Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Авторы признают Швейцарский Источник Света (Villigen, Швейцария) за выделение времени луча для проекта на лучах X10SA (PXII) и X06DA (PXIII), Александра Блюм за ее вклад в усовершенствование структуры, Кларисса Уорсдейл для записи закадрового голоса и Франсуа Шнелл (Страсбургский университет) за помощь в редактировании видео и SFX. Эта работа была поддержана Французским центром Национального де ла Recherche Scientifique (CNRS), Страсбургский университет, консорциум LabEx "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), phD-финансирование R.dW от инициативы Excellence (IdEx) Страсбургского университета в рамках французской национальной программы "Инвестиции д'Авенир", кандидат финансирования К.Р. от Франко-германского университета (UFA-DFH, грант нет. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант No. Mo 634/10-1). Авторы воспользовались программой сотрудничества PROCOPE Hubert Curien (Министерство иностранных дел Франции и Deutscher Akademischer Austauschdienst).

1. Настройка анализов кристаллизации в ChipX
ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидное устройство ChipX можно получить у авторов. Описание чипа дается на рисунке 1. Решения, содержащие кристаллизирующийся (или кристаллизирующийся агент), используемые для запуска кристаллизации, могут иметь коммерческое происхождение или быть подготовлены экспериментатором.
<ol><li>Загрузка образца биомолекулы ПРИМЕЧАНИЕ: Объем выборки, фактически необходимый для выполнения индивидуального контр-диффузионные анализы в прямом разделе каждого канала ChipX составляет 300 nL. Однако для удобства мы предлагаем загрузить 5 МЛ, чтобы полностью заполнить восемь каналов с учетом переменной длины их изогнутого сечения и введать мертвые тома.<ol>
<li>Pipet 5 йл ферментных растворов, используя стандартные 10 МКЛ пипетки и наконечник.</li>
		<li>Ввести наконечник вертикально в вход образца и вводить раствор до тех пор, пока восемь каналов не будут заполнены до их противоположного конца (вход в кристаллическое водохранилище).</li>
		<li>Ввись 1 МКЛ парафинового масла в пробу вход для того, чтобы отключить каналы друг от друга.</li>
		<li>Восстановите дополнительное решение в кристаллическом резервуаре на конечности каждого канала, используя стандартный трубоуправляемый 10 йл.</li>
		<li>Печать образца вход с 1 см х 1 см кусок ленты.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Загрузка решений кристаллизации<ol>
<li>Pipet 5 йл раствора кристаллизации с использованием стандартных 10 МКЛ пипетки и наконечника. Объем резервуара составляет 10 мкл, но загрузка только половины его позволяет избежать переполнения при уплотнению лентой и облегчает дальнейшее добавление лиганда для замачивания экспериментов. Если начальные условия кристаллизации были получены путем диффузии пара, увеличьте концентрацию кристалланта в 1,5 - 2. Решения могут быть разными в каждом резервуаре (в представленном случае во всем использовался 1 М диаммоний водородный фосфат, ацетат натрия 100 мМ, рН 4,5).</li>
		<li>Ориентация наконечника трубы к входу канала в воронку формы части резервуара, чтобы избежать образования воздушного пузыря при осаждении раствора. Это предотвратило бы контакт между этими двумя решениями и кристаллическое распространение в канал.</li>
		<li>Введать кристаллический раствор в резервуар.</li>
		<li>Печать резервуаров с 2,5 см х 1 см кусок ленты.</li>
		<li>Инкубировать чип при температуре 20 градусов по Цельсию (температура может быть скорректирована в зависимости от цели, как правило, между 4 и 37 градусов по Цельсию 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Белковая маркировка карбоксиродамином для обнаружения флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Она должна быть выполнена до загрузки образца для облегчения обнаружения кристаллов в чипе с помощью флуоресценции. Подробный метод отслеживания флуоресцентной маркировки был описан Pusey и коллегами7. Все шаги выполняются при комнатной температуре.
