Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

लेखकों ने वीडियो संपादन और एसएफएक्स में अपनी सहायता के लिए वॉयसओवर और फ्रैंकोइस श्नेल (यूनीवर्सिट डी स्ट्रासबर्ग) की रिकॉर्डिंग के लिए, संरचना शोधन में उनके योगदान के लिए, क्लेरिसा वर्स्डेल, संरचना शोधन में उनके योगदान के लिए बीमलाइन X10SA (PXII) और X06DA (PXIII) पर परियोजना के लिए बीमटाइम आवंटन के लिए स्विस लाइट सोर्स (विलिगेन, स्विट्जरलैंड) को स्वीकार करते हैं। इस काम को फ्रेंच सेंटर नेशनल डी ला रेचेचे Scientifique (CNRS), स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, LabEx कंसोर्टियम "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), फ्रेंच राष्ट्रीय कार्यक्रम "Investissements डी Avenir", फ्रांसीसी जर्मन विश्वविद्यालय (UFA-DFH, अनुदान नहीं) से केआर के लिए एक पीएचडी धन के फ्रेम में स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के उत्कृष्टता पहल (IdEx) से आरडब्ल्यू के लिए एक पीएचडी धन । सीटी-30-19), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (अनुदान नहीं । मो 634/10-1) । लेखकप्रोप ह्यूबर्ट क्यूरेन सहयोग कार्यक्रम (फ्रांसीसी विदेश मंत्रालय और ड्यूशर अकादमीशर ऑस्टौश्डिएंस्ट) से लाभान्वित हुए।

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization.">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization.">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li><li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification.">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li><li>Betat, H., Rammelt, C., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+nucleotidyltransferases:+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization.">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li><li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

