Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Gli autori riconoscono la Swiss Light Source (Villigen, Svizzera) per l'assegnazione beamtime al progetto sulle travi X10SA (PXII) e X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm per il suo contributo alla raffinatezza della struttura, Clarissa Worsdale per la registrazione della voce fuori campo e François Schnell (Université de Strasbourg) per la sua assistenza nell'editing video e SFX. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro francese national de la Recherche Scientifique (CNRS), dall'Università di Strasburgo, il consorzio LabEx "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), un finanziamento di dottorato a R.dW dall'iniziativa Excellence (IdEx) dell'Università di Strasburgo nell'ambito del programma nazionale francese "Investissements d'Avenir", un finanziamento di dottorato a K.R. dell'Università franco-tedesca (UFA-DFH, sovvenzione n. CT-30-19), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (sovvenzione n. Mo 634/10-1). Gli autori hanno beneficiato del programma di cooperazione PROCOPE Hubert Curien (Ministero degli Affari Esteri francese e Deutscher Akademischer Austauschdienst).

1. Impostazione di saggi di cristallizzazione in ChipX
NOTA: Il dispositivo microfluidico ChipX può essere ottenuto dagli autori. Una descrizione del chip è fornita nella figura 1. Le soluzioni contenenti l'agente cristallino (o cristallizzante) utilizzato per innescare la cristallizzazione possono essere di origine commerciale o preparate dallo sperimentatore.
<ol><li>Caricamento del campione di biomolecole NOTA: Il volume del campione effettivamente richiesto per eseguire un singolo saggio di contro-diffusione nella sezione retta di ogni canale di ChipX è di 300 nL. Tuttavia per comodità si consiglia di caricare 5 μL per riempire completamente gli otto canali tenendo conto della lunghezza variabile della loro sezione curva e dei volumi morti di ingresso.<ol>
<li>Pipetta 5 μL di soluzioni enzimatica utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL.</li>
		<li>Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare la soluzione fino a quando gli otto canali non vengono riempiti fino all'estremità opposta (ingresso del serbatoio cristallino).</li>
		<li>Iniettare 1 μL di olio di paraffina nell'ingresso del campione per scollegare i canali l'uno dall'altro.</li>
		<li>Recuperare la soluzione extra nel serbatoio cristallino all'estremità di ogni canale utilizzando una pipetta standard da 10 μL.</li>
		<li>Sigillare l'ingresso del campione con un pezzo di nastro da 1 cm x 1 cm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caricamento delle soluzioni di cristallizzazione<ol>
<li>Pipetta 5 μL di soluzione di cristallizzazione utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. Il volume del serbatoio è di 10 μL, ma il caricamento di solo la metà evita il traboccamento durante la sigillatura con nastro adesivo e facilita l'ulteriore aggiunta di ligando per gli esperimenti di ammollo. Se le condizioni iniziali di cristallizzazione sono state ottenute per diffusione del vapore, aumentare la concentrazione cristallina di un fattore 1,5 - 2. Le soluzioni possono essere diverse in ogni serbatoio (nel caso presentato, 1 M fosfato di idrogeno diammonio, acetato di sodio da 100 mM, pH 4,5 è stato utilizzato in tutto).</li>
		<li>Orientare la punta del tubo verso l'ingresso del canale nella parte a forma di imbuto del serbatoio per evitare la formazione di una bolla d'aria al momento della deposizione della soluzione. Impedirebbe il contatto tra le due soluzioni e la diffusione cristallina nel canale.</li>
		<li>Iniettare la soluzione cristallina nel serbatoio.</li>
		<li>Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro da 2,5 cm x 1 cm.</li>
		<li>Incubare il truciolo a 20 °C (la temperatura può essere regolata a seconda del bersaglio, in genere tra 4 e 37 °C 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etichettatura proteica con carboxyrhodamine per il rilevamento della fluorescenza
NOTA: questo passaggio è facoltativo. Deve essere eseguito prima del caricamento del campione per facilitare il rilevamento dei cristalli nel chip utilizzando la fluorescenza. Il metodo dettagliato di etichettatura fluorescente in traccia è stato descritto da Pusey e dai colleghi7. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
