Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

De auteurs erkennen de Zwitserse lichtbron (Villigen, Zwitserland) voor de toewijzing van beamtime aan het project op de beamlines X10SA (PXII) en X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm voor haar bijdrage aan de verfijning van de structuur, Clarissa Worsdale voor de opname van de voice-over en François Schnell (Université de Strasbourg) voor zijn hulp bij videobewerking en SFX. Dit werk werd ondersteund door het Franse Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), de Universiteit van Straatsburg, het LabEx-consortium "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), een phd-financiering aan R.dW van het Excellence-initiatief (IdEx) van de Universiteit van Straatsburg in het kader van het Franse nationale programma "Investissements d'Avenir", een phd-financiering aan K.R. van de Frans-Duitse universiteit (UFA-DFH, subsidienr. CT-30-19), de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subsidienr. ma 634/10-1). De auteurs profiteerden van het procope Hubert Curien samenwerkingsprogramma (Frans ministerie van Buitenlandse Zaken en Deutscher Akademischer Austauschdienst).

1. Kristallisatietests instellen in ChipX
OPMERKING: Het ChipX microfluïdische apparaat kan worden verkregen van de auteurs. Een beschrijving van de chip is gegeven in figuur 1. Oplossingen die het kristallant (of kristalliserende middel) bevatten dat wordt gebruikt om kristallisatie te activeren, kunnen van commerciële oorsprong zijn of door de experimenteerder worden bereid.
<ol><li>Het biomoleculemonster laden OPMERKING: Het monstervolume dat daadwerkelijk nodig is om een individuele tegendiffusietest uit te voeren in het rechte gedeelte van elk kanaal van ChipX is 300 nL. Voor het gemak raden we echter aan om 5 μL te laden om de acht kanalen volledig te vullen, rekening houdend met de variabele lengte van hun gebogen sectie en dode volumes in te voeren.<ol>
<li>Pipet 5 μL enzymoplossingen met standaard 10 μL pipet en tip.</li>
		<li>Breng de punt verticaal in de monsterinlaat en injecteer de oplossing totdat de acht kanalen tot aan het andere uiteinde zijn gevuld (ingang van het kristallant reservoir).</li>
		<li>Injecteer 1 μL paraffineolie in de monsterinlaat om de kanalen van elkaar los te koppelen.</li>
		<li>Recupereer de extra oplossing in het kristallant reservoir aan de uiteinden van elk kanaal met behulp van een standaard 10 μL pipet.</li>
		<li>Sluit de monsterinlaat af met een stuk tape van 1 cm x 1 cm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het laden van de kristallisatieoplossingen<ol>
<li>Pipet 5 μL kristallisatieoplossing met standaard 10 μL pipet en tip. Het reservoirvolume is 10 μL, maar het laden van slechts de helft ervan voorkomt overloop bij het afdichten met tape en vergemakkelijkt verdere toevoeging van ligand voor wekende experimenten. Als de initiële kristallisatieomstandigheden werden verkregen door dampdiffusie, verhoogt u de kristallantconcentratie met een factor 1,5 - 2. Oplossingen kunnen in elk reservoir anders zijn (in het gepresenteerde geval werd overal 1 M diammoniumwaterstoffosfaat, 100 mM natriumacetaat, pH 4,5 gebruikt).</li>
		<li>Oriënteer de pipetpunt naar de ingang van het kanaal in het trechtervormige deel van het reservoir om de vorming van een luchtbel bij oplossingsafzetting te voorkomen. Het zou het contact tussen de twee oplossingen en kristallante diffusie in het kanaal voorkomen.</li>
		<li>Injecteer de kristallante oplossing in het reservoir.</li>
		<li>Sluit de reservoirs af met een stuk tape van 2,5 cm x 1 cm.</li>
		<li>Incubeer de chip bij 20 °C (temperatuur kan worden aangepast afhankelijk van het doel, meestal tussen 4 en 37 °C 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Eiwitetikettering met carboxyrhodamine voor fluorescentiedetectie
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Het moet vóór het laden van monsters worden uitgevoerd om de detectie van kristallen in de chip met fluorescentie te vergemakkelijken. De gedetailleerde methode van tracering fluorescerende etikettering werd beschreven door Pusey en collega's7. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