बायोक्रिस्टॉलोग्राफी में वर्तमान प्रोटोकॉल में वाष्प प्रसार या बैच13,14जैसे तरीकों का उपयोग करके क्रिस्टल की तैयारी और क्रायोजेनिक स्थितियों में नाइट्रोजन जेट में विवर्तन विश्लेषण करने से पहले क्रायो-कूलिंग15,16 के लिए एक माइक्रोलूप में उनका हस्तांतरण शामिल है। इसके विपरीत, चिपएक्स3 में प्रत्यक्ष क्रिस्टल क्रायो-कूलिंग संभव नहीं है और क्रिस्टल को उनके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल से नहीं निकाला जा सकता है, जिसे इस सेटअप की सीमाओं के रूप में देखा जा सकता है। हालांकि, लेख में वर्णित प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर क्रिस्टल संरचनाओं के निर्धारण के लिए एक पूरी तरह से एकीकृत पाइपलाइन प्रदान करता है (यानी, अधिक शारीरिक परिस्थितियों में)। हालांकि कमरे के तापमान पर डेटा संग्रह विकिरण क्षति19की वृद्धि का कारण बनता है, इस प्रभाव को तेजी से डेटा अधिग्रहण समय (प्रत्येक क्रिस्टल पर अधिकतम 60 डिग्री रोटेशन एकत्र किया जाता है) और कई आंशिक डेटासेट के विलय से प्रतिसंतुलित किया जाता है। पृष्ठभूमि बिखरने और विवर्तन सिग्नल तनुपन3को कम करने के लिए चिपएक्स डिजाइन और सामग्री दोनों को अनुकूलित किया गया था, और डेटा संग्रह क्रिस्टल पर किया जा सकता है जो चैनलों (40 माइक्रोन) 4 के आधे आकार के बराबरआयामोंके साथ किया जा सकता है।
संक्षेप में, प्रोटोकॉल के मुख्य फायदे निम्नलिखित हैं। क्रिस्टल एक संवहन मुक्त वातावरण (माइक्रोफ्लुइडिक चैनल) में उत्पादित होते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल के विकास के लिए बहुत अनुकूल है। चिपएक्स में लागू काउंटर-प्रसार विधि सुपरसैचुरेशन परिदृश्य की स्क्रीनिंग में बहुत कुशल है; चिप चैनल में क्रिस्टलेंट के प्रसार एक एकाग्रता और सुपरसैचुरेशन वेव कि उचित नाभिक और विकास की स्थिति5निर्धारित करने में मदद करता है बनाता है . क्रिस्टल को कभी भी सीधे नहीं संभाला जाता है, लेकिन चिप के अंदर सीटू में विश्लेषण किया जाता है, जो उनके वास्तविक विवर्तन गुणों को बरकरार रखता है (यानी, शारीरिक बातचीत या क्रायोकूलिंग द्वारा क्रिस्टल मोज़ेकता को नहीं बदलता है)20। विवर्तन विश्लेषण विकिरण क्षति को कम करने के लिए कम खुराक जोखिम के साथ चिप चैनलों के साथ वितरित क्रिस्टल की एक श्रृंखला पर किया जाता है, और श्रृंखला से आंशिक डेटा को मिलाकर एक पूर्ण डेटासेट इकट्ठा किया जाता है। चिपएक्स के मानक पदचिह्न और सरल डिजाइन भविष्य में सिंक्रोट्रॉन या एक्सफेल सुविधाओं का उपयोग करके सीटू डेटा संग्रह में पूर्ण स्वचालन की अनुमति देंगे। प्रोटोकॉल के सभी कदम चिपएक्स में किए जाते हैं। प्रयोगकर्ता बिंदु-दृश्य से, चिप सेटअप मानक पिपेट के साथ प्रदर्शन करने के लिए सरल और आसान है और किसी अतिरिक्त उपकरण की आवश्यकता नहीं है। नमूना प्रवेश पर पेड़ की तरह चैनल कनेक्शन प्रणाली में मृत मात्रा को कम करता है, जो महत्वपूर्ण है जब नमूनों के साथ काम कर रहे है कि शुद्ध करने के लिए मुश्किल है या कि केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं ।
अंत में, चिपएक्स में लागू लैब-ऑन-ए-चिप दृष्टिकोण काउंटर-प्रसार और क्रिस्टल संरचना निर्धारण द्वारा क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया को सरल और कुशलता से कम करता है, जिससे नमूना से एक ही डिवाइस में इसकी 3 डी संरचना में जाने की अनुमति होती है। यह व्यापक रूप से लागू है और कमरे के तापमान पर नियमित धारावाहिक बायोक्रिस्टलोग्राफी जांच के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, लागत प्रभावी समाधान प्रदान करता है।