<ol><li>Sciogliere 5 mg di polvere di estere carboxyrhodamina in 1 mL dimetil-formamide anidro, dividere la soluzione in aliquote da 0,6 μL da conservare a -20 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di na-borato da 1 M pH 8,75.</li>
	<li>Diluire il titolo per preparare il tampone di reazione a 0,05 M Na-borato pH 8,75.</li>
	<li>Risciacquare una colonna di desalinizzazione (7 kDa MWCO, 0,5 mL) con 800 μL di tampone di reazione.</li>
	<li>Centrifugare la colonna per 1 minuto a 1400 x g, rimuovere il filtrato.</li>
	<li>Ripetere questa operazione due volte (passaggi 2.4-2.5) per lavare la colonna.</li>
	<li>Depositare 80 μL di proteine nel suo tampone di stoccaggio sulla colonna (la proteina può essere diluita fino a 1 mg /mL per aumentare il volume se necessario).</li>
	<li>Centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g. Questo passaggio ha lo scopo di trasferire la proteina dal suo buffer di stoccaggio al tampone di reazione.</li>
	<li>Recuperare il flusso attraverso (contenente la proteina nel tampone di reazione) e mescolarlo con 0,6 μL di soluzione di carboxyrhodamina.</li>
	<li>Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Nel frattempo, sciacquare la colonna 3 x con il tampone di stoccaggio, centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g e scartare il filtrato.</li>
	<li>Depositare la soluzione di reazione sulla colonna.</li>
	<li>Centrifugare la colonna per 1 min a 1400 x g e recuperare il flusso (cioè la soluzione di proteine etichettate nel suo tampone di stoccaggio).</li>
	<li>Integrare la soluzione proteica stock con lo 0,1-1 % (w/w) di proteine etichettate.</li>
	<li>Impostare i test di cristallizzazione ChipX come descritto nella sezione 1.</li>
	<li>Verificare la presenza di cristalli proteici nei test eccitanti la sonda fluorescente con una sorgente luminosa a lunghezza d'onda di 520 nm.</li>
</ol>3. Osservazione del cristallo
NOTA: Il dispositivo ChipX può essere maneggiato senza particolari cure, anche con cristalli all'interno, tranne se la temperatura deve essere controllata.
<ol><li>Utilizzare qualsiasi stereomicroscopio per verificare l'esito dei test di cristallizzazione in ChipX. Il suo ingombro ha le dimensioni standard delle diapositive del microscopio ed è compatibile con qualsiasi sistema e porta scorrevole.</li>
	<li>Controllare il contenuto dei canali microfluidici a partire dal serbatoio in cui la concentrazione cristallina è la più alta all'ingresso del campione dove la concentrazione cristallina è la più bassa. Il materiale ChipX è trasparente alla luce visibile, compatibile con l'uso di polarizzatori, nonché con l'illuminazione UV per l'identificazione del cristallo proteico mediante fluorescenza del triptofanointrinseco 8.</li>
	<li>Registrare le posizioni dei cristalli utilizzando le etichette goffrate lungo i canali o contrassegnare le posizioni dei cristalli con un marcatore permanente disegnando punti di colore accanto ad essi sulla superficie del truciolo.</li>
</ol>4. Cristallo in ammollo con ligandi
NOTA: questa procedura è facoltativa. Viene utilizzato per introdurre ligandi, substrati enzimatici o atomi pesanti nei cristalli e deve essere effettuato almeno 24-48 ore prima dell'analisi a raggi X per consentire la diffusione del composto lungo i canali e nei cristalli.
<ol><li>Rimuovere delicatamente il nastro di tenuta dai serbatoi.</li>
	<li>Aggiungere fino a 5 μL di soluzione di ligando in uno o più serbatoi utilizzando un micropipeto da 10 μL (nell'esempio, sono stati aggiunti 3 μL di 10 mM di citidina-5'-[(α,β)-metilleno] trifosfato (CMPcPP) per raggiungere una concentrazione finale di 3,75 mM). CMPcPP è un analogo non idrolabile del CTP, un substrato naturale dell'enzima.</li>
	<li>Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro da 2,5 cm x 1 cm.</li>
	<li>Incubare il chip a temperatura controllata per 24-48 ore per consentire la diffusione del ligando lungo i canali del chip.</li>
</ol>5. Analisi dei cristalli mediante cristallografia seriale
NOTA: Questa parte del protocollo deve essere adattata a seconda della configurazione della linea di fascio e delle proprietà di diffrazione dei cristalli. Vengono fornite solo indicazioni generali per l'analisi cristallografica basata su esperimenti eseguiti sulla linea di fascio X06DA (SLS, Villigen, Svizzera).