<ol><li>Los 5 mg carboxyrhodamineesterpoeder op in 1 ml watervrij dimethyl-formamide, splits de oplossing in 0,6 μL aliquots die bij -20 °C moeten worden bewaard.</li>
	<li>Bereid een 1 M Na-borate pH 8,75 voorraadoplossing voor.</li>
	<li>Verdun het bestand om de reactiebuffer voor te bereiden op 0,05 M Na-boraat pH 8,75.</li>
	<li>Spoel een ontkalkingskolom (7 kDa MWCO, 0,5 ml) af met 800 μL reactiebuffer.</li>
	<li>Centrifugeer de kolom gedurende 1 minuut bij 1400 x g, verwijder het filtraat.</li>
	<li>Herhaal deze handeling tweemaal (stap 2.4-2.5) om de kolom te wassen.</li>
	<li>Deponeer 80 μL eiwit in de opslagbuffer op de kolom (het eiwit kan worden verdund tot 1 mg/ml om het volume indien nodig te verhogen).</li>
	<li>Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 1400 x g. Deze stap is bedoeld om het eiwit over te brengen van de opslagbuffer naar de reactiebuffer.</li>
	<li>Herstel de doorstroming (met het eiwit in de reactiebuffer) en meng deze met 0,6 μL carboxyrhodamineoplossing.</li>
	<li>Incubeer 5 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel ondertussen de kolom 3 x af met de opslagbuffer, centrifugeer de kolom gedurende 1 minuut op 1400 x g en gooi het filtraat weg.</li>
	<li>Deponeer de reactieoplossing op de kolom.</li>
	<li>Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 1400 x g en recupereer de doorstroom (d.w.z. oplossing van gelabeld eiwit in de opslagbuffer).</li>
	<li>Vul de bouillon-eiwitoplossing aan met 0,1-1 % (w/w) gelabeld eiwit.</li>
	<li>Stel de ChipX-kristallisatietests in zoals beschreven in sectie 1.</li>
	<li>Controleer op de aanwezigheid van eiwitkristallen in de tests door de fluorescerende sonde te opwindend te maken met een lichtbron met een golflengte van 520 nm.</li>
</ol>3. Kristalobservatie
OPMERKING: Het ChipX-apparaat mag zonder speciale zorg worden behandeld, zelfs met kristallen erin, behalve als de temperatuur moet worden geregeld.
<ol><li>Gebruik een stereomicroscoop om de uitkomst van kristallisatietests in ChipX te controleren. De voetafdruk heeft de standaardafmetingen van microscoopdia's en is compatibel met elk systeem en schuifhouder.</li>
	<li>Controleer het gehalte aan microfluïdische kanalen vanaf het reservoir waar de kristallantconcentratie het hoogst is tot de monsterinlaat waar de kristallantconcentratie het laagst is. Het ChipX-materiaal is transparant voor zichtbaar licht, compatibel met het gebruik van polarisatoren, evenals met UV-verlichting voor de identificatie van eiwitkristal door intrinsieke tryptofaanfluorescentie8.</li>
	<li>Neem kristalposities op met behulp van de labels die langs de kanalen zijn in reliëf gemaakt of markeer kristallocaties met een permanente markering door kleurpunten ernaast op het spaanoppervlak te tekenen.</li>
</ol>4. Kristal weken met liganden
OPMERKING: Deze procedure is optioneel. Het wordt gebruikt om liganden, enzymsubstraten of zware atomen in de kristallen te introduceren en moet ten minste 24-48 uur vóór röntgenanalyse worden uitgevoerd om de samengestelde diffusie langs de kanalen en in de kristallen mogelijk te maken.
<ol><li>Verwijder voorzichtig de afdichtingstape uit de reservoirs.</li>
	<li>Voeg tot 5 μL ligandoplossing toe in een of meer reservoirs met behulp van een 10 μL micropipet (in het voorbeeld 3 μL van 10 mM cytidine-5'-[(α,β)-methyleno] trifosfaatoplossing (CMPcPP) werd toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 3,75 mM te bereiken). CMPcPP is een niet-hydrolizable analoog van CTP, een natuurlijk substraat van het enzym.</li>
	<li>Sluit de reservoirs af met een stuk tape van 2,5 cm x 1 cm.</li>
	<li>Incubeer de chip gedurende 24-48 uur onder gecontroleerde temperatuur om liganddiffusie langs de kanalen van de chip mogelijk te maken.</li>
</ol>5. Kristalanalyse door seriële kristallografie
OPMERKING: Dit deel van het protocol moet worden aangepast aan de beamline-instelling en de diffractie-eigenschappen van de kristallen. Alleen algemene indicaties worden gegeven voor de kristallografische analyse op basis van experimenten uitgevoerd bij X06DA beamline (SLS, Villigen, Zwitserland).
