. وهي مصممة لتصغير وتسهيل أصول التبلور من خلال طريقة الانتشار المضاد. إعدادها سهل ويتم تنفيذه مع مواد معملية قياسية.كما أنها الأمثل للتوصيف المباشر للبلورات التي تزرع في رقاقة عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية المسلسل. تشيب إكس يزيل مناولة البلورات والخطوات التبريد يحافظ على نوعية جوهرية من البلورات التي يتم تحليلها في الموقع وفي درجة حرارة الغرفة. ChipX لديه شكل شريحة المجهر، 7.5 في 2.5 سم.وهو يحتوي على ثماني قنوات microfluidic تستخدم كغرفة تبلور مع قسم من 80 في 18 ميكرومتر وطولها أربعة سنتيمترات. يسمح المدخل على الجانب الأيسر للحقن اليدوي للمحلول الجزيئات الحيوية الذي سيملأ القنوات الثماني حتى الخزانات. يتم إيداع حلول التبلور في هذه الخزانات على الجانب الأيمن.يتم تشغيل التبلور من قبل ظاهرة تسمى الانتشار المضاد. عندما ينتشر عامل التبلور في محلول الجزيئات الحيوية ويخلق تركيزًا وتدرجًا فائقًا للتشبع. التسميات وbost على طول القنوات تساعد على تحديد موقع بلورات أكثر سهولة.يتطلب إعداد شريحة خمسة إلى ستة ميكرولترات من محلول الجزيئات الحيوية بتركيز نموذجي من خمسة إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر. واحد زيت البارافين microlitre، خمسة ميكرولترات من محلول التبلور لكل خزان وشريط لاصق. يتم تنفيذ تحميل ChipX يدويا مع micropipette والنصائح القياسية.يتم استخدام حل عينة زرقاء في هذا المثال للحصول على تصور أفضل لعملية الحقن. لتجنب التسرب، يتم إدخال طرف في مدخل العينة عموديا على رقاقة. يتم تحميل ميكرولتر واحد من زيت البارافين بعد العينة لفصل القنوات عن بعضها البعض.ثم يتم إغلاق مدخل العينة مع الشريط. يتم تحميل الخزانات الثمانية بشكل فردي مع خمسة ميكرولترات من محلول عامل التبلور. للقيام بذلك، يتم وضع طرف ماصة قريبة من نهاية القناة بزاوية حوالي 45 درجة.وهذا يمنع تشكيل فقاعة الهواء بين العينة وعامل تبلور. ويمكن ملء الخزانات بالكوكتيلات التي تحتوي على مختلف المخازن المؤقتة أو البوليمرات أو الأملاح، وما إلى ذلك، للفحص أو التحسين. خزانات مغلقة مع الشريط.كما هو موضح هنا ، يعد إعداد شريحة سهلة ويستغرق بضع دقائق فقط. في ChipX ، يحدث التبلور عن طريق الانتشار المضاد. عوامل تبلور المودعة في الخزانات تنتشر في القنوات التي تحتوي على الجزيئات الحيوية.وهذا يخلق تدرجات من التركيز والتشبع الفائق الذي سيؤدي إلى التبلور. هذه هي أمثلة من بلورات انزيم تم الحصول عليها داخل القنوات. قد تنمو لملء القنوات التي لديها مقطع عرضي من 80 في 80 ميكرومتر.بلورات يمكن اكتشافها بسهولة في ChipX عن طريق المجهر الفلوريسنس باستخدام الفلوريسنس الطبيعي من بقايا التربتوفان تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، أو كما هو مبين هنا باستخدام بروتين المسمى الفلورسنت. يُظهر هذا القسم تحليلًا تلغرافيًا من Chris تم إجراؤه في مصدر الضوء السويسري في filaggrins سويسرا. ويمكن حمل رقائق إلى السنكروترون دون أي معدات إضافية أو رعاية خاصة.دعونا ندخل قاعة مصدر الضوء السويسري. الإلكترونات تدور في الحلقة المركزية وتوليد طيف واسع من الموجات الكهرومغناطيسية، بما في ذلك الأشعة السينية المستغلة في خطوط شعاع مختلفة. تم تسجيل هذا الفيديو في X06 ، وهو خط شعاع مخصص لعلم البلورات الجزيئية الكلية.