<ol><li>Montaggio ChipX sul goniometro beamline NOTA: Il file per la stampa 3D del supporto ChipX è fornito in ref4.<ol>
<li>Spegnere il crio-getto della linea di fascio. L'analisi qui viene eseguita a temperatura ambiente.</li>
		<li>Montare il ChipX su un supporto dedicato con il canale contenente i cristalli da analizzare posizionati al centro del supporto. Il supporto ChipX4 non richiede alcuna vite o parte aggiuntiva, in quanto è stato progettato per fornire una vestibilità perfetta per ChipX.</li>
		<li>Attaccare il supporto al goniometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta dati<ol>
<li>Orientare lo strato più spesso (strato superiore, Figura 1) di ChipX (in questo orientamento le etichette lungo i canali sono leggibili direttamente utilizzando la telecamera di centraggio della linea di fascio), verso il fascio diretto e la faccia più sottile dietro il cristallo per ridurre al minimo l'attenuazione del segnale diffratta come descritto nell'arbitro3.</li>
		<li>Per evitare collisioni di ChipX con il materiale circostante (beamstop, collimatore), limitare i movimenti del goniometro nell'intervallo ±30° (0° corrispondente ai canali perpendicolari al fascio di raggi X).</li>
		<li>Trova la posizione dei cristalli con l'aiuto delle etichette goffrate lungo i canali.</li>
		<li>Selezionare una posizione di cristallo.</li>
		<li>Centrare il cristallo mediante griglia standard a bassa dose/screening raster o procedura con 1 clic (il video mostra un esempio di screening della griglia).</li>
		<li>Raccogliere dati di diffrazione nell'intervallo -30° / +30°.</li>
		<li>Riavviare la procedura ai passaggi 5.2.4-5.2.6 su un altro cristallo nello stesso canale dopo la traduzione del chip.</li>
		<li>Riallineare manualmente un altro canale ChipX al centro del supporto e portare avanti la raccolta dei dati sui cristalli presenti in questo canale.</li>
		<li>Utilizzare pacchetti e procedure cristallografiche standard per elaborare e unire i dati, quindi per risolvere e perfezionare la struttura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. 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G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli attuali protocolli in biocristallografia prevedono la preparazione di cristalli con metodi come la diffusione del vapore o il lotto13,14, e il loro trasferimento in un microloop per il crioraffreddamento15,16 prima di eseguire l'analisi di diffrazione in un getto di azoto in condizioni criogeniche. Al contrario, il crioraffreddamento diretto del cristallo non è possibile in ChipX3 e i cristalli non possono essere estratti dal loro canale microfluidico, che può essere visto come limitazioni di questa configurazione. Tuttavia, il protocollo descritto nell'articolo fornisce una tubazione completamente integrata per la determinazione delle strutture cristalline a temperatura ambiente (cioè in condizioni più fisiologiche). Anche se la raccolta dei dati a temperatura ambiente causa un aumento dei danni daradiazioni 19, questo effetto è controbilanciato da un rapido tempo di acquisizione dei dati (un massimo di 60 ° di rotazione viene raccolto su ogni cristallo) e dalla fusione di diversi set di dati parziali. Sia il design ChipX che il materiale sono stati ottimizzati per ridurre la dispersione dello sfondo e l'attenuazione del segnale di diffrazione3e la raccolta dei dati può essere eseguita su cristalli con dimensioni equivalenti alla metà delle dimensioni dei canali (40 μm)4.
Per riassumere, i principali vantaggi del protocollo sono i seguenti. I cristalli sono prodotti in un ambiente privo di convezione (canali microfluidici), che è molto favorevole alla crescita di cristalli di alta qualità. Il metodo di contro-diffusione implementato in ChipX è molto efficiente nello screening del panorama della supersaturazione; la diffusione dei cristallizzatori nel canale del chip crea un'onda di concentrazione e supersaturazione che aiuta a determinare le condizioni appropriate di nucleazione ecrescita 5. I cristalli non vengono mai maneggiati direttamente, ma vengono analizzati in situ, all'interno del chip, che conserva le loro reali proprietà di diffrazione (cioè, non altera la mosaicità cristallina per interazione fisica o crioraffreddamento)20. L'analisi di diffrazione viene eseguita su una serie di cristalli distribuiti lungo i canali del chip con bassa esposizione alla dose per ridurre al minimo i danni da radiazioni, e un set di dati completo viene assemblato unendo dati parziali della serie. L'ingombro standard e il design semplice di ChipX consentiranno in futuro una completa automazione della raccolta dei dati in situ utilizzando impianti synchrotron o XFEL. Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite in ChipX. Dal punto di vista dello sperimentatore, la configurazione del chip è semplice e facile da eseguire con i tubi standard e non richiede alcuna apparecchiatura aggiuntiva. La connessione del canale ad albero nell'ingresso del campione riduce al minimo i volumi morti nel sistema, il che è importante quando si lavora con campioni difficili da purificare o disponibili solo in quantità limitata.