<ol><li>Растворите 5 мг порошка карбоксиродамина в 1 мл ангидроуса диметил-формамид, разделите раствор на 0,6 л алицитов, которые будут храниться при -20 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Приготовьте 1 M Na-borate рН 8,75 бульонного раствора.</li>
	<li>Разбавить запас для подготовки буфера реакции на 0,05 М На-борат рН 8,75.</li>
	<li>Промыть десалирование колонны (7 кДа MWCO, 0,5 мл) с 800 мл буфера реакции.</li>
	<li>Центрифуга колонки в течение 1 мин при 1400 х г, удалить фильтрат.</li>
	<li>Повторите эту операцию дважды (шаги 2.4-2.5), чтобы вымыть столбец.</li>
	<li>Депозит 80 мл белка в буфере хранения на колонке (белок может быть разбавлен до 1 мг/мл, чтобы увеличить объем, если это необходимо).</li>
	<li>Центрифуга колонки в течение 1 мин при 1400 х г. Этот шаг предназначен для переноса белка из буфера хранения в буфер реакции.</li>
	<li>Восстановите поток через (содержащий белок в буфере реакции) и смешайте его с 0,6 МЛ карбоксиродаминового раствора.</li>
	<li>Инкубация 5 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Между тем, промыть столбец 3 х с буфером хранения, центрифуга колонки в течение 1 мин на 1400 х г и отказаться от фильтрата.</li>
	<li>Ввемите решение реакции на столбец.</li>
	<li>Центрифуга колонки в течение 1 мин при 1400 х г и восстановить поток через (т.е. раствор помеченного белка в буфере хранения).</li>
	<li>Дополните раствор стокового белка 0,1-1% (w/w) помеченного белка.</li>
	<li>Настройка анализа кристаллизации ChipX, как описано в разделе 1.</li>
	<li>Проверьте наличие кристаллов белка в анализах, захватывающий флуоресцентный зонд с 520 нм длина волны источника света.</li>
</ol>3. Хрустальное наблюдение
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство ChipX может быть обработано без особого ухода, даже с кристаллами внутри, за исключением случаев, когда температура должна контролироваться.
<ol><li>Используйте любой стереомикроскоп, чтобы проверить результаты анализа кристаллизации в ChipX. Его след имеет стандартные размеры слайдов микроскопа и совместим с любой системой и держателем слайдов.</li>
	<li>Проверьте содержание микрофлюидных каналов, начиная с резервуара, где концентрация кристалла является самой высокой в пробный вход, где концентрация кристалла является самой низкой. Материал ChipX прозрачный для видимого света, совместимый с использованием поляризаторов, а также с УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫм освещением для идентификации белкового кристалла внутренней триптофаной флуоресценцией8.</li>
	<li>Запись кристаллических позиций с помощью этикетки тиснением вдоль каналов или знак кристаллических местах с постоянным маркером, рисуя цветные точки рядом с ними на поверхности чипа.</li>
</ol>4. Кристалл замачивания с лигандами
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура необязательна. Он используется для введения лигандов, ферментных субстратов или тяжелых атомов в кристаллы и должен быть проведен по крайней мере 24-48 ч до рентгеновского анализа, чтобы соединение диффузии вдоль каналов и в кристаллы.
<ol><li>Аккуратно удалите уплотнительную ленту из резервуаров.</li>
	<li>Добавьте до 5 МЛ лигандового раствора в одном или нескольких резервуарах, используя микропайп (например, 3 МКЛ из 10 мм цитидина-5'-α,β)-метилено-трифосфат (CMPcPP) решение было добавлено для достижения окончательной концентрации 3,75 мМ). CMPcPP является негидролизируемым аналогом CTP, естественного субстрата фермента.</li>
	<li>Печать резервуаров с 2,5 см х 1 см кусок ленты.</li>
	<li>Инкубировать чип под контролируемой температурой 24-48 ч, чтобы лиганд диффузии по каналам чипа.</li>
</ol>5. Кристаллический анализ по серийной кристаллографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола должна быть адаптирована в зависимости от установки луча и дифракционных свойств кристаллов. Для кристаллографического анализа, основанного на экспериментах, проведенных на лучевой линии X06DA (SLS, Villigen, Швейцария), даются только общие показания.
