Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

저자는 스위스 광원 (빌리겐, 스위스)이 빔 라인 X10SA (PXII)와 X06DA (PXIII), 구조 개선에 대한 그녀의 기여에 대한 알렉산드라 블루름, 성우와 프랑수아 슈넬 (Université de Strasbourg)의 비디오 편집을위한 자신의 지원에 대한 자신의 지원에 대한 클라리사 Worsdale에 빔 타임 할당을 인정합니다. 이 작품은 스트라스부르 대학인 프랑스 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크(CNRS)의 지원을 받았습니다. 라벡스 컨소시엄 "NetRNA"(ANR-10-LABX-0036_NETRNA)는 프랑스 국립 프로그램 "Investissements d'Avenir"의 프레임에서 스트라스부르 대학의 우수 이니셔티브 (IdEx)에서 R.dW에 박사 자금 지원, 프랑스 - 독일 대학 (UFA-DFH, No. CT-30-19), 도이치 포르충스게마인샤프트(보조금 없음) 모 634/10-1). 저자는 PROCOPE 후버트 쿠리엔 협력 프로그램 (프랑스 외무부와 도이치 어 카에스타슈디엔스트)의 혜택을 받았다.

1. ChipX에서 결정화 소사 설정
참고: ChipX 미세 유체 장치는 저자로부터 얻을 수 있습니다. 칩에 대한 설명은 그림 1에서제공됩니다. 결정화를 촉발하는 데 사용되는 결정성(또는 결정화제)을 포함하는 용액은 상업적 기원이거나 실험자가 제조할 수 있다.
<ol><li>생체 분자 샘플 로드 참고: ChipX의 각 채널의 직선 섹션에서 개별 반확산 분석기를 수행하는 데 실제로 필요한 샘플 볼륨은 300 nL입니다. 그러나 편의를 위해 커브드 섹션의 가변 길이와 유입 데드 볼륨을 고려하여 8개의 채널을 완전히 채우기 위해 5 μL을 로드하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>표준 10 μL 파이프 및 팁을 사용하여 효소 용액의 파이프 5 μL.</li>
		<li>샘플 입구에서 팁을 수직으로 도입하고 8개의 채널이 반대쪽 끝(결정적 저수지의 진입)까지 채워지도록 용액을 주입합니다.</li>
		<li>서로 채널을 분리하기 위해 샘플 입구에 파라핀 오일 1 μL을 주입합니다.</li>
		<li>표준 10 μL 파이펫을 사용하여 각 채널의 극단에서 결정적 저장소에서 추가 용액을 복구합니다.</li>
		<li>1cm x 1cm 크기의 테이프로 샘플 입구를 밀봉합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결정화 솔루션 로드<ol>
<li>표준 10 μL 파이프 및 팁을 사용하여 결정화 용액의 파이프 5 μL. 저수지 부피는 10μL이지만 테이프로 밀봉할 때 절반만 적재하면 오버플로를 방지하고 레간드를 추가하여 실험을 용이합니다. 증기 확산에 의해 초기 결정화 조건이 얻어진 경우, 결정적 농도를 1.5-2의 계수로 증가시다. 용액은 모든 저수지에서 다를 수 있습니다 (제시 된 경우, 1 M 다이아MM 수소 인산염, 100 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5 전체에 사용되었다).</li>
		<li>용액 증착 시 기포가 형성되는 것을 피하기 위해 파이프 팁을 저장소의 깔때기 모양 부분의 채널 진입쪽으로 방향을 지정합니다. 두 솔루션과 채널내 결정적 확산 사이의 접촉을 방지할 수 있습니다.</li>
		<li>결정적 용액을 저수지에 주입합니다.</li>
		<li>2.5cm x 1cm 크기의 테이프로 저수지를 밀봉하십시오.</li>
		<li>칩을 20°C에서 배양한다(일반적으로 4~37°C 4사이, 대상에 따라 온도를 조절할 수 있음).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 형광 검출을 위한 카복시호다민 단백질 라벨링
참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 형광을 사용하여 칩내 결정의 검출을 용이하게 하기 위해 시료 하중 전에 수행해야 합니다. 추적 형광 라벨링의 상세한 방법은 Pusey 및 동료에 의해 설명되었다7. 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.
<ol><li>1mL 안수성 디메틸-포르마미드에 카복시호다민 에스테르 분말 5mg을 용해하고, 용액을 0.6 μL 알리쿼트로 분할하여 -20°C에 저장한다.</li>
	<li>1M 나붕어 pH 8.75 스톡 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>0.05 M Na-borate pH 8.75에서 반응 버퍼를 준비하기 위해 주식을 희석하십시오.</li>
	<li>800 μL의 반응 버퍼로 탈염 컬럼(7kDa MWCO, 0.5mL)을 헹구는 다.</li>
	<li>1400 x g에서 1 분 동안 컬럼을 원심 분리하고 여과물을 제거합니다.</li>
	<li>이 작업을 두 번 반복합니다(2.4-2.5 단계) 열을 세척합니다.</li>
	<li>열에 저장 버퍼에 단백질의 80 μL을 입금 (단백질은 필요한 경우 볼륨을 증가시키기 위해 1 mg / mL로 희석 될 수있다).</li>
	<li>1400 x g에서 1 분 동안 열을 원심 분리합니다. 이 단계는 단백질을 저장 버퍼에서 반응 버퍼로 전송하기 위한 것입니다.</li>