In conclusione, l'approccio lab-on-a-chip implementato in ChipX semplifica e miniaturizza in modo efficiente il processo di cristallizzazione mediante contro-diffusione e determinazione della struttura cristallina, consentendo di passare dal campione alla sua struttura 3D in un unico dispositivo. È ampiamente applicabile e offre una soluzione intuitiva ed economica per le indagini seriali di biocristollography di routine a temperatura ambiente.

La cristallografia è un metodo per decifrare l'architettura 3D delle macromolecole biologiche. Quest'ultimo è importante per capire come un enzima seleziona ed elabora i suoi substrati. La determinazione di una struttura cristallina richiede la cristallizzazione della macromolecola bersaglio e il condizionamento dei cristalli per la loro analisi mediante diffrazione a raggi X1. Sia la preparazione che la movimentazione dei cristalli sono passaggi cruciali ma delicati che possono influire sulla qualità cristallina e sulle proprietà di diffrazione e, quindi, sulla risoluzione (cioè la precisione) della struttura 3D risultante. Per facilitare la preparazione di cristalli di alta qualità ed eliminare la maneggevolezza non necessaria per preservarne le proprietà di diffrazione, abbiamo progettato un dispositivo microfluidico intuitivo e versatile chiamato ChipX2,3,4.
In questo articolo, dimostreremo come caricare la soluzione proteica nei canali ChipX utilizzando materiale di laboratorio convenzionale per preparare i cristalli mediante contro-diffusione. Questo metodo di cristallizzazione fornisce un efficace screening della supersaturazione e delle potenziali condizioni di nucleazione lungo i canali microfluidici contenenti la soluzione enzimatica dovuta al gradiente di concentrazione generato dalla diffusione dell'agentecristallizzante 5,6.
La configurazione del chip è semplice, utilizza solo pipette di laboratorio standard e non richiede apparecchiature costose. Quando i cristalli sono cresciuti in ChipX, i ligandi dell'enzima possono essere introdotti per diffusione. I dati di diffrazione vengono quindi raccolti a temperatura ambiente su una serie di cristalli contenuti nei canali del chip utilizzando una sorgente di raggi X di sincrotrone. Lo studio strutturale qui descritto ha portato alla determinazione delle strutture di un enzima di maturazione del tRNA nella sua forma apo e in complesso con un analogo del suo substrato CTP introdotto dall'ammollo. Questa proteina chiamata enzima che aggiunge CCA polimerizza la coda trinucleotide CCA all'estremità 3 ' delle tRNA. Il confronto delle due immagini 3D ottenute per cristallografia seriale rivela i cambiamenti conformazionali locali legati al legame del ligando in condizioni più fisiologiche di quelle utilizzate nella criocristografia. Il protocollo descritto in questo video è generalmente applicabile a qualsiasi biomolecola, che si tratta di una proteina, di un acido nucleico o di un complesso multicomponente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

La preparazione di cristalli ben diffratti e la loro manipolazione prima della loro analisi a raggi X sono due fasi critiche degli studi biocristalografici. Descriviamo un versatile chip microfluidico che consente la produzione di cristalli con l'efficiente metodo di contro-diffusione. L'ambiente privo di convezione fornito dai canali microfluidici è ideale per la crescita del cristallo e utile per diffondere un substrato nel sito attivo dell'enzima cristallino. Qui abbiamo applicato questo approccio all'enzima che aggiunge il CCA del batterio psicrofilo Planococcus halocryophilus nell'esempio presentato. Dopo la cristallizzazione e la diffusione/ammollo del substrato, la struttura cristallina del complesso enzima:substrato è stata determinata a temperatura ambiente dalla cristallografia seriale e dall'analisi di più cristalli direttamente all'interno del chip. L'intera procedura preserva le proprietà di diffrazione autentiche dei campioni perché non richiede alcuna manipolazione del cristallo.

Il chip microfluidico qui descritto è stato progettato per consentire una facile configurazione dei saggi di cristallizzazione e l'analisi dei cristalli a temperatura ambiente. La procedura sopra descritta e nel video è stata applicata nel quadro della caratterizzazione strutturale dell'enzima che aggiunge cca dal batterio Planococcus halocryophilus adattato a freddo. Questo enzima appartiene a una famiglia essenziale della polimerasi che catalizza l'aggiunta sequenziale della sequenza CCA 3' su tRNA utilizzando CTP e ATP9,10.