क्रिस्टलोग्राफी जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के 3 डी आर्किटेक्चर को समझने की एक विधि है। उत्तरार्द्ध यह समझना महत्वपूर्ण है कि एक एंजाइम अपने सब्सट्रेट्स का चयन और प्रक्रिया कैसे करता है। क्रिस्टल संरचना के निर्धारण के लिए लक्ष्य मैक्रोमॉल्यूल के क्रिस्टलीकरण और एक्स-रे विवर्तन1द्वारा उनके विश्लेषण के लिए क्रिस्टल की कंडीशनिंग की आवश्यकता होती है। क्रिस्टल तैयारी और हैंडलिंग दोनों महत्वपूर्ण लेकिन नाजुक कदम हैं जो क्रिस्टल गुणवत्ता और विवर्तन गुणों को प्रभावित कर सकते हैं, और इस प्रकार, परिणामस्वरूप 3 डी संरचना का संकल्प (यानी, सटीकता) । उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल की तैयारी को सुविधाजनक बनाने और उनके विवर्तन गुणों को संरक्षित करने के लिए अनावश्यक हैंडलिंग को खत्म करने के लिए,हमने चिपएक्स2,3,4नामक उपयोगकर्ता के अनुकूल और बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तैयार किया।
इस लेख में, हम यह प्रदर्शित करेंगे कि काउंटर-प्रसार द्वारा क्रिस्टल तैयार करने के लिए पारंपरिक प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग करके चिपएक्स चैनलों में प्रोटीन समाधान को कैसे लोड किया जाए। यह क्रिस्टलीकरण विधि क्रिस्टलाइजिंग एजेंट5,6के प्रसार से उत्पन्न एकाग्रता ढाल के कारण एंजाइम समाधान वाले एंजाइम समाधान वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ अतिसतर्क और संभावित नाभिक स्थितियों की एक कुशल स्क्रीनिंग प्रदान करती है ।
चिप सेटअप सरल है, यह केवल मानक प्रयोगशाला pipets का उपयोग करता है और किसी भी महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है। जब चिपएक्स में क्रिस्टल बड़े हो गए हैं, तो एंजाइम के लिगामेंट्स को प्रसार द्वारा पेश किया जा सकता है। विवर्तन डेटा तो एक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोत का उपयोग कर चिप के चैनलों में निहित क्रिस्टल की एक श्रृंखला पर कमरे के तापमान पर एकत्र कर रहे हैं । यहां वर्णित संरचनात्मक अध्ययन ने अपने एपीओ रूप में एक ट्रान परिपक्वता एंजाइम की संरचनाओं का निर्धारण किया और परिसर में भिगोने के द्वारा पेश किए गए अपने सीटीपी सब्सट्रेट के अनुरूप के साथ। सीसीए-एडिंग एंजाइम नामक यह प्रोटीन टीआरएनए के 3 ' अंत में सीसीए ट्राइन्यूक्लियोटाइड पूंछ को बहुलित करता है । धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी द्वारा प्राप्त दो 3 डी छवियों की तुलना उन स्थितियों में लिगांड के बंधन से संबंधित स्थानीय अनुरूप परिवर्तनों का पता चलता है जो क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में अधिक शारीरिक हैं। इस वीडियो में वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी बायोमॉलिक्यूल पर लागू होता है, चाहे वह प्रोटीन हो, न्यूक्लिक एसिड हो या मल्टी-कंपोनेंट कॉम्प्लेक्स हो ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

उनके एक्स-रे विश्लेषण से पहले अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल और उनकी हैंडलिंग की तैयारी बायोक्रिस्टाग्राफिक अध्ययन के दो महत्वपूर्ण कदम हैं। हम एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप का वर्णन करते हैं जो काउंटर-प्रसार की कुशल विधि द्वारा क्रिस्टल के उत्पादन को सक्षम बनाता है। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों द्वारा प्रदान किया गया संवहन मुक्त वातावरण क्रिस्टल विकास के लिए आदर्श है और क्रिस्टलीय एंजाइम की सक्रिय साइट में एक सब्सट्रेट को फैलाना उपयोगी है। यहां हमने प्रस्तुत उदाहरण में साइकोरोफिलिक जीवाणु प्लैनोकोकस हेलोक्रायोफिलस के सीसीए-एडिंग एंजाइम के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया। क्रिस्टलीकरण और सब्सट्रेट प्रसार/भिगोने के बाद, एंजाइम की क्रिस्टल संरचना: सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स को कमरे के तापमान पर धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी और चिप के अंदर सीधे कई क्रिस्टल के विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। पूरी प्रक्रिया नमूनों के वास्तविक विवर्तन गुणों को बरकरार रखता है क्योंकि इसके लिए कोई क्रिस्टल हैंडलिंग की आवश्यकता नहीं होती है।

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का वर्णन किया गया है जो काउंटर-प्रसार विधि का उपयोग करके एंजाइम के क्रिस्टलीकरण को सक्षम बनाता है, भिगोने से क्रिस्टल में सब्सट्रेट की शुरूआत, और एंजाइम का 3 डी संरचना निर्धारण: कमरे के तापमान पर चिप के अंदर क्रिस्टल के सीरियल विश्लेषण द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स।

एक एंजाइम का क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक निर्धारण: एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