<ol><li>ChipX montage op de beamline goniometer OPMERKING: Het bestand voor 3D-printen van de ChipX-houder is voorzien in ref4.<ol>
<li>Schakel de cryostraal van de straallijn uit. De analyse wordt hier uitgevoerd bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Monteer de ChipX op een speciale houder met het kanaal met de te analyseren kristallen in het midden van de houder. DeChipX-houder 4 heeft geen schroef of extra onderdeel nodig, omdat deze is ontworpen om een perfecte pasvorm voor ChipX te bieden.</li>
		<li>Bevestig de houder aan de goniometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gegevensverzameling<ol>
<li>Oriënteer de dikste laag (bovenste laag, figuur 1) van ChipX (in deze oriëntatie zijn labels langs de kanalen direct leesbaar met behulp van de centreercamera van de bundellijn), naar de directe straal en het dunste vlak achter het kristal om de demping van het diffracted signaal zoals beschreven in ref3te minimaliseren.</li>
		<li>Om botsing van ChipX met het omringende materiaal (beamstop, collimator) te voorkomen, beperkt u goniometerbewegingen in het bereik ±30° (0° overeenkomend met de kanalen loodrecht op de röntgenstraal).</li>
		<li>Zoek de positie van kristallen met behulp van de labels die langs de kanalen zijn geslepen.</li>
		<li>Selecteer een kristalpositie.</li>
		<li>Centreer het kristal op standaard lage dosis raster/rasterscreening of 1-klikprocedure (de video toont een voorbeeld van rasterscreening).</li>
		<li>Verzamel diffractiegegevens binnen het bereik -30° / +30°.</li>
		<li>Start de procedure opnieuw in stap 5.2.4-5.2.6 op een ander kristal in hetzelfde kanaal na vertaling van de chip.</li>
		<li>Pas handmatig een ander ChipX-kanaal in het midden van de houder opnieuw uit en voer de gegevensverzameling uit op kristallen die in dit kanaal aanwezig zijn.</li>
		<li>Gebruik standaard kristallografische pakketten en procedures om de gegevens te verwerken en samen te voegen en vervolgens om de structuur op te lossen en te verfijnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization.">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization.">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li><li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification.">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li><li>Betat, H., Rammelt, C., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+nucleotidyltransferases:+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization.">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li><li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige protocollen in de biokristallografie omvatten de bereiding van kristallen met behulp van methoden zoals dampdiffusie of batch13,14, en hun overdracht in een microloop voor cryokoeling15,16 voordat de diffractieanalyse in een stikstofstraal bij cryogene omstandigheden wordt uitgevoerd. Directe kristal cryo-koeling is daarentegen niet mogelijk in ChipX3 en kristallen kunnen niet worden geëxtraheerd uit hun microfluïdische kanaal, wat kan worden gezien als beperkingen van deze opstelling. Het protocol dat in het artikel wordt beschreven, biedt echter een volledig geïntegreerde pijpleiding voor de bepaling van kristalstructuren bij kamertemperatuur (d.w.z. in meer fysiologische omstandigheden). Hoewel het verzamelen van gegevens bij kamertemperatuur een toename van stralingsschadeveroorzaakt 19, wordt dit effect gecompenseerd door een snelle tijd voor het verkrijgen van gegevens (er wordt maximaal 60° rotatie op elk kristal verzameld) en door het samenvoegen van verschillende gedeeltelijke datasets. Zowel het ChipX-ontwerp als het materiaal zijn geoptimaliseerd om achtergrondverstrooiing en diffractiesignaaldemping3te verminderen , en gegevensverzameling kan worden uitgevoerd op kristallen met afmetingen die gelijk zijn aan de helft van de grootte van de kanalen (40 μm)4.
Samenvattend zijn de belangrijkste voordelen van het protocol de volgende. De kristallen worden geproduceerd in een convectievrije omgeving (microfluïdische kanalen), wat zeer gunstig is voor de groei van hoogwaardige kristallen. De in ChipX geïmplementeerde contradiffusiemethode is zeer efficiënt in het screenen van het oververzadigingslandschap; de diffusie van kristallanten in het spaankanaal creëert een concentratie - en oververzadigingsgolf die helpt bij het bepalen van de juiste nucleatie - en groeiomstandigheden5. Kristallen worden nooit direct behandeld, maar worden ter plaatse geanalyseerd in de chip, die hun echte diffractie-eigenschappen behoudt (d.w.z. de kristalmozaïekiteit niet verandert door fysieke interactie of cryocooling)20. De diffractieanalyse wordt uitgevoerd op een reeks kristallen verdeeld over de chipkanalen met lage dosisblootstelling om stralingsschade te minimaliseren, en een volledige dataset wordt geassembleerd door gedeeltelijke gegevens uit de serie samen te voegen. De standaardvoetafdruk en het eenvoudige ontwerp van ChipX zullen in de toekomst een volledige automatisering van in situ gegevensverzameling mogelijk maken met behulp van synchrotron- of XFEL-faciliteiten. Alle stappen van het protocol worden uitgevoerd in ChipX. Vanuit het oogpunt van de experimenteerer is chipopstelling eenvoudig en eenvoudig uit te voeren met standaard pipetten en heeft u geen extra apparatuur nodig. De boomachtige kanaalverbinding bij de monsterinlaat minimaliseert dode volumes in het systeem, wat belangrijk is bij het werken met monsters die moeilijk te zuiveren zijn of die slechts in beperkte hoeveelheid beschikbaar zijn.