Il chip è stato utilizzato per la prima volta per preparare cristalli dell'enzima per l'analisi strutturale con il metodo della contro-diffusione. A tal fine, la soluzione enzimatica è stata caricata negli otto canali microfluidici (camere di cristallizzazione) da una singola iniezione nell'ingresso del campione del chip (cfr. figura 1). L'enzima è stato utilizzato a 5,5 mg/mL nel suo tampone di stoccaggio contenente 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl e 5 mM MgCl2. Questo passaggio è stato eseguito manualmente con un micropipetto standard da 10 μL. Le soluzioni di cristallizzazione (100 mM di acetato di sodio pH 4,5,1 M fosfato di idrogeno diammonio) sono state quindi depositate nei serbatoi all'altra estremità dei canali.
La procedura di caricamento è semplice e non richiede più di cinque minuti (Figura 2). Il cristallizzatore si diffonde quindi nei canali, crea un gradiente di concentrazione che innesca nucleazione cristallina e crescita. Questo gradiente si evolve dinamicamente ed esplora un continuum di stati di supersaturazione5,6 fino a raggiungere un equilibrio di concentrazione cristallina tra i canali e il serbatoio. I test di cristallizzazione sono tipicamente controllati sotto il micoscopio per un periodo di 2 - 4 settimane per tenere traccia della crescita dei cristalli. Cristalli bipiracidi dell'enzima che aggiunge il CCA sono apparsi su tutti i canali dopo alcuni giorni di incubazione a 20 °C (Figura 3). L'etichettatura fluorescenteopzionale 7 della proteina facilita notevolmente l'identificazione dei cristalli proteici e la loro discriminazione dai cristalli di sale (Figura 4).
Abbiamo sfruttato l'ambiente diffusivo nei canali dei chip per fornire un substrato all'enzima che costruisce i cristalli. Nel caso di specie, il CMPcPP, un analogo CTP, è stato aggiunto alle soluzioni del serbatoio ad una concentrazione finale di 3,75 mM(figura 5). Questa aggiunta è stata eseguita due giorni prima dell'analisi cristallografica per consentire a CMPcPP di raggiungere e occupare il sito catalitico dell'enzima, come successivamente confermato dalla struttura cristallina (vedi sotto).
Abbiamo prodotto un portachip (Figura 6) in acido polilattico utilizzando una stampante 3D. Il supporto consente il montaggio del truciolo sui goniometri utilizzando testine magnetiche standard. Quindi il chip può essere facilmente posizionato e tradotto nel fascio di raggi X per portare i cristalli in posizione di diffrazione. La strategia di raccolta dei dati deve essere adattata a seconda delle caratteristiche della linea di fascio e delle proprietà cristalline. Nel caso dell'enzima che aggiunge cca, i dati sono stati raccolti rispettivamente alle linee di fascio X06DA e X10SA, Swiss Light Source (SLS), con una lunghezza d'onda a raggi X di 1,0 Å e Pilatus 2M-F e 6M pixel detector. 30-60° di rotazione sono stati raccolti su ciascun cristallo a temperatura ambiente con immagini di esposizione di 0,1° o 0,2° e 0,1 s (cfr. tabella 1). I set di dati parziali sono stati elaborati individualmente e tagliati quando la risoluzione dei modelli di diffrazione ha iniziato a decadere a causa di danni da radiazioni (rilevati dalla diminuzione del rapporto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0"> segnale-rumore e CC1/2e da un aumento deimea Rnel guscio ad alta risoluzione). I set di dati completi sono stati ricostituiti unendo i dati provenienti da 5 cristalli (tabella 1). Le strutture cristalline sono state derivate mediante sostituzione molecolare utilizzando pacchetti cristallografici standard e procedure perl'elaborazione dei dati 11 eperfezionamento 12. Il confronto delle strutture dell'enzima e del suo complesso con CMPcPP rivela l'adattamento conformazionale locale che accompagna il legame del substrato nel sito attivo dell'enzima che aggiunge CCA (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg"> Figura 1: Progettazione chipx. Il chip è costituito da uno strato superiore in COC (spessore: 1 mm) in cui sono impressi otto canali e serbatoi microfluidici. L'intero chip è sigillato con uno strato di COC (spessore: 0,1 mm). Tutti i canali sono collegati ad una singola insenatura sul lato sinistro per l'iniezione simultanea del campione e a singoli serbatoi sul lato destro in cui vengono depositate soluzioni di cristallizzazione. I canali, che costituiscono le attuali camere di cristallizzazione del chip, sono lunghi 4 cm e hanno una sezione trasversale di 80 μm x 80 μm. ChipX ha le dimensioni di un vetrino da microscopio standard (7,5 cm x 2,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg"> Figura 2: Impostazione di saggi di cristallizzazione in ChipX. 1) Depositare 5-6 μL di soluzioni enzimatici utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. 2) Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare la soluzione negli otto canali. 3) Pipetta 1 μL di olio di paraffina. 4) Introdurre la punta verticalmente nell'ingresso del campione e iniettare l'olio per scollegare i canali l'uno dall'altro. 5) Sigillare l'ingresso con un pezzo di nastro adesivo. 6) Pipet 5 μL di soluzione di cristallizzazione utilizzando pipetta e punta standard da 10 μL. Le soluzioni possono essere diverse in ogni serbatoio (ad esempio, da un kit di screening). 