	<li>유동을 복구 (반응 버퍼에 단백질을 포함) 카박스 yrhodamine 용액의 0.6 μL와 혼합.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>한편, 저장 버퍼로 컬럼 3x를 헹구고 1400 x g에서 1분 동안 열을 원심분리하고 여과물을 폐기합니다.</li>
	<li>컬럼에 반응 용액을 입금합니다.</li>
	<li>1400 x g에서 1 분 동안 컬럼을 원심 분리하고 흐름 통과 (즉, 저장 버퍼에 표지 된 단백질의 용액)을 복구합니다.</li>
	<li>라벨이 부착된 단백질의 0.1-1%(w/w)로 스톡 단백질 용액을 보충합니다.</li>
	<li>섹션 1에 설명된 바와 같이 ChipX 결정화 소서를 설정합니다.</li>
	<li>520 nm 파장 광원으로 형광 프로브를 흥미진진해 하여 아세약에서 단백질 결정의 존재를 확인하십시오.</li>
</ol>3. 크리스탈 관찰
참고: ChipX 장치는 온도를 제어해야 하는 경우를 제외하고 내부의 결정에서도 특별한 주의 없이 처리될 수 있습니다.
<ol><li>모든 스테레오 현미경을 사용하여 ChipX에서 결정화 된 결과 확인하십시오. 그것의 발자국은 현미경 슬라이드의 표준 치수를 가지고 있으며 모든 시스템 및 슬라이드 홀더와 호환됩니다.</li>
	<li>결정적 농도가 가장 낮은 저수지에서 시작하여 결정적 농도가 가장 낮은 샘플 입구에서 시작하는 미세 유체 채널의 함량을 확인합니다. ChipX 물질은 가시광선에 투명하며 편광제의 사용과 호환되며, 본질적인 트립토판 형광에 의한 단백질 결정 식별을 위한 UV 조명과 도용된다8.</li>
	<li>채널을 따라 엠보싱된 라벨을 사용하여 결정 위치를 기록하거나 칩 표면에 색상 점을 그려 영구 마커로 크리스탈 위치를 표시합니다.</li>
</ol>4. 리간드에 담그는 크리스탈
참고: 이 절차는 선택 사항입니다. 리간드, 효소 기질 또는 무거운 원자를 결정으로 도입하는 데 사용되며, 배로를 따라 그리고 결정으로 화합물 확산을 허용하기 위해 X선 분석 전에 적어도 24-48h를 수행해야 한다.
<ol><li>저수지에서 밀봉 테이프를 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>10 μL 마이크로파이프를 사용하여 하나 또는 여러 저수지에 리간드 용액의 최대 5μL을 추가(예: 10m 시티딘-5'의 3μL[(α,β)-메틸레노] 삼중산염(CMPcPP) 용액이 3.75mMMMM의 최종 농도를 달성하기 위해 추가되었다. CMPcPP는 효소의 천연 기판인 CTP의 비수소화 가능한 유사체입니다.</li>
	<li>2.5cm x 1cm 크기의 테이프로 저수지를 밀봉하십시오.</li>
	<li>칩의 채널을 따라 리간드 확산을 허용하기 위해 24-48 h의 제어 온도에서 칩을 배양합니다.</li>
</ol>5. 직렬 결정학에 의한 크리스탈 분석
참고: 프로토콜의 이 부분은 빔라인 설정 및 결정의 회절 특성에 따라 조정되어야 합니다. X06DA 빔라인(SLS, 빌리겐, 스위스)에서 수행된 실험에 기초한 결정학적 분석에 대해서만 일반적인 표시가 주어집니다.
<ol><li>빔 라인 고니오미터에 칩X 장착 참고: ChipX 홀더를 3D 인쇄용 파일은 참조4에서제공됩니다.<ol>
<li>빔라인의 저온 제트를 끕니다. 여기서 의 분석은 실온에서 수행됩니다.</li>
		<li>칩X를 전용 홀더에 장착하여 홀더의 중앙에 배치된 크리스탈을 포함하는 채널을 장착합니다. ChipX 홀더4는 ChipX에 완벽한 핏을 제공하도록 설계되었기 때문에 나사 또는 추가 부품이 필요하지 않습니다.</li>
		<li>홀더를 고니오미터에 부착합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 수집<ol>
<li>ChipX의 가장 두꺼운 층(상단 층, 도 1)을방향을 조정합니다(이 방향 레이블은 빔라인의 중심 카메라를 사용하여 직접 판독가능), 직접 빔및 크리스탈 뒤에 가장 얇은 면을 향하여 ref3에설명된 바와 같이 디프시비티 신호의 감쇠를 최소화한다.</li>
		<li>주변 재료(빔스톱, 콜리메이터)와의 ChipX의 충돌을 방지하기 위해 ±30°(X선 빔에 수직인 채널에 대응하는 0°)의 범위에서 고니오미터 의 움직임을 제한합니다.</li>
		<li>채널을 따라 엠보싱된 라벨의 도움으로 결정 위치를 찾습니다.</li>
		<li>결정 위치를 선택합니다.</li>
		<li>표준 저용량 그리드/래스터 스크리닝 또는 1-click 절차(비디오는 그리드 스크리닝의 예를 보여줍니다)에 의해 결정 중 하나를 중시한다.</li>
		<li>-30° / +30°범위 내에서 회절 데이터를 수집합니다.</li>
		<li>칩 번역 후 동일한 채널의 다른 결정에서 5.2.4-5.2.6 단계에서 절차를 다시 시작합니다.</li>
		<li>홀더 중앙에 있는 다른 ChipX 채널을 수동으로 다시 정렬하고 이 채널에 있는 결정에 대한 데이터 수집을 수행합니다.</li>
		<li>표준 결정화 패키지 및 프로시저를 사용하여 데이터를 처리하고 병합한 다음 구조를 해결하고 구체화합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. 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P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