Kortom, de lab-on-a-chip-aanpak die in ChipX wordt geïmplementeerd, vereenvoudigt en minimaliseert het kristallisatieproces efficiënt door tegendiffusie en kristalstructuurbepaling, waardoor het mogelijk is om in één apparaat van het monster naar de 3D-structuur te gaan. Het is breed toepasbaar en biedt een gebruiksvriendelijke, kosteneffectieve oplossing voor routinematige seriële biokristallografieonderzoeken bij kamertemperatuur.

Kristallografie is een methode om de 3D-architectuur van biologische macromoleculen te ontcijferen. Dit laatste is belangrijk om te begrijpen hoe een enzym zijn substraten selecteert en verwerkt. De bepaling van een kristalstructuur vereist de kristallisatie van het doelmacromolecule en de conditionering van de kristallen voor hun analyse door röntgendiffractie1. Zowel kristalvoorbereiding als -behandeling zijn cruciale maar delicate stappen die de kristalkwaliteit en diffractie-eigenschappen kunnen beïnvloeden, en dus de resolutie (d.w.z. de nauwkeurigheid) van de resulterende 3D-structuur. Om de voorbereiding van hoogwaardige kristallen te vergemakkelijken en onnodige handling te elimineren om hun diffractie-eigenschappen te behouden, hebben we een gebruiksvriendelijk en veelzijdig microfluïdisch apparaat ontworpen genaamd ChipX2,3,4.
In dit artikel laten we zien hoe we de eiwitoplossing in ChipX-kanalen kunnen laden met behulp van conventioneel laboratoriummateriaal om kristallen te bereiden door tegendiffusie. Deze kristallisatiemethode biedt een efficiënte screening van de oververzadiging en van mogelijke nucleatieomstandigheden langs de microfluïdische kanalen die de enzymoplossing bevatten als gevolg van de concentratiegradiënt die wordt gegenereerd door de diffusie van het kristalliserende middel5,6.
De chipopstelling is eenvoudig, het gebruikt alleen standaard laboratoriumpijpen en vereist geen dure apparatuur. Wanneer kristallen in ChipX zijn gegroeid, kunnen liganden van het enzym worden geïntroduceerd door diffusie. Diffractiegegevens worden vervolgens bij kamertemperatuur verzameld op een reeks kristallen in de kanalen van de chip met behulp van een synchrotron-röntgenbron. De hier beschreven structurele studie leidde tot de bepaling van structuren van een tRNA-rijpingsenzym in zijn apo-vorm en in complex met een analoog van zijn CTP-substraat geïntroduceerd door weken. Dit eiwit genaamd CCA-toevoegend enzym polymeriseert de CCA trinucleotide staart aan het 3' einde van tRNA's. De vergelijking van de twee 3D-beelden verkregen door seriële kristallografie onthult de lokale conformationele veranderingen in verband met de binding van de ligand in omstandigheden die fysiologischer zijn dan die gebruikt in cryo-kristallografie. Het protocol dat in deze video wordt beschreven, is algemeen van toepassing op elk biomolecule, of het nu een eiwit, een nucleïnezuur of een complex met meerdere componenten is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

De voorbereiding van goed diffracting kristallen en hun behandeling vóór hun röntgenanalyse zijn twee kritieke stappen van biokristallografische studies. We beschrijven een veelzijdige microfluïdische chip die de productie van kristallen mogelijk maakt door de efficiënte methode van tegendiffusie. De convectievrije omgeving van de microfluïdische kanalen is ideaal voor kristalgroei en nuttig om een substraat te verspreiden naar de actieve plaats van het kristallijne enzym. Hier pasten we deze benadering toe op het CCA-toevoegende enzym van de psychrofiele bacterie Planococcus halocryophilus in het gepresenteerde voorbeeld. Na kristallisatie en substraatdiffusie/weken werd de kristalstructuur van het enzym:substraatcomplex bij kamertemperatuur bepaald door seriële kristallografie en de analyse van meerdere kristallen direct in de chip. De hele procedure behoudt de echte diffractie-eigenschappen van de monsters omdat deze geen kristalverwerking vereist.