7) Orientare la punta della pipetta verso l'ingresso del canale nella parte a forma di imbuto del serbatoio (per evitare la formazione di una bolla d'aria al momento della deposizione della soluzione) e iniettare la soluzione cristallina nel serbatoio. 8) Sigillare i serbatoi con un pezzo di nastro adesivo e incubare il truciolo a temperatura controllata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg"> Figura 3: Cristalli di enzima che aggiunge cca coltivati per contro-diffusione nei canali microfluidici di ChipX. La barra di scala è di 0,1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg"> Figura 4: Procedura di ammollo del cristallo. 1) Rimuovere delicatamente il nastro dai serbatoi. 2) Depositare fino a 5 μL di soluzione ligando utilizzando un micropipeto da 10 μL. 3) Aggiungere il ligando a uno o più serbatoi. 4) Sigillare nuovamente i serbatoi con un pezzo di nastro adesivo e incubare il truciolo a temperatura controllata per 24-48 ore prima della raccolta dei dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg"> Figura 5: L'etichettatura fluorescente traccia discrimina le proteine (a sinistra) dai cristalli di sale (a destra). La soluzione enzimatica che aggiunge il CCA conteneva lo 0,4 % (w/w) di proteine etichettate con carboxyrhodamina. A destra, i cristalli sono illuminati con una sorgente luminosa a lunghezza d'onda di 520 nm e l'immagine viene scattata con un filtro passa basso a 550 nm (LP550); (insorgenza) struttura dell'estere carboxyrhodamine-succinimidil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg"> Figura 6: Disegno (a sinistra) del supporto ChipX e (a destra) ChipX montato sul goniometro della linea di fascio X06DA a SLS (Villigen, Svizzera) per l'analisi seriale dei cristalli. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg"> Figura 7: Confronto del sito attivo enzimatico con aggiunta di CCA nella forma apo (in rosa) e nel complesso con un analogo CTP (in verde). Sebbene la conformazione complessiva dell'enzima non sia influenzata, il legame del ligando CMPcPP è accompagnato da una leggera riorganizzazione delle catene laterali nel sito attivo. La mappa didensità elettronica 2 Fo-Fc (in blu) è sagomata a 1,2 sigma. La mappa di densità elettronica della differenza sagomata a 4 sigma (in verde) conferma la presenza del ligando nel sito attivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione cristallizzato</td>
			<td>Enzima che aggiunge CCA</td>
			<td>Enzima che aggiunge CCA + CMPcPP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Analisi dei cristalli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Beamline a raggi X</td>
			<td>SLS - X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rivelatore</td>
			<td>Pilatus 2M-F</td>
			<td>Pilatus 6M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Distanza rivelatore di cristalli (mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cristalli raccolti</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cristalli selezionati</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intervallo di rotazione per immagine (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di esposizione per immagine (s)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>No. delle immagini selezionate</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intervallo di rotazione totale (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gruppo spaziale</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>
a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mosaicità media (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intervallo di risoluzione (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>N. totale di riflessioni</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
<tr>
<td>No. di riflessioni uniche</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completezza (%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ridondanza</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmea (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fattore B complessivo della trama di Wilson (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Raffinatezza cristallografica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>No. di riflessioni, working set /set di test</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rcryst finale (%) / Rlibero (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>No. di atomi non H: complessivo / proteina / ligando / solvente</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Deviazioni R.m.s. per obbligazioni (Å) / angoli (°)</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fattori B medi (Å2): complessivo / proteina / ligando / solvente</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trama di Ramachandran: più favorita (%) / consentita (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID PDB</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Statistiche della raccolta e del perfezionamento dei dati
§ Rmeas indipendenti dalla ridondanza = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- <I(hkl)>| / ΣhklΣi Ii(hkl), dove N è la molteplicità dei dati 17.