नमस्ते, और स्ट्रासबर्ग में आणविक और सेल जीव विज्ञान संस्थान में प्रयोगशाला वास्तुकला और आरएनए की प्रतिक्रियाशीलता में आपका स्वागत है। किसी भी क्रिस्टलीय अध्ययन में अच्छी तरह से डेफ्रीटीइंग क्रिस्टल बढ़ रहा है। इस वीडियो में, हम एक बायोमॉलिक्यूल के क्रिस्टल विकसित करने और सीटू एक्स-रे विवर्तन द्वारा इसकी 3डी संरचना निर्धारित करने के लिए एक नए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण के उपयोग को प्रदर्शित करेंगे।चिपएक्स नामक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस कई फायदे प्रस्तुत करता है। यह काउंटर-प्रसार की विधि से क्रिस्टलीकरण परिसंपत्तियों को छोटा करने और सुविधाजनक बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसकी स्थापना आसान है और मानक प्रयोगशाला सामग्री के साथ प्रदर्शन किया।यह सीरियल एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा चिप में उगाए गए क्रिस्टल के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन के लिए भी अनुकूलित है। चिपएक्स क्रिस्टल हैंडलिंग और क्रायो-कूलिंग चरणों को समाप्त करता है और क्रिस्टल की आंतरिक गुणवत्ता को बरकरार रखता है जिसका विश्लेषण सीटू और कमरे के तापमान पर किया जाता है। चिपएक्स में माइक्रोस्कोप स्लाइड का प्रारूप है, 7.5 बाय 2.5 सेंटीमीटर।इसमें क्रिस्टलीकरण कक्षों के रूप में उपयोग किए जाने वाले आठ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल होते हैं, जिनमें 80 बाय 18 माइक्रोमीटर और चार सेंटीमीटर की लंबाई होती है। बाएं हाथ की ओर इनलेट बायोमॉलिक्यूल समाधान के मैनुअल इंजेक्शन की अनुमति देता है जो जलाशयों तक आठ चैनलों को भर देगा। इन जलाशयों में दाएं हाथ की ओर क्रिस्टलाइजेशन सॉल्यूशंस जमा किए जाते हैं।क्रिस्टलीकरण काउंटर प्रसार नामक घटना से शुरू होता है। जब क्रिस्टलीकरण एजेंट बायोमॉलिक्यूल समाधान में फैलता है और एकाग्रता और एक सुपर संतृप्ति ढाल बनाता है। चैनलों के साथ लेबल और बोस्ट क्रिस्टल को अधिक आसानी से खोजने में मदद करते हैं।एक चिप स्थापित करने के लिए पांच से 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एक विशिष्ट एकाग्रता पर बायोमॉल्यूल समाधान के पांच से छह माइक्रोलीटर की आवश्यकता होती है। एक माइक्रोलीटर पैराफिन तेल, प्रति जलाशय क्रिस्टलीकरण समाधान के पांच माइक्रोलीटर और चिपकने वाला टेप। चिपएक्स की लोडिंग माइक्रोपिपेट और मानक युक्तियों के साथ मैन्युअल रूप से की जाती है।इंजेक्शन प्रक्रिया के बेहतर दृश्य के लिए इस उदाहरण में एक नीले रंग का नमूना समाधान का उपयोग किया जाता है। रिसाव से बचने के लिए, टिप चिप के लिए लंबवत नमूना में डाला जाता है। चैनलों को एक दूसरे से अलग करने के लिए सैंपल के बाद पैराफिन ऑयल का एक माइक्रोलीटर लोड किया जाता है।इसके बाद सैंपल इनलेट को टेप से सील कर दिया जाता है। आठ जलाशयों को व्यक्तिगत रूप से क्रिस्टलाइजिंग एजेंट समाधान के पांच माइक्रोलीटर के साथ लोड किया जाता है। ऐसा करने के लिए, पिपेट टिप को चैनल के अंत के करीब 45 डिग्री के कोण पर रखा जाता है।