De hier beschreven microfluïdische chip is ontworpen om eenvoudige installatie van kristallisatietests en kristalanalyse bij kamertemperatuur mogelijk te maken. De hierboven beschreven procedure en in de video werd toegepast in het kader van de structurele karakterisering van het CCA-toevoegende enzym van de koud aangepaste bacterie Planococcus halocryophilus. Dit enzym behoort tot een essentiële polymerasefamilie die de sequentiële toevoeging van de 3' CCA-reeks op tRNA 's katalyseert met behulp van CTP en ATP9,10.
De chip werd voor het eerst gebruikt om kristallen van het enzym voor te bereiden voor structurele analyse volgens de methode van tegendiffusie. Hiertoe werd de enzymoplossing in de acht microfluïdische kanalen (kristallisatiekamers) geladen door een enkele injectie in de monsterinlaat van de chip (zie figuur 1). Het enzym werd gebruikt bij 5,5 mg/ml in de opslagbuffer met 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl en 5 mM MgCl2. Deze stap werd handmatig uitgevoerd met een standaard 10 μL micropipet. Kristallisatieoplossingen (100 mM natriumacetaat pH 4,5,1 M diammoniumwaterstoffosfaat) werden vervolgens afgezet in de reservoirs aan de andere uiteinden van de kanalen.
De laadprocedure is eenvoudig en duurt niet langer dan vijf minuten (figuur 2). Het kristallant verspreidt zich vervolgens in de kanalen, creëert een concentratiegradiënt die kristalkernatie en groei activeert. Deze gradiënt evolueert dynamisch en verkent een continuüm van oververzadigingstoestanden5,6 tot het bereiken van een evenwicht van kristallantconcentratie tussen de kanalen en het reservoir. Kristallisatietests worden meestal gecontroleerd onder de micoscoop gedurende een periode van 2 - 4 weken om de groei van kristallen te volgen. Bipyramidale kristallen van CCA-toevoegend enzym verschenen door de kanalen na een paar dagen incubatie bij 20 °C (Figuur 3). De optionele fluorescerende etikettering7 van het eiwit vergemakkelijkt de identificatie van eiwitkristallen en hun discriminatie van zoutkristallen aanzienlijk (figuur 4).
We maakten gebruik van de diffusieve omgeving in chipkanalen om een substraat te leveren aan het enzym dat de kristallen opbouwt. In dit geval werd CMPcPP, een CTP-analoog, toegevoegd aan de reservoiroplossingen bij een uiteindelijke concentratie van 3,75 mM (figuur 5). Deze toevoeging werd twee dagen voor de kristallografische analyse uitgevoerd om CMPcPP in staat te stellen de katalytische plaats van het enzym te bereiken en te bezetten, zoals later bevestigd door de kristalstructuur (zie hieronder).
Wij vervaardigden een spaanhouder(figuur 6)in polymelkzuur met behulp van een 3D-printer. De houder maakt spaanmontage op goniometers mogelijk met behulp van standaard magnetische koppen. Daarom kan de chip eenvoudig in de röntgenstraal worden geplaatst en vertaald om de kristallen in diffractiepositie te brengen. De strategie voor het verzamelen van gegevens moet worden aangepast aan de kenmerken van de straallijn en de kristaleigenschappen. In het geval van het CCA-toevoegende enzym werden gegevens verzameld bij X06DA- en X10SA-bundellijnen, Swiss Light Source (SLS), met een röntgengolflengte van respectievelijk 1,0 Å- en Pilatus 2M-F- en 6M-pixeldetectoren. 30-60° rotatie werd verzameld op elk kristal bij kamertemperatuur met beelden van 0,1° of 0,2° en 0,1 s belichting (zie tabel 1). Gedeeltelijke datasets werden individueel verwerkt en gesneden toen de resolutie van diffractiepatronen begon te rotten als gevolg van stralingsschade (gedetecteerd door de afname van de signaal-ruisverhouding <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0"> en CC1/2, en een toename van R-meas in de hoge resolutieschaal). Volledige datasets werden gereconstitueerd door gegevens van 5 kristallen samen te voegen (tabel 1). Kristalstructuren werden afgeleid door moleculaire vervanging met behulp van standaard kristallografische verpakkingen en procedures voor gegevensverwerking11 en verfijning12. De vergelijking van de structuren van het enzym en van het complex ervan met CMPcPP onthult de lokale conformatieaanpassing die gepaard gaat met substraatbinding op de actieve plaats van het CCA-toevoegende enzym (figuur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg"> Figuur 1: ChipX ontwerp. De chip bestaat uit een toplaag van COC (dikte: 1 mm) waarin acht microfluïdische kanalen en reservoirs zijn ingeprent. De gehele chip is afgedicht met een laag COC (dikte: 0,1 mm). Alle kanalen zijn aangesloten op één inlaat aan de linkerkant voor gelijktijdige monsterinjectie en op individuele reservoirs aan de rechterkant waarin kristallisatieoplossingen worden afgezet. De kanalen, die de werkelijke kristallisatiekamers van de chip vormen, zijn 4 cm lang en hebben een doorsnede van 80 μm x 80 μm. Labels (A1, A2, A3, enz.) die langs de kanalen zijn geviseerd, vergemakkelijken de kristalpositionering onder de microscoop en het opstellen van een monsterlijst voor het verzamelen van gegevens. ChipX heeft de grootte van een standaard microscoopschuif (7,5 cm x 2,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg"> Figuur 2: Kristallisatietests instellen in ChipX. 1) Afzetting 5-6 μL enzymoplossingen met behulp van standaard 10 μL pipet en tip. 2) Breng de punt verticaal in de monsterinlaat en injecteer de oplossing in de acht kanalen. 