생체 결정학의 현재 프로토콜은 극저온 조건에서 질소 제트에서 회절 분석을 수행하기 전에 증기 확산 또는배치(13,14)와같은 방법을 사용하여 결정의 제조를포함하고,극저온 냉각15,16을 위한 마이크로루프로의 이송을 포함한다. 대조적으로, 직접 결정 극저온 냉각은 ChipX3에서 불가능하고 결정은 이 설치의 한계로 볼 수 있는 그들의 미세 유체 채널에서 추출될 수 없습니다. 그러나, 이 문서에 기재된 프로토콜은 실온(즉, 보다 생리적인 조건에서)에서 결정 구조의 판정을 위한 완전히 통합된 파이프라인을 제공한다. 실온에서의 데이터 수집은 방사선손상(19)의증가를 야기하지만, 이 효과는 빠른 데이터 수집 시간(각 결정에서 최대 60° 회전이 수집)과 여러 부분 데이터 집합의 병합에 의해 균형을 맞힙니다. ChipX 설계 및 재료 모두 배경 산란 및 회절 신호 감쇠3을감소시키기 위해 최적화되었으며, 채널(40 μm)의 절반크기에 해당하는 치수를 가진 결정에서 데이터 수집을 수행할 수 있다.
요약하자면 프로토콜의 주요 장점은 다음과 같습니다. 결정은 대류가없는 환경 (미세 유체 채널)에서 생산되며 고품질 의 결정에 매우 유리합니다. ChipX에서 구현된 반확산 방법은 초량도를 스크리닝하는 데 매우 효율적입니다. 결정적 분동이 칩 채널로 확산되면 적절한 핵형성 및 성장 조건을 결정하는 데 도움이 되는 농도 및 과포화 파를 생성한다5. 결정은 직접 처리되지 않지만, 칩 내부, 그 결과 실제 회절 특성을 보존하는 내부에서 분석되며(즉, 물리적 상호 작용 또는 극저온냉각에 의한 결정 모사이시티를 변경하지 않음)20. 회절 분석은 방사선 손상을 최소화하기 위해 낮은 용량 노출로 칩 채널을 따라 분산된 일련의 결정에서 수행되며, 전체 데이터 집합은 계열의 부분 데이터를 병합하여 조립된다. ChipX의 표준 발자국과 간단한 설계는 미래에 싱크로트론 또는 XFEL 시설을 사용하여 시투 데이터 수집의 완전한 자동화를 가능하게 할 것입니다. 프로토콜의 모든 단계는 ChipX에서 수행됩니다. 실험자 관점에서 칩 설정은 표준 파이펫으로 간단하고 쉽게 수행할 수 있으며 추가 장비가 필요하지 않습니다. 샘플 입구의 트리와 같은 채널 연결은 시스템의 데드 볼륨을 최소화하며, 이는 정화가 어렵거나 제한된 수량으로만 사용할 수 있는 샘플로 작업할 때 중요합니다.
결론적으로, ChipX에서 구현된 랩 온-어칩 접근법은 역확산 및 결정 구조 결정에 의한 결정화 공정을 단순화하고 효율적으로 소형화하여 샘플에서 단일 장치에서 3D 구조로 이동하도록 합니다. 그것은 널리 적용 가능하고 실온에서 일상적인 연쇄 생체 결정학 조사를위한 사용자 친화적이고 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