<ol><li>ЧипX монтаж на гониометре балки ПРИМЕЧАНИЕ: Файл для 3D-печати держателя ChipX предоставляется в ref4.<ol>
<li>Выключите крио-струйную линию балки. Анализ здесь проводится при комнатной температуре.</li>
		<li>Намонтировать ChipX на специальном держателе с каналом, содержащим кристаллы для анализа, расположенным в центре держателя. Держатель ChipX4 не требует винта или дополнительной части, так как он был разработан, чтобы обеспечить идеально подходит для ChipX.</li>
		<li>Прикрепите держатель к гониометру.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Сбор данных<ol>
<li>Ориентируйте самый толстый слой (верхний слой, рисунок 1)ChipX (в этой ориентации этикетки вдоль каналов непосредственно читаемы с помощью центрирования камеры луча), к прямому лучу и тончайшему лицу за кристаллом, чтобы свести к минимуму затухание диффрактированного сигнала, описанного в ref3.</li>
		<li>Чтобы избежать столкновения ChipX с окружающим материалом (луч, коллиматор), ограничь движения гониометра в диапазоне ±30 "(0 " (0 ", соответствующие каналам перпендикулярно рентгеновского луча).</li>
		<li>Найти кристаллы позиции с помощью этикетки тиснением вдоль каналов.</li>
		<li>Выберите хрустальную позицию.</li>
		<li>Центр кристалла либо стандартной низкой дозы сетки / raster скрининга или 1-клик процедуры (видео показывает пример сетки скрининга).</li>
		<li>Сбор дифракционных данных в пределах диапазона -30 "/ 30".</li>
		<li>Перезапустить процедуру на ступенях 5.2.4-5.2.6 на другом кристалле в том же канале после перевода чипа.</li>
		<li>Вручную перестроить другой канал ChipX в центре держателя и вести сбор данных о кристаллах, присутствующих в этом канале.</li>
		<li>Используйте стандартные кристаллографические пакеты и процедуры для обработки и слияния данных, а затем для решения и уточнения структуры.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization.">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization.">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li><li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification.">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li><li>Betat, H., Rammelt, C., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+nucleotidyltransferases:+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization.">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li><li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Текущие протоколы в биокристаллографии включают в себя подготовку кристаллов с использованиемтаких методов, как диффузияпара или партия 13,14 , и их передача в микролупе длякрио-охлаждения 15,16 перед выполнением дифракции анализа в азотной струи в криогенных условиях. В отличие от этого, прямое кристаллическое крио-охлаждение не возможно в ChipX3 и кристаллы не могут быть извлечены из их микрофлюидного канала, который можно рассматривать как ограничения этой установки. Однако протокол, описанный в статье, предусматривает полностью интегрированный трубопровод для определения кристаллических структур при комнатной температуре (т.е. в более физиологических условиях). Несмотря на то, что сбор данных при комнатной температуреприводит к увеличению радиационного ущерба 19,этот эффект уравновешивается быстрым временем сбора данных (на каждом кристалле собирается максимальное вращение 60 градусов) и слиянием нескольких частичных наборов данных. Оба ChipX дизайн и материал были оптимизированы для уменьшения рассеяния фона и дифракциисигнала затухания 3, и сбор данных может быть выполнен на кристаллах с размерами, эквивалентными половине размера каналов (40 мкм)4.
Подводя итог, можно сказать, что основные преимущества протокола следующие. Кристаллы производятся в конвекционной среде (микрофлюидных каналах), что очень благоприятно для роста высококачественных кристаллов. Метод борьбы с диффузией, внедренный в ChipX, очень эффективен при скрининге ландшафта супернасыщения; диффузия кристаллантов в канал чипа создает концентрацию и волны супернасыщения, которая помогает определить соответствующие условия нуклеации и роста5. Кристаллы никогда непосредственно обрабатываются, но анализируются на месте, внутри чипа, который сохраняет их подлинные дифракционные свойства (т.е. не изменяет кристаллическую мозаику физическим взаимодействием или криоколированием)20. Дифракционный анализ проводится на серии кристаллов, распределенных по каналам чипа с низкой дозой воздействия, чтобы свести к минимуму повреждение излучения, и полный набор данных собирается путем слияния частичных данных из серии. Стандартный след и простой дизайн ChipX позволят в будущем полностью автоматизировать сбор данных на месте с использованием синхротрона или XFEL объектов. Все этапы протокола выполняются в ChipX. С точки зрения экспериментатора, установка чипов проста и проста в работе со стандартными трубами и не требует дополнительного оборудования. Соединение канала, похожее на дерево, на входе образца сводит к минимуму мертвые объемы в системе, что важно при работе с образцами, которые трудно очистить или которые доступны только в ограниченном количестве.