3) Pipet 1 μL paraffineolie. 4) Breng de punt verticaal in de monsterinlaat en injecteer de olie om de kanalen van elkaar los te koppelen. 5) Sluit de inlaat af met een stuk tape. 6) Pipet 5 μL kristallisatieoplossing met standaard 10 μL pipet en tip. Oplossingen kunnen in elk reservoir anders zijn (bijv. van een screeningkit). 7) Oriënteer de pipetpunt naar de ingang van het kanaal in het trechtervormige deel van het reservoir (om de vorming van een luchtbel bij oplossingsdepositie te voorkomen) en injecteer de kristallante oplossing in het reservoir. 8) Sluit de reservoirs af met een stuk tape en incubeer de chip op gecontroleerde temperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg"> Figuur 3: Kristallen van CCA-toevoegend enzym geteeld door tegendiffusie in de microfluïdische kanalen van ChipX. Schaalbalk is 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg"> Afbeelding 4: Kristalweekprocedure. 1) Verwijder de tape voorzichtig uit de reservoirs. 2) Deponeer tot 5 μL ligandoplossing met behulp van een micropipet van 10 μL. 3) Voeg de ligand toe aan een of meerdere reservoirs. 4) Sluit de reservoirs opnieuw af met een stuk tape en incubeer de chip onder gecontroleerde temperatuur gedurende 24-48 uur vóór het verzamelen van gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg"> Figuur 5: Tracering fluorescerende etikettering discrimineert eiwit (links) uit zout (rechts) kristallen. De CCA-toevoegende enzymoplossing bevatte 0,4 % (w/w) eiwit geëtiketteerd met carboxyrhodamine. Aan de rechterkant worden kristallen verlicht met een 520 nm golflengte lichtbron en het beeld wordt genomen met een laagdoorlaatfilter bij 550 nm (LP550); (inset) structuur van carboxyrhodamine-succinimidylester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg"> Figuur 6: (Links) Tekening van de ChipX houder en (Rechts) ChipX gemonteerd op de goniometer van beamline X06DA bij SLS (Villigen, Zwitserland) voor seriële kristal analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg"> Figuur 7: Vergelijking van CCA-toevoegende enzym actieve site in de apo-vorm (in roze) en in het complex met een CTP analoog (in groen). Hoewel de algehele exterieur van het enzym niet wordt beïnvloed, gaat de binding van de CMPcPP-ligand gepaard met een lichte reorganisatie van zijketens op de actieve locatie. De 2Fo-Fc elektronendichtheidskaart (in blauw) is gevormd op 1,2 sigma. Het verschil elektronendichtheidskaart gevormd bij 4 sigma (in groen) bevestigt de aanwezigheid van de ligand op de actieve site. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gekristalliseerd monster</td>
			<td>CCA-toevoegend enzym</td>
			<td>CCA-toevoegend enzym + CMPcPP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristalanalyse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Röntgenstraallijn</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Golflengte (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatuur (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detector</td>
			<td>Pilatus 2m-f</td>
			<td>Pilatus 6M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afstand kristaldetector (mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verzamelde kristallen</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geselecteerde kristallen</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotatiebereik per afbeelding (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtingstijd per afbeelding(en)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nee. van geselecteerde afbeeldingen</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal rotatiebereik (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ruimtegroep</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>
a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde mozaïekiteit (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolutiebereik (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal nr. van reflecties</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nee. van unieke reflecties</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volledigheid (%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Redundantie</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Algemene B-factor van Wilson plot (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristallografische verfijning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Nee. van reflecties, werkset / testset</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
<tr>
<td>Finale Rcryst (%) / Rvrij (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nee. van niet-H-atomen: algemeen / eiwit / ligand / oplosmiddel</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>R.m.s. afwijkingen voor bindingen (Å) / hoeken (°)</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gemiddelde B-factoren (Å2):algemeen / eiwit / ligand / oplosmiddel</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran plot: meest favoriete (%) / toegestaan (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>PDB-id</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Statistieken voor het verzamelen en verfijnen van gegevens
§ Redundantieonafhankelijke Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- <I(hkl)>| / ΣhklΣi I(hkl), waarbij N de gegevens veelheid 17is .