결정학은 생물학적 거대 분자의 3D 아키텍처를 해독하는 방법입니다. 후자는 효소가 기판을 선택하고 처리하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 결정 구조의 결정은 표적 거대 분자의 결정화 및 X 선 회절1에의한 분석을 위한 결정의 컨디셔닝을 요구한다. 결정 준비 와 처리 모두 결정 품질 및 회절 특성에 영향을 미칠 수있는 중요하지만 섬세한 단계이며, 따라서 결과 3D 구조의 해상도 (즉, 정확도). 고품질 결정의 준비를 용이하게하고 회절 특성을 보존하기 위해 불필요한 처리를 제거하기 위해 ChipX2,3,4라는사용자 친화적이고 다목적 미세 유체 장치를 설계했습니다.
본 기사에서는 기존의 실험실 재료를 사용하여 ChipX 채널에 단백질 용액을 적재하여 역확산으로 결정을 준비하는 방법을 시연합니다. 이러한 결정화 방법은 결정화제의 확산에 의해 생성된 농도 그라데이션으로 인하여 효소 용액을 함유하는 미세유체 채널을 따라 초포화 및 잠재적 핵형성 조건의 효율적인 스크리닝을 제공한다5,6.
칩 설정은 간단하며 표준 실험실 파이프만 사용하며 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. ChipX에서 결정이 성장하면 효소의 리간드를 확산에 의해 도입할 수 있습니다. 회절 데이터는 싱크로트론 X선 소스를 사용하여 칩의 채널에 포함된 일련의 결정의 실온에서 수집됩니다. 여기에서 기술된 구조 적인 연구 결과는 그것의 아포 양식에 있는 tRNA 성숙 효소의 구조물의 결정으로 이끌어 내고 담그기 에 의해 소개된 그것의 CTP 기판의 아날로그와 복합체에서 이끌어 냈습니다. CCA 추가 효소에게 불린 이 단백질은 tRNA의 3'끝에 CCA 트리뉴클레오티드 꼬리를 중합합니다. 직렬 결정학에 의해 얻어진 2개의 3D 심상을 비교하면 극저온 결정학에 사용되는 것보다 생리적인 조건에서 리간드의 결합과 관련된 국소 형성적 변화를 나타낸다. 이 비디오에 기재된 프로토콜은 일반적으로 단백질, 핵산 또는 다중 성분 복합체인 임의의 생체 분자에 적용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

X선 분석 전에 잘 확산되는 결정과 처리의 준비는 생체 결정 연구의 두 가지 중요한 단계입니다. 우리는 효율적인 역확산 방법으로 결정의 생산을 가능하게 하는 다목적 미세 유체 칩을 설명합니다. 미세 유체 채널에서 제공하는 대류없는 환경은 결정 성장에 이상적이며 결정 효소의 활성 부위로 기판을 확산시키는 데 유용합니다. 여기에서 우리는 제시된 예에서 심령 박테리움 플라노코커스 할로크로우필루스의 CCA 추가 효소에 이 접근법을 적용했습니다. 결정화 및 기판 확산/담그 후, 효소:기판 복합체의 결정 구조는 칩 내부의 여러 결정의 연쇄 결정 및 분석에 의해 실온에서 결정되었다. 전체 절차는 수정 처리가 필요하지 않으므로 시료의 정품 회절 특성을 보존합니다.