В заключение, подход «лаборатория-на-чипе», реализованный в ChipX, упрощает и эффективно миниатюризирует процесс кристаллизации путем определения контрдиффузии и кристаллической структуры, что позволяет перейти от образца к его 3D-структуре в одном устройстве. Он широко применим и предлагает удобное, экономически эффективное решение для обычных серийных исследований биокристаллографии при комнатной температуре.

Кристаллография является методом расшифровки 3D-архитектуры биологических макромолекул. Последнее важно понять, как фермент подбирает и обрабатывает свои субстраты. Определение кристаллической структуры требует кристаллизации целевого макромолекулы и кондиционирования кристаллов для их анализа рентгеновской дифракцией1. Как подготовка кристалла, так и обработка являются важными, но деликатными шагами, которые могут повлиять на качество кристалла и дифракционные свойства, и, таким образом, разрешение (т.е. точность) полученной 3D структуры. Для облегчения подготовки высококачественных кристаллов и устранения ненужной обработки для сохранения их дифракционных свойств, мы разработали удобное и универсальное микрофлюидное устройство под названием ChipX2,3,4.
В этой статье мы продемонстрируем, как загрузить белковый раствор в каналы ChipX с использованием обычного лабораторного материала для подготовки кристаллов путем контр-диффузии. Этот метод кристаллизации обеспечивает эффективный скрининг супернасыщения и потенциальных условий нуклеации вдоль микрофлюидных каналов, содержащих ферментный раствор из-за градиента концентрации, генерируемого диффузией кристаллизирующегоагента 5,6.
Установка чипа проста, она использует только стандартные лабораторные пипетки и не требует дорогостоящего оборудования. Когда кристаллы выросли в ChipX, лиганды фермента могут быть введены путем диффузии. Затем данные дифракции собираются при комнатной температуре по ряду кристаллов, содержащихся в каналах чипа с помощью синхротронного рентгеновского источника. Описанное здесь структурное исследование привело к определению структур фермента созревания тРНК в форме апо и в комплексе с аналогом его субстрата CTP, введенного путем замачивания. Этот белок под названием фермент, добавляемый к CCA, полимеризирует тринуклеотидный хвост CCA на 3'конце tRNAs. Сравнение двух 3D-изображений, полученных с помощью серийной кристаллографии, показывает локальные конформациальные изменения, связанные с связыванием лиганда в условиях, которые являются более физиологическими, чем те, которые используются в криокристаллографии. Протокол, описанный в этом видео, как правило, применим к любой биомолекуле, будь то белок, нуклеиновой кислоты или многокомпонентный комплекс.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

Подготовка кристаллов диффрактинга и их обработка перед рентген-анализом являются двумя критическими шагами биокристаллографических исследований. Мы описываем универсальный микрофлюидный чип, который позволяет производство кристаллов эффективным методом борьбы с диффузией. Среда, свободная от конвекции, предоставляемая микрофлюидными каналами, идеально подходит для роста кристаллов и полезна для распространения субстрата в активное место кристаллического фермента. Здесь мы применили этот подход к ферменту CCA-добавления психофильной бактерии Planococcus halocryophilus в представленном примере. После кристаллизации и субстратной диффузии/замачивания кристаллическая структура фермента: субстратный комплекс определялся при комнатной температуре по серийной кристаллографии и анализу нескольких кристаллов непосредственно внутри чипа. Вся процедура сохраняет подлинные дифракционные свойства образцов, поскольку она не требует обработки кристалла.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Описано универсальное микрофлюидное устройство, позволяющее кристаллизовать фермент с использованием метода контрдиффузии, введение субстрата в кристаллы путем замачивания и определение 3D-структуры фермента: субстратный комплекс путем последовательного анализа кристаллов внутри чипа при комнатной температуре.