قد يتغير البروتوكول من مرفق واحد السنكروترون إلى الآخر، ولكن المبدأ العام لا يزال هو نفسه. تم تركيب ChipX على حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد. ثم يتم إرفاق هذا الحامل إلى المغناطيس من goniometer القياسية.التحليل التسلسلي ثابت جمع البيانات من سلسلة من البلورات نمت في رقاقة. يتم إنشاء قوائم من المواقف الكريستال باستخدام التسميات وbost على طول قنوات رقاقة. يقوم الباحثون بنقل الشريحة لمركز البلورات في شعاع الأشعة السينية الذي يرمز إليه الإطار الأصفر.يتم إطلاق إجراء توسيط سريع باستخدام شعاع الأشعة السينية. تتوقف الشعاع ترتفع في مكانها ويتحرك الكاشف نحو العينة. يتم إجراء فحص الشبكة لضمان محاذاة البلورة مع الحزمة.يتم تكرار نفس الإجراء بعد تدوير الشريحة بمقدار 30 درجة. الخطوة الثانية مهمة لأن المادة رقاقة يخلق تأثير المنظر الذي يؤدي إلى تحول الحد الأقصى للانعراج فيما يتعلق موقف الكريستال لوحظ. بمجرد أن يتم تمركز البلورة في الحزمة يبدأ جمع البيانات.هذا التسلسل يظهر جمع البيانات في الوقت الحقيقي. رقاقة تدور بمقدار 30 درجة. وفي الوقت نفسه، يتم جمع صور الحيود المقابلة بواسطة الكاشف.وصف هذه الكريستالة كامل. رقاقة ترجمت إلى البلورة المقبل في القناة ويتم تكرار الإجراء كله. لاحظ أن هذا التحليل يتم تشغيله في الموقع دون التعامل المباشر مع الكريستال وفي درجة حرارة الغرفة.ثم يتم دمج البيانات التي يتم جمعها على سلسلة من البلورات للحصول على مجموعة بيانات كاملة عن الحيود تستخدم لحساب خريطة كثافة الإلكترون، تظهر باللون الأزرق، ولبناء النموذج الذري. تم تطبيق الإجراء الموصوف في هذا الفيديو في إطار التوصيف الهيكلي لميناء إنزيم التعديل الـ TRNA. إنزيم CCA-إضافة من البكتيريا الباردة تكييفها، Planococcus halocryophilus.تم استخدام ChipX لبلورة الإنزيم عن طريق الانتشار المضاد في وجود كبريتيد الأمونيوم كعامل تبلور. ظهرت بلورات جانبية هرمية على طول القنوات ، بعد بضعة أيام من الحضانة عند 20 درجة مئوية. سهل وضع العلامات الفلورية للبروتين تحديد بلورات البروتين وتمييزها من بلورات الملح.تم تحليل سلسلة من البلورات في الموقع وفي درجة حرارة الغرفة. تم دمج بيانات الحيود الخاصة بهم وأدت إلى الهيكل البلوري لمنزيم APOE بدقة 2.5 angstrom. وبالإضافة إلى ذلك، تم استغلال انتشار البيئة في قنوات رقاقة لتقديم الركيزة إلى الانزيم الذي يبني بلورات.وفي هذه الحالة، أضيف تناظري من CTP إلى حلول الخزان قبل يومين من تحليل السنكروترون. هذا سمح للمجمع أن ينتشر والوصول إلى موقع الحفاز للأنزيم. كما رأينا في بنية الكريستال من مجمع يحدد في قرار من 2.3 angstrom.البروتوكول الذي يظهر في هذا الفيديو هو قابل للتطبيق عموما وقد تم اختباره على مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية. في الختام ChipX هي أداة رقاقة مختبر التي تدمج جميع الخطوات من دراسة بلوريغرافية ويسمح لك للانتقال من الحل الطبية الحيوية إلى بنية الكريستال في جهاز microfluidic فريدة من نوعها. شكراً لمشاهدة هذا الفيديو.ونأمل أن نكون قد أقنعك بفوائد استخدام ChipX لبلورة وتحديد بنية الكريستال من المفضلة لديك من قبل Biomolecule.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

إعداد العملاق الحويصلات تغليف المجهرية بواسطة الطرد المركزي من مستحلب الماء في الزيت

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...