£ Gegevens met een laag <I/σ(I)> in de buitenschaal (<2.0) werden opgenomen op basis van cc1/2-criterium (correlatie tussen twee willekeurige helften van de dataset > 50%) zoals voorgesteld door Karplus & Diederichs 18.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Een veelzijdig microfluïdisch apparaat wordt beschreven dat de kristallisatie van een enzym mogelijk maakt met behulp van de contradiffusiemethode, de introductie van een substraat in de kristallen door weken en de 3D-structuurbepaling van het enzym: substraatcomplex door een seriële analyse van kristallen in de chip bij kamertemperatuur.

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Hallo, en welkom bij de laboratoriumarchitectuur en reactiviteit van RNA aan het Instituut voor Moleculaire en Celbiologie in Straatsburg. Het kweken van goed defracterende kristallen is een cruciale stap in elke kristallografische studie. In deze video demonstreren we het gebruik van een nieuw microfluïdisch hulpmiddel om kristallen van een biomolecule te kweken en de 3D-structuur ervan te bepalen door in situ röntgendiffractie.Het microfluïdische apparaat genaamd ChipX biedt verschillende voordelen. Het is ontworpen om kristallisatiemiddelen te miniaturiseren en te vergemakkelijken volgens de methode van tegendiffusie. De opstelling is eenvoudig en wordt uitgevoerd met standaard labmateriaal.Het is ook geoptimaliseerd voor de directe karakterisering van kristallen die in de chip worden gekweekt door seriële röntgenkristallografie. ChipX elimineert stappen voor kristalbehandeling en cryokoeling en behoudt de intrinsieke kwaliteit van de kristallen die ter plaatse en bij kamertemperatuur worden geanalyseerd. ChipX heeft het formaat van een microscoopdia, 7,5 bij 2,5 centimeter.Het bevat acht microfluïdische kanalen die worden gebruikt als kristallisatiekamers met een sectie van 80 bij 18 micrometer en een lengte van vier centimeter. De inlaat aan de linkerkant maakt de handmatige injectie van de biomolecule-oplossing mogelijk die de acht kanalen tot aan de reservoirs zal vullen. Kristallisatieoplossingen worden aan de rechterkant in deze reservoirs afgezet.De kristallisatie wordt veroorzaakt door een fenomeen dat tegendiffusie wordt genoemd. Wanneer het kristalliserende middel zich verspreidt in de biomolecule-oplossing en een concentratie en een superverzadigingsgradiënt creëert. Labels en bost langs de kanalen helpen de kristallen gemakkelijker te lokaliseren.Het opzetten van een chip vereist vijf tot zes microliter biomolecule-oplossing bij een typische concentratie van vijf tot tien milligram per milliliter. Eén microliter paraffineolie, vijf microliter kristallisatieoplossing per reservoir en plakband. Het laden van ChipX gebeurt handmatig met een micropipette en standaard tips.In dit voorbeeld wordt een blauwe monsteroplossing gebruikt voor een betere visualisatie van het injectieproces. Om lekkage te voorkomen, wordt de punt loodrecht op de chip in de monsterinlaat gestoken. Een microliter paraffineolie wordt na het monster geladen om de kanalen van elkaar te scheiden.De monsterinlaat wordt vervolgens verzegeld met tape. De acht reservoirs worden individueel geladen met vijf microliters kristalliserende agentoplossing. Om dit te doen, wordt de pipettip dicht bij het uiteinde van het kanaal geplaatst onder een hoek van ongeveer 45 graden.Dit voorkomt de vorming van een luchtbel tussen het monster en het kristalliserende middel. Reservoirs kunnen worden gevuld met cocktails met verschillende buffers, polymeren of zouten, et cetera, voor screening of optimalisatie. Reservoirs zijn verzegeld met tape.Zoals hier wordt aangetoond, is het instellen van een chip eenvoudig en duurt het slechts een paar minuten. In ChipX vindt kristallisatie plaats door tegendiffusie. Kristalliserende middelen die in de reservoirs worden afgezet, verspreiden zich in de kanalen die het biomolecule bevatten.Dit creëert gradiënten van concentratie en van superverzadiging die kristallisatie zullen veroorzaken. Dit zijn voorbeelden van kristallen van een enzym verkregen in de kanalen. Ze kunnen groeien om de kanalen te vullen met een doorsnede van 80 bij 80 micrometer.Kristallen zijn gemakkelijk detecteerbaar in ChipX door fluorescentiemicroscopie met behulp van de natuurlijke fluorescentie van tryptofaanresten