यह नमूना और क्रिस्टलीकरण एजेंट के बीच एक हवा बुलबुले के गठन को रोकता है। जलाशयों को स्क्रीनिंग या अनुकूलन के लिए विभिन्न बफ़र्स, पॉलिमर या लवण, एट सेटेरा युक्त कॉकटेल से भरा जा सकता है। जलाशयों को टेप से सील कर दिया जाता है।जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, एक चिप स्थापित करना आसान है और इसमें केवल कुछ मिनट लगते हैं। चिपएक्स में, क्रिस्टलीकरण काउंटर प्रसार द्वारा होता है। जलाशयों में जमा किए गए सघन एजेंट बायोमॉलिक्यूल वाले चैनलों में फैलते हैं।यह एकाग्रता और सुपर संतृप्ति के ढाल बनाता है जो क्रिस्टलीकरण को ट्रिगर करेगा। ये चैनलों के अंदर प्राप्त एंजाइम के क्रिस्टल के उदाहरण हैं। वे उन चैनलों को भरने के लिए बढ़ सकते हैं जिनके पास 80 बाय 80 माइक्रोमीटर का क्रॉस सेक्शन होता है।यूवी प्रकाश के तहत ट्रिप्टोफान अवशेषों के प्राकृतिक फ्लोरेसेंस का उपयोग करके फ्लोरेसेस माइक्रोस्कोपी द्वारा चिपएक्स में क्रिस्टल आसानी से पता लगाया जा सकता है, या जैसा कि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन का उपयोग करके यहां दिखाया गया है। इस खंड से पता चलता है एक क्रिस टेलीग्राफी विश्लेषण filaggrins स्विट्जरलैंड में स्विस प्रकाश स्रोत पर प्रदर्शन किया । चिप्स को बिना किसी अतिरिक्त उपकरण या विशेष देखभाल के सिंक्रोट्रॉन में ले जाया जा सकता है।चलो स्विस प्रकाश स्रोत के हॉल में प्रवेश करते हैं। इलेक्ट्रॉन केंद्रीय रिंग में प्रसारित होते हैं और विभिन्न बीमलाइन पर शोषित एक्स-रे सहित विद्युत चुम्बकीय तरंगों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम उत्पन्न करते हैं। यह वीडियो X06 पर दर्ज किया गया था, जो मैक्रो-मॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी को समर्पित एक बीमलाइन है ।प्रोटोकॉल एक सिंक्रोट्रॉन सुविधा से दूसरे में बदल सकता है, लेकिन समग्र सिद्धांत एक ही रहता है। चिपएक्स 3डी प्रिंटेड होल्डर पर रखा गया है। यह धारक तब एक मानक गोनियोमीटर के चुंबक से जुड़ा होता है।धारावाहिक विश्लेषण लगातार चिप में उगाए गए क्रिस्टल की एक श्रृंखला से डेटा एकत्र कर रहा है । क्रिस्टल पदों की सूची चिप चैनलों के साथ लेबल और बोस्ट का उपयोग कर स्थापित कर रहे हैं । शोधकर्ताओं ने चिप को पीले रंग की खिड़की के प्रतीक एक्स-रे बीम में क्रिस्टल को केंद्र में ले जाते हैं ।एक्स-रे बीम का उपयोग करके एक तेज केंद्रित प्रक्रिया शुरू की जाती है। बीम स्टॉप जगह में चला जाता है और डिटेक्टर नमूना की ओर बढ़ता है । ग्रिड स्क्रीनिंग यह सुनिश्चित करने के लिए की जाती है कि क्रिस्टल बीम के साथ गठबंधन किया जाए।चिप को 30 डिग्री तक घुमाने के बाद यही प्रक्रिया दोहराई जाती है। दूसरा कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि चिप सामग्री एक पैरालैक्स प्रभाव बनाती है जो मनाया क्रिस्टल स्थिति के संबंध में अधिकतम विवर्तन के बदलाव की ओर जाता है । जैसे ही क्रिस्टल बीम में केंद्रित होता है डेटा संग्रह शुरू होता है।यह अनुक्रम वास्तविक समय में डेटा संग्रह दिखाता है। चिप 30 डिग्री तक घूमती है। इस बीच, इसी विवर्तन छवियों डिटेक्टर द्वारा एकत्र कर रहे हैं ।