£ I dati con <I/σ(I)> basso nel guscio esterno (<2.0) sono stati inclusi in base al criterio CC1/2 (correlazione tra due metà casuali del set di dati > 50%) come proposto da Karplus & Diederichs 18.

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Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Viene descritto un dispositivo microfluidico versatile che consente la cristallizzazione di un enzima utilizzando il metodo di contro-diffusione, l'introduzione di un substrato nei cristalli mediante ammollo e la determinazione della struttura 3D del complesso enzima:substrato mediante un'analisi seriale dei cristalli all'interno del chip a temperatura ambiente.

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Ciao, e benvenuti all'architettura di laboratorio e alla reattività dell'RNA presso l'Istituto di Biologia Molecolare e Cellulare di Strasburgo. Coltivare cristalli ben defrattari è un passo fondamentale in qualsiasi studio cristallografico. In questo video, dimostreremo l'uso di un nuovo strumento microfluidico per coltivare cristalli di una biomolecola e determinarne la struttura 3D mediante diffrazione dei raggi X in situ.Il dispositivo microfluidico chiamato ChipX presenta diversi vantaggi. È progettato per miniaturizzare e facilitare le risorse di cristallizzazione con il metodo della contro-diffusione. La sua configurazione è facile ed eseguita con materiale di laboratorio standard.È anche ottimizzato per la caratterizzazione diretta dei cristalli coltivati nel chip dalla cristallografia seriale a raggi X. ChipX elimina la movimentazione dei cristalli e le fasi di crioraffreddamento e preserva la qualità intrinseca dei cristalli che vengono analizzati in situ e a temperatura ambiente. ChipX ha il formato di uno scivolo al microscopio, 7,5 per 2,5 centimetri.Contiene otto canali microfluidici utilizzati come camere di cristallizzazione con una sezione di 80 per 18 micrometri e una lunghezza di quattro centimetri. L'ingresso sul lato sinistro consente l'iniezione manuale della soluzione di biomolecola che riempirà gli otto canali fino ai serbatoi. Le soluzioni di cristallizzazione si depositano in questi serbatoi sul lato destro.La cristallizzazione è innescata da un fenomeno chiamato contro diffusione. Quando l'agente cristallizzante si diffonde nella soluzione di biomolecola e crea una concentrazione e un gradiente di super saturazione. Etichette e bost lungo i canali aiutano a localizzare i cristalli più facilmente.La configurazione di un chip richiede da cinque a sei microlitri di soluzione di biomolecola ad una concentrazione tipica da cinque a 10 milligrammi per millilitro. Un olio di paraffina in microlitri, cinque microlitri di soluzione di cristallizzazione per serbatoio e nastro adesivo. Il caricamento di ChipX viene eseguito manualmente con una micropipetta e punte standard.In questo esempio viene utilizzata una soluzione campione blu per una migliore visualizzazione del processo di iniezione. Per evitare perdite, la punta viene inserita nell'ingresso del campione perpendicolarmente al chip. Un microlitro di olio di paraffina viene caricato dopo il campione per separare i canali l'uno dall'altro.L'ingresso del campione viene quindi sigillato con nastro adesivo. Gli otto serbatoi vengono caricati singolarmente con cinque microlitri di soluzione di agente cristallizzante. Per fare ciò, la punta della pipetta viene posizionata vicino all'estremità del canale con un angolo di circa 45 gradi.Ciò impedisce la formazione di una bolla d'aria tra il campione e l'agente cristallizzante. I serbatoi possono essere riempiti con cocktail contenenti vari tamponi, polimeri o sali, eccetera, per lo screening o l'ottimizzazione. I serbatoi sono sigillati con nastro adesivo.Come dimostrato qui, la configurazione di un chip è facile e richiede solo pochi minuti. In ChipX, la cristallizzazione avviene per controdazione. Gli agenti cristallizzanti depositati nei serbatoi si diffondono nei canali contenenti la biomolecola.Ciò crea gradienti di concentrazione e di super saturazione che attiveranno la cristallizzazione. Questi sono esempi di cristalli di un enzima ottenuti all'interno dei canali. Possono crescere per riempire i canali che hanno una sezione trasversale di 80 per 80 micrometri.I cristalli sono facilmente rilevabili in ChipX mediante microscopia a fluorescenza utilizzando la