여기에 설명된 미세 유체 칩은 실온에서 결정화 분석 및 결정 해석을 쉽게 설정할 수 있도록 설계되었습니다. 전술한 절차는 상술한 세균 플라노코커스 할로크로필루스로부터 CCA 첨가 효소의 구조적 특성화의 프레임에 적용되었다. 이 효소는 CTP 및 ATP9,10을사용하여 tRNA에 3'CCA 서열의 순차적 첨가를 촉매하는 필수 폴리머라제 제품군에 속한다.
상기 칩은 먼저 역확산 방법에 의한 구조분석을 위한 효소의 결정을 제조하는 데 사용되었다. 이를 위해, 효소 용액은 칩의 샘플 입구에 단일 주입에 의해 8개의 미세유체 채널(결정화 챔버)에 적재되었다(도 1참조). 효소는 20m Tris/HCl pH 7.5, 200 mM MM NaCl 및 5mM MgCl2를포함하는 저장 버퍼에서 5.5 mg/mL에서 사용되었습니다. 이 단계는 표준 10 μL 마이크로파이프로 수동으로 수행되었습니다. 결정화 솔루션(100mM 나트륨 아세테이트 pH 4.5,1 M 다이아모늄 수소 인산염)은 다음 채널의 다른 극단에서 저수지에 증착하였다.
로딩 절차는 간단하며 5 분 이상 걸리지 않습니다(그림 2). 결정적 이어서 채널로 확산되고, 결정 핵형성과 성장을 유발하는 농도의 그라데이션을 생성한다. 이 그라데이션은 동적으로 진화하고 채널과 저수지 사이의 결정적 농도의 평형에 도달 할 때까지 슈퍼 저울 상태의 연속체를 탐구5,6. 결정화 소세는 일반적으로 결정의 성장을 추적하기 위해 2 - 4 주 동안 의 기간 동안 미코스코프하에서 검사됩니다. CCA 첨가 효소의 상피라미드 결정은 20°C(도3)에서잠복며칠 후 채널 전체에 나타났다. 단백질의 7을 선택적으로 표시하는 선택적 형광은 단백질 결정의 식별과 염결정으로부터의 차별을 크게 용이하게 한다(도4).
우리는 칩 채널의 확산 환경을 활용하여 결정을 쌓는 효소에 기판을 전달했습니다. 본 인경우, CTP 아날로그인 CMPcPP는 3.75mMMM(도5)의최종 농도로 저수지 솔루션에 첨가되었다. 이러한 첨가는 결정구조에 의해 나중에 확인된 바와 같이 CMPcPP가 효소의 촉매 부위에 도달하고 점유할 수 있도록 결정학적 분석 2일 전에 수행되었다(아래 참조).
3D 프린터를 이용하여 폴리락산에서 칩홀더(도 6)를제조했습니다. 홀더는 표준 마그네틱 헤드를 사용하여 고니오미터에 칩 장착을 가능하게 합니다. 따라서 칩을 쉽게 배치하고 X 선 빔에 변환하여 결정을 회절 위치에 가져올 수 있습니다. 데이터 수집 전략은 빔라인 특성및 결정 특성에 따라 조정되어야 합니다. CCA 첨가 효소의 경우 X06DA 및 X10SA 빔라인, 스위스 광원(SLS)에서 X선 파장 1.0Å 및 필라투스 2M-F 및 6M 픽셀 검출기에서 데이터를 수집하였다. 30-60° 회전은 0.1° 또는 0.2° 및 0.1의 노출로 실온에서 각 결정에서 수집되었습니다(표 1참조). 부분 데이터 세트는 방사선 손상(신호 대 잡음 비율 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0"> 및 CC1/2의감소에 의해 검출되고, 고해상도쉘에서 Rmeas의 증가에 의해 검출됨)에 기인하여 회절 패턴의 분해가 시작될 때 개별적으로 처리되고 절단되었습니다. 전체 데이터 집합은 5개의결정(표 1)의데이터를 병합하여 재구성되었습니다. 결정 구조는 표준 결정화 패키지 및 데이터 처리를 위한 절차를 사용하여 분자 대체에 의해파생되었다(11) 및정제(12). CMPcPP와 그 복합체의 구조와 그 복합체의 구조를 비교하면 CCA 첨가효소(도 7)의활성 부위에 기판 결합을 수반하는 국소 형성 적응을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg"> 그림 1: ChipX 디자인. 칩은 8개의 미세 유체 채널과 저수지가 각인된 COC(두께: 1mm)로 만들어진 최상위 층으로 구성됩니다. 전체 칩은 COC 층(두께: 0.1mm)으로 밀봉됩니다. 모든 채널은 동시 시료 주입을 위해 왼쪽에 있는 단일 입구에 연결되고 결정화 용액이 증착되는 오른손의 개별 저장소에 연결됩니다. 칩의 실제 결정화 챔버를 구성하는 채널은 길이가 4cm이고 80 μm x 80 μm의 단면을 가지며, 채널을 따라 엠보싱된 라벨(A1, A2, A3 등)은 현미경하에서 결정 포지셔닝및 데이터 수집을 위한 샘플 목록의 준비를 용이하게 한다. ChipX는 표준 현미경 슬라이드 (7.5cm x 2.5cm)의 크기를 가지고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg"> 그림 2: ChipX. 1) 표준 10 μL 파이펫 및 팁을 사용하여 효소 용액의 5-6 μL을 입금하여 결정화 적응법을 설정합니다. 2) 샘플 입구에서 팁을 수직으로 소개하고 8개의 채널에 용액을 주입한다. 3) 파라핀 오일의 파이프 1 μL. 4) 샘플 입구에 팁을 수직으로 소개하고 서로 채널을 분리하기 위해 오일을 주입한다. 5) 테이프 조각으로 입구를 밀봉. 6) 표준 10 μL 파이프 및 팁을 사용하여 결정화 용액의 파이프 5 μL. 솔루션은 모든 저장소(예: 스크리닝 키트와 다를 수 있음)에서 다를 수 있습니다. 7) 파이프 팁을 저수지의 깔때기 모양 부분의 채널 의 진입쪽으로 방향을 지정하고(용액 증착 시 기포의 형성을 피하기 위해) 저수지에 결정적 용액을 주입한다. 8) 테이프 조각으로 저수지를 밀봉하고 제어 온도에서 칩을 인큐베이션합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg"> 그림 3: ChipX의 미세 유체 채널에서 반확산에 의해 성장된 CCA 첨가 효소의 결정. 스케일 표시줄은 0.1mm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg"> 그림 4: 크리스탈 담그기 절차. 1) 저수지에서 테이프를 부드럽게 제거합니다. 2) 10 μL 마이크로 파이프를 사용하여 리간드 용액의 최대 5 μL을 입금합니다. 3) 리간드를 하나 또는 여러 개의 저장소에 추가합니다. 