इस क्रिस्टल का लक्षण वर्णन पूरा हो गया है। चैनल में अगले क्रिस्टल में अनुवादित चिप और पूरी प्रक्रिया दोहराई जाती है। ध्यान दें कि यह विश्लेषण क्रिस्टल की सीधी हैंडलिंग और कमरे के तापमान के बिना सीटू में संचालित किया जाता है।क्रिस्टल की एक श्रृंखला पर एकत्र किए गए डेटा को फिर एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट प्राप्त करने के लिए विलय कर दिया जाता है जिसका उपयोग नीले रंग में दिखाए गए इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र की गणना करने और परमाणु मॉडल बनाने के लिए किया जाता है। इस वीडियो में वर्णित प्रक्रिया tRNA संशोधन एंजाइम के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के फ्रेम में लागू किया गया था । ठंड अनुकूलित जीवाणु, प्लैनोकोकस हेलोक्रायोफिलस से सीसीए जोड़ने वाला एंजाइम।चिपएक्स का उपयोग एक क्रिस्टलीय एजेंट के रूप में अमोनियम सल्फाइड की उपस्थिति में काउंटर प्रसार द्वारा एंजाइम को क्रिस्टलाइज करने के लिए किया गया था। 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के कुछ दिनों के बाद, चैनलों के साथ बाय-पिरामिड क्रिस्टल दिखाई दिए। प्रोटीन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग ने प्रोटीन क्रिस्टल की पहचान और नमक क्रिस्टल से उनके भेदभाव को सुगम बनाया ।सीटू और कमरे के तापमान पर क्रिस्टल की एक श्रृंखला का विश्लेषण किया गया था। उनके विवर्तन डेटा को मर्ज किया गया और 2.5 एंगस्ट्रॉम के संकल्प पर एपीओई एंजाइम की क्रिस्टल संरचना का नेतृत्व किया गया। इसके अलावा, चिप चैनलों में पर्यावरण के फैलाना एंजाइम है कि क्रिस्टल बनाता है करने के लिए एक सब्सट्रेट देने के लिए शोषण किया गया था ।वर्तमान मामले में, सिंक्रोट्रॉन विश्लेषण से दो दिन पहले जलाशय समाधानों में सीटीपी एनालॉग जोड़ा गया था। इससे यौगिक को फैलाना और एंजाइम की उत्प्रेरक साइट तक पहुंचने की अनुमति मिली। जैसा कि 2.3 एंगस्ट्रॉम के संकल्प पर निर्धारित परिसर की क्रिस्टल संरचना में देखा गया है।इस वीडियो में प्रदर्शित प्रोटोकॉल आम तौर पर लागू होता है और विभिन्न प्रकार के जैव अणुओं पर परीक्षण किया गया है। समाप्त करने के लिए चिपएक्स एक लैब चिप उपकरण है जो क्रिस्टलीय अध्ययन के सभी चरणों को एकीकृत करता है और आपको एक अद्वितीय माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में क्रिस्टल संरचना के बायोमेडिकल समाधान से जाने की अनुमति देता है। इस वीडियो को देखने के लिए धन्यवाद।और हमें उम्मीद है कि हमने आपको बायोमॉल्यूल द्वारा अपने पसंदीदा की क्रिस्टल संरचना को क्रिस्टलाइज करने और निर्धारित करने के लिए चिपएक्स का उपयोग करने के लाभों के बारे में आश्वस्त किया है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और की संरचना निर्धारण<em&gt; सी। बेलगाम</em&gt; PPEP -1 Microseeding और जिंक-शिरोमणि अकाली दल के माध्यम से

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

एक पानी में तेल पायस की centrifugation द्वारा विशालकाय Vesicles encapsulating microspheres की तैयारी

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

मानव IKK1 के उत्पादन, क्रिस्टलीकरण, और संरचना निर्धारण के लिए एक गाइड α/

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...