onder UV-licht, of zoals hier getoond met behulp van een fluorescerend gelabeld eiwit. Deze sectie toont een Chris telegrafische analyse uitgevoerd bij Zwitserse lichtbron in filaggrins Zwitserland. De chips kunnen zonder extra apparatuur of speciale zorg naar de synchrotron worden gedragen.Laten we de hal van de Zwitserse lichtbron betreden. Elektronen circuleren in de centrale ring en genereren een breed spectrum van elektromagnetische golven, inclusief röntgenstralen die op verschillende bundellijnen worden uitgebuit. Deze video is opgenomen op X06, een straallijn gewijd aan macromoleculaire kristallografie.Het protocol kan van de ene synchrotronfaciliteit naar de andere veranderen, maar het algemene principe blijft hetzelfde. ChipX is gemonteerd op een 3D-geprinte houder. Deze houder wordt vervolgens bevestigd aan de magneet van een standaard goniometer.De seriële analyse consistent het verzamelen van gegevens van een reeks kristallen gekweekt in de chip. Lijsten van kristalposities worden opgesteld met behulp van de labels en bost langs de chipkanalen. Onderzoekers verplaatsen de chip om de kristallen in de röntgenstraal te centreren, gesymboliseerd door het gele venster.Een snelle centreringsprocedure met behulp van de röntgenstraal wordt gestart. De bundelstop gaat omhoog en de detector beweegt naar het monster. De rasterscreening wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het kristal is uitgelijnd met de balk.Dezelfde procedure wordt herhaald na het draaien van de chip met 30 graden. De tweede stap is belangrijk omdat het spaanmateriaal een parallaxeffect creëert dat leidt tot een verschuiving van het diffractiemaximum ten opzichte van de waargenomen kristalpositie. Zodra het kristal in de straal is gecentreerd, begint de gegevensverzameling.Deze reeks toont gegevensverzameling in realtime. De chip draait 30 graden. Ondertussen worden overeenkomstige diffractiebeelden verzameld door de detector.De karakterisering van dit kristal is compleet. De chip vertaald naar het volgende kristal in het kanaal en de hele procedure wordt herhaald. Merk op dat deze analyse ter plaatse wordt uitgevoerd zonder directe behandeling van het kristal en bij kamertemperatuur.Gegevens die op een reeks kristallen worden verzameld, worden vervolgens samengevoegd om een volledige diffractiegegevensset te verkrijgen die wordt gebruikt om een elektronendichtheidskaart te berekenen, weergegeven in blauw, en om het atoommodel te bouwen. De procedure die in deze video wordt beschreven, werd toegepast in het frame van de structurele karakterisering van het tRNA-modificatie-enzym. Het CCA-toevoegende enzym van de koude aangepaste bacterie, Planococcus halocryophilus.ChipX werd gebruikt om het enzym te kristalliseren door tegendiffusie in aanwezigheid van ammoniumsulfide als kristalliserend middel. Bij-piramidale kristallen verschenen langs de kanalen, na een paar dagen incubatie bij 20 graden Celsius. De fluorescerende etikettering van het eiwit vergemakkelijkte de identificatie van eiwitkristallen en hun discriminatie van zoutkristallen.Een reeks kristallen werd ter plaatse en bij kamertemperatuur geanalyseerd. Hun diffractiegegevens werden samengevoegd en leidden tot de kristalstructuur van het APOE-enzym bij een resolutie van 2,5 angstrom. Bovendien werd de diffuse omgeving in chipkanalen benut om een substraat te leveren aan het enzym dat de kristallen opbouwt.In dit geval werd twee dagen voor de synchrotronanalyse een CTP-analoog aan de reservoiroplossingen toegevoegd. Hierdoor kon de verbinding diffuus worden en de katalytische plaats van het enzym bereiken. Zoals te zien is in de kristalstructuur van het complex bepaald bij een resolutie van 2,3 angstrom.Het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, is algemeen toepasbaar en is getest op verschillende biomoleculen. Tot slot is ChipX een Lab-chiptool die alle stappen van een kristallografisch onderzoek integreert en waarmee u van de biomedische oplossing naar de kristalstructuur gaan in een uniek microfluïdisch apparaat. Bedankt voor het bekijken van deze video.en we hopen dat we u hebben overtuigd van de voordelen van het gebruik van ChipX om de kristalstructuur van uw favorieten door Biomolecule te kristalliseren en te bepalen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...