4) 테이프 조각으로 저장소를 다시 밀봉하고 데이터 수집 전에 24-48 시간 동안 제어 온도에서 칩을 배양합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg"> 그림 5: 미량 형광 라벨은 소금(오른쪽) 결정으로부터 단백질(왼쪽)을 차별합니다. CCA 추가 효소 용액에는 carboxyrhodamine으로 표시된 단백질의 0.4 % (w /w)가 포함되어 있습니다. 오른쪽에서는 520nm 파장 광원으로 크리스탈이 켜지고 이미지는 550nm(LP550)의 로우 패스 필터로 촬영됩니다. (인셋) 카박스트리호다민-수치니미딜 에스테르의 구조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg"> 그림 6: (왼쪽) 칩X 홀더의 도면 및 (오른쪽) 칩X는 연쇄 크리스탈 분석을 위해 SLS (빌리겐, 스위스)에서 빔 라인 X06DA의 곤니미터에 장착. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg"> 도 7: APO 형태(분홍색)와 CTP 아날로그(녹색)를 가진 복합체에서 CCA 첨가 효소 활성 부위의 비교. 효소의 전반적인 형태는 영향을 받지 않지만, CMPcPP 리간드의 결합은 활성 부위에서 사이드 체인의 약간의 재구성을 동반한다. 2Fo-Fc 전자 밀도 맵(파란색)은 1.2 시그마로 윤곽을 비운다. 4시그마(녹색)에서 윤곽을 그리는 차액 전자 밀도 맵은 활성 부위에 리간드의 존재를 확인한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>결정화된 시료</td>
			<td>CCA 추가 효소</td>
			<td>CCA 추가 효소 + CMPcPP</td>
		</tr>
<tr>
<td>크리스탈 분석</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>엑스레이 빔라인</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA</td>
		</tr>
<tr>
<td>파장 (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>온도(K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>탐지기</td>
			<td>필라투스 2M-F</td>
			<td>필라투스 6M</td>
		</tr>
<tr>
<td>크리스탈 검출기 거리(mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>수집된 크리스탈</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>선택된 크리스탈</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>이미지당 회전 범위(°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>이미지당 노출 시간(들)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>아니요. 선택한 이미지의</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 회전 범위(°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
<tr>
<td>공간 그룹</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>
a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균 모자이시티(°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>해상도 범위(Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 번호 반사의</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
<tr>
<td>아니요. 독특한 반사의</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
<tr>
<td>완전성(%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>중복</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>윌슨 플롯에서 전체 B 요인 (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>결정적 세련미</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>아니요. 반사, 작업 세트 / 테스트 세트의</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
<tr>
<td>최종 Rcryst (%) / R무료 (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>아니요. 비H 원자의 : 전체 / 단백질 / 리간드 / 용매</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>채권(Å) /각도(°)에 대한 R.m.s. 편차</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>평균 B 인자 (Å2):전체 / 단백질 / 리간드 / 용매</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>라마찬드란 플롯: 가장 선호 (%) / 허용 (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>PDB ID</td>
			<td>6IBP</td>
			<td>6Q52</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 데이터 수집 및개선 통계
§ 중복 독립적 인 Rmeas = Σhkl(N / N-1)1/2θi | I i(hkl)- & I(hkl)>| / ΣhklΣI ii(hkl),여기서 N은 데이터 복합성 17.
£ 데이터가 낮은 & I/σ(I)> 외음조(&2.0)는 CC1/2 기준(데이터 세트의 두 임의 반쪽 사이의 상관관계 및 50%)을 기반으로 포함되었습니다. 카플러스 & 디데리히스 18에의해 제안 된 대로 .