fluorescenza naturale dei residui di triptofano sotto la luce UV, o come mostrato qui usando una proteina etichettata fluorescentmente. Questa sezione mostra un'analisi telegrafica Chris eseguita presso la sorgente luminosa svizzera nelle filaggrins Svizzera. I trucioli possono essere trasportati al sincrotrone senza alcuna attrezzatura aggiuntiva o cura speciale.Entriamo nella sala della sorgente luminosa svizzera. Gli elettroni circolano nell'anello centrale e generano un ampio spettro di onde elettromagnetiche, compresi i raggi X sfruttati a diverse linee di fascio. Questo video è stato registrato a X06, che è una linea di fascio dedicata alla cristallografia macro-molecolare.Il protocollo può passare da una struttura di sincrotrone all'altra, ma il principio generale rimane lo stesso. ChipX è montato su un supporto stampato in 3D. Questo supporto viene quindi attaccato al magnete di un goniometro standard.L'analisi seriale coerente raccolta dati da una serie di cristalli coltivati nel chip. Gli elenchi di posizioni di cristallo sono stabiliti utilizzando le etichette e il bost lungo i canali del chip. I ricercatori spostano il chip per centrare i cristalli nel fascio di raggi X simboleggiato dalla finestra gialla.Viene avviata una procedura di centramento rapido utilizzando il fascio di raggi X. L'arresto del fascio sale in posizione e il rilevatore si sposta verso il campione. Lo screening della griglia viene eseguito per garantire che il cristallo sia allineato con il fascio.La stessa procedura viene ripetuta dopo aver ruotato il truciolo di 30 gradi. Il secondo passo è importante perché il materiale del chip crea un effetto parallasse che porta ad uno spostamento della diffrazione massima rispetto alla posizione cristallina osservata. Non appena il cristallo è centrato nel fascio inizia la raccolta dei dati.Questa sequenza mostra la raccolta dei dati in tempo reale. Il chip ruota di 30 gradi. Nel frattempo, le corrispondenti immagini di diffrazione vengono raccolte dal rilevatore.La caratterizzazione di questo cristallo è completa. Il chip tradotto nel cristallo successivo nel canale e l'intera procedura viene ripetuta. Si noti che questa analisi viene effettuata in situ senza manipolazione diretta del cristallo e a temperatura ambiente.I dati raccolti su una serie di cristalli vengono quindi uniti per ottenere un set di dati di diffrazione completo che viene utilizzato per calcolare una mappa di densità elettronica, mostrata in blu, e per costruire il modello atomico. La procedura descritta in questo video è stata applicata nel fotogramma della caratterizzazione strutturale dell'enzima di modifica del tRNA. L'enzima che aggiunge cca dal batterio adattato a freddo, Planococcus halocryophilus.ChipX è stato usato per cristallizzare l'enzima contro-diffusione in presenza di solfuro di ammonio come agente cristallizzante. Cristalli by-piramidali apparvero lungo i canali, dopo alcuni giorni di incubazione a 20 gradi Celsius. L'etichettatura fluorescente della proteina ha facilitato l'identificazione dei cristalli proteici e la loro discriminazione dai cristalli di sale.Una serie di cristalli è stata analizzata in situ e a temperatura ambiente. I loro dati di diffrazione furono fusi e portarono alla struttura cristallina dell'enzima APOE ad una risoluzione di 2,5 angstrom. Inoltre, la diffusione dell'ambiente nei canali dei chip è stata sfruttata per fornire un substrato all'enzima che costruisce i cristalli.Nel caso di specie, un analogo CTP è stato aggiunto alle soluzioni del serbatoio due giorni prima dell'analisi del sincrotrone. Ciò ha permesso al composto di diffondersi e raggiungere il sito catalitico dell'enzima. Come si vede nella struttura cristallina del complesso determinata ad una risoluzione di 2,3 angstrom.Il protocollo dimostrato in questo video è generalmente applicabile ed è stato testato su una varietà di biomolecole. Per concludere ChipX è uno strumento chip Lab che integra tutte le fasi di uno studio cristallografico e permette di passare dalla soluzione biomedica alla struttura cristallina in un dispositivo microfluidico unico. Grazie per aver guardato questo video.e speriamo di averti convinto dei vantaggi dell'utilizzo di ChipX per cristallizzare e determinare la struttura cristallina dei tuoi preferiti di Biomolecule.

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