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Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

다목적 미세유체 장치는 반확산 방법을 이용하여 효소의 결정화를 가능하게 하고, 침을 구함으로써 결정에 기판의 도입, 효소:기판 복합체의 3D 구조 측정을 실온에서 칩 내부의 결정의 직렬 분석에 의한 것으로 설명된다.

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

안녕하세요, 스트라스부르의 분자 및 세포 생물학 연구소에서 RNA의 실험실 아키텍처 및 반응성에 오신 것을 환영합니다. 잘 절개하는 결정은 어떤 결정학 연구에서든 중요한 단계입니다. 이 비디오에서는 생체 분자의 결정을 성장하고 시투 X 선 회절에 의해 3D 구조를 결정하기 위해 새로운 미세 유체 도구의 사용을 시연할 것입니다.ChipX라는 미세 유체 장치는 몇 가지 장점을 제공합니다. 그것은 역확산 방법에 의해 결정화 자산을 소형화하고 용이하게하도록 설계되었습니다. 그것의 설정은 간단하고 표준 실험실 재료로 수행.또한 연쇄 X선 결정예촬영으로 칩에서 자란 결정의 직접적인 특성화에 최적화되어 있습니다. ChipX는 결정 처리 및 저온 냉각 단계를 제거하고 현장에서 실온에서 분석되는 결정의 본질적인 품질을 보존합니다. ChipX는 현미경 슬라이드의 형식을 가지고, 7.5 에 의해 2.5 센티미터.80 x 18 마이크로미터의 섹션과 4센티미터의 길이를 가진 결정화 챔버로 사용되는 8개의 미세 유체 채널을 포함하고 있습니다. 왼쪽입구는 저수지까지 8개의 채널을 채울 생체 분자 용액의 수동 주입을 허용합니다. 결정화 솔루션은 오른쪽에 있는 이러한 저장소에 증착됩니다.결정화는 카운터 확산이라는 현상에 의해 유발됩니다. 결정화 제는 생체 분자 용액으로 확산되고 농도와 슈퍼 포화 그라데이션을 생성합니다. 채널을 따라 라벨과 보스트는 결정을 보다 쉽게 찾을 수 있도록 도와줍니다.칩을 설정하려면 밀리리터당 5~10밀리그램의 일반적인 농도로 생체 분자 용액의 5~6개의 마이크로리터가 필요합니다. 마이크로리터 파라핀 오일 1개, 저수지당 결정화 용액 5개, 접착 테이프. ChipX의 로딩은 마이크로 파이프및 표준 팁으로 수동으로 수행됩니다.이 예제에서는 주입 공정의 더 나은 시각화를 위해 파란색 샘플 솔루션이 사용됩니다. 누출을 방지하기 위해 팁은 칩에 수직으로 샘플 입구에 삽입됩니다. 파라핀 오일의 마이크로리터 1개는 샘플 이후에 적재되어 채널을 서로 분리합니다.그런 다음 샘플 입구는 테이프로 밀봉됩니다. 8개의 저수지는 결정화 제용제 용액 5마이크로리터로 개별적으로 로드됩니다. 이렇게 하려면 파이펫 팁은 약 45도 각도로 채널 끝 부분에 배치됩니다.이것은 시료와 결정화제 사이 기포의 형성을 방지합니다. 저수지는 스크리닝 또는 최적화를 위해 다양한 완충제, 폴리머 또는 염, 예를 들어 세테라를 포함하는 칵테일로 채워질 수 있습니다. 저장소는 테이프로 밀봉됩니다.여기에서 설명했듯이 칩을 설정하는 것은 쉬우며 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. ChipX에서는, 결정화는 카운터 확산에 의해 생깁니다. 저수지에 증착된 결정화제는 생체 분자를 포함하는 채널로 확산됩니다.이것은 결정화를 트리거할 수 있는 농도및 슈퍼 포화의 그라데이션을 만듭니다. 이들은 채널 안쪽에 얻어진 효소의 결정의 보기입니다. 그(것)들은 80 x 80 마이크로미터의 단면이 있는 채널을 채우기 위하여 성장할 수 있습니다.결정은 UV 빛 아래 트립토판 잔류물의 자연적인 형광을 사용하여 형광 현미경 검사법에 의해 ChipX에서 쉽게 검출될 수 있거나, 또는 형광 표지 단백질을 사용하여 여기에 도시된 바와 같이. 이 섹션에서는 스위스 의 필라그린스 스위스 광원에서 수행된 Chris 전신 분석을 보여줍니다. 칩은 추가 장비 나 특별한주의없이 싱크로트론에 수행 할 수 있습니다.스위스 광원 의 홀에 들어가봅시다. 전자는 중앙 고리에서 순환하고 다른 빔라인에서 악용된 엑스레이를 포함하여 광범위한 전자파를 생성합니다. 이 비디오는 매크로 분자 결정촬영전용 빔라인인 X06에서 녹화되었습니다.프로토콜은 하나의 싱크로트론 시설에서 다른 스트로트로로 변경될 수 있지만 전체 원칙은 동일하게 유지됩니다. ChipX는 3D 인쇄 홀더에 장착됩니다. 이 홀더는 표준 곤니오미터의 자석에 부착됩니다.직렬 분석은 칩에서 자란 일련의 결정에서 일관된 수집 데이터를 수집합니다. 칩 채널을 따라 라벨과 보스트를 사용하여 결정 위치 목록이 설정됩니다. 연구원은 노란색 창에 의해 상징되는 엑스레이 빔에 있는 결정을 중심으로 칩을 이동합니다.엑스레이 빔을 이용한 빠른 센터링 절차가 시작됩니다. 빔 정지가 제자리에 올라가고 검출기가 시료쪽으로 이동합니다. 그리드 스크리닝은 결정이 빔과 정렬되도록 수행됩니다.동일한 절차는 칩을 30도 회전 한 후 반복됩니다. 두 번째 단계는 칩 재료가 관찰된 결정 위치에 대하여 회절 최대의 이동을 유도하는 시차 효과를 생성하기 때문에 중요합니다. 결정이 빔을 중심으로 하는 즉시 데이터 수집이 시작됩니다.이 시퀀스는 실시간으로 데이터 수집을 보여 주어 있습니다. 칩이 30도 회전합니다. 한편, 해당 회절 이미지는 검출기에 의해 수집됩니다.이 결정의 특성은 완료되었습니다. 칩은 채널의 다음 결정으로 변환되고 전체 절차가 반복됩니다. 이 분석은 크리스탈을 직접 취급하지 않고 실온에서 작동합니다.그런 다음 일련의 결정에서 수집된 데이터를 병합하여 전자 밀도 맵을 계산하고 파란색으로 표시된 전자 밀도 맵을 계산하고 원자 모델을 빌드하는 데 사용되는 완전한 회절 데이터 집합을 얻습니다. 본 비디오에 기재된 절차는 tRNA 변형 효소의 구조적 특성화의 프레임에 적용되었다. 차가운 적응 박테리아, 플라노 코커스 할로크호필루스에서 CCA 추가 효소.ChipX는 결정화제로 황화 암모늄의 존재에서 반대 확산에 의해 효소를 결정화하는 데 사용되었다. 20섭씨에서 며칠 간 잠복한 후, 피라미드형 결정이 채널을 따라 나타났습니다. 단백질의 형광 라벨링은 단백질 결정의 식별과 소금 결정에서의 차별을 촉진했습니다.일련의 결정은 현장에서 실온에서 분석되었습니다. 이들의 회절 데이터는 합병되어 2.5 앙스트롬의 해상도로 APOE 효소의 결정 구조로 이어졌다. 또한, 칩 채널에서 환경의 확산은 결정을 축적하는 효소에 기판을 제공하기 위해 이용되었다.본 경우, 싱크로트론 분석 이틀 전에 CTP 아날로그를 저수지 솔루션에 첨가하였다. 이것은 화합물이 확산하고 효소의 촉매 부위에 도달할 수 있었습니다. 2.3 앙스트롬의 해상도로 결정된 복합체의 결정 구조에서 볼 수 있듯이.이 비디오에서 입증된 프로토콜은 일반적으로 적용 가능하며 다양한 생체 분자에서 테스트되었습니다. ChipX는 결정적 연구의 모든 단계를 통합하고 독특한 미세 유체 장치에서 결정 구조에 생체 의학 솔루션에서 갈 수 있습니다 실험실 칩 도구입니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사합니다.그리고 우리는 우리가 구체화하고 생체 분자에 의해 즐겨 찾기의 결정 구조를 결정하기 위해 ChipX를 사용하는 이점을 확신 바랍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

연구

생화학

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

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As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

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항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

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탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...