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Здравствуйте, и добро пожаловать в лабораторию архитектуры и реактивности РНК в Институте молекулярной и клеточной биологии в Страсбурге. Выращивание хорошо обезврошаемых кристаллов является важным шагом в любом кристаллографическом исследовании. В этом видео мы продемонстрируем использование нового микрофлюидного инструмента для выращивания кристаллов биомолекулы и определения ее 3D-структуры с помощью рентгеновской дифракции на месте.Микрофлюидное устройство под названием ChipX представляет ряд преимуществ. Он предназначен для миниатюризации и облегчения кристаллизации активов методом противодействия диффузии. Его настройка проста и выполняется со стандартным лабораторным материалом.Он также оптимизирован для прямой характеристики кристаллов, выращенных в чипе, с помощью серийной рентгеновской кристаллографии. ChipX устраняет кристаллические обработки и крио-охлаждения шаги и сохраняет внутреннее качество кристаллов, которые анализируются на месте и при комнатной температуре. ChipX имеет формат слайда микроскопа, 7,5 на 2,5 сантиметра.Он содержит восемь микрофлюидных каналов, используемых в качестве камер кристаллизации с разделом 80 на 18 микрометров и длиной четыре сантиметра. Вход на левой стороне позволяет вручную впрыскить раствор биомолекулы, который будет заполнять восемь каналов до резервуаров. Решения кристаллизации откладываются в этих резервуарах на правой стороне.Кристаллизация вызвана явлением, называемым контр-диффузией. Когда кристаллизующий агент рассеивается в раствор биомолекулы и создает концентрацию и супер градиент насыщения. Этикетки и bost вдоль каналов помочь найти кристаллы легче.Настройка чипа требует от пяти до шести микролитров раствора биомолекулы при типичной концентрации от пяти до 10 миллиграммов на миллилитр. Одно микролитровое парафиновое масло, пять микролитров раствора кристаллизации на резервуар и клейкой лентой. Загрузка ChipX осуществляется вручную с помощью микропипетта и стандартных наконечников.Синий образец решения используется в этом примере для лучшей визуализации процесса инъекций. Чтобы избежать утечки, наконечник вставляется в образец вход перпендикулярно чип. Один микролитер парафинового масла загружается после образца, чтобы отделить каналы друг от друга.Затем вход в образец запечатывается лентой. Восемь резервуаров загружаются индивидуально пятью микролитров кристаллизирующегося раствора агента. Для этого наконечник пипетки помещается близко к концу канала под углом около 45 градусов.Это предотвращает образование воздушного пузыря между образцом и кристаллизирующимся агентом. Резервуары могут быть заполнены коктейлями, содержащими различные буферы, полимеры или соли и так далее, для скрининга или оптимизации. Водохранилища запечатаны скотчем.Как попродемонстрировано здесь, настройка чипа проста и занимает всего несколько минут. В ChipX кристаллизация происходит путем встречного диффузии. Кристаллизирующие агенты, депонирующиеся в резервуарах, рассеиваются в каналах, содержащих биомолекулу.Это создает градиенты концентрации и супер насыщенности, что вызовет кристаллизацию. Это примеры кристаллов фермента, полученного внутри каналов. Они могут расти, чтобы заполнить каналы, которые имеют поперечное сечение 80 на 80 микрометров.Кристаллы легко обнаруживаются в ChipX с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием естественной флуоресценции остатков триптофана под ультрафиолетовым светом, или, как показано здесь с помощью флуоресцентно помеченного белка. В этом разделе показан телеграфный анализ Криса, проведенный в швейцарском источнике света в Филаггринс Швейцарии. Чипы можно проведать к синхротрону без какого-либо дополнительного оборудования или специального ухода.Давайте войдите в зал швейцарского источника света. Электроны циркулируют в центральном кольце и генерируют широкий спектр электромагнитных волн, включая рентгеновские лучи, эксплуатируемые на различных лучах. Это видео было записано на X06, который является лучевой линией, посвященной макромолекулярной кристаллографии.Протокол может меняться от одного синхротронного объекта к другому, но общий принцип остается прежним. ChipX устанавливается на 3D печатный держатель. Затем этот держатель прикрепляется к магниту стандартного гониометра.Серийный анализ последовательно собирает данные из серии кристаллов, выращенных в чипе. Списки кристаллических позиций устанавливаются с использованием этикеток и bost вдоль каналов чипа. Исследователи перемещают чип в центр кристаллов в рентгеновском луче, символизируемом желтым окном.Запущена быстрая процедура центрирования с использованием рентгеновского луча. Остановка луча поднимается на место, и детектор движется к образцу. Скрининг сетки выполняется для обеспечения выравнивания кристалла с лучом.Та же процедура повторяется после вращения чипа на 30 градусов. Второй шаг важен, потому что материал чипа создает эффект параллакса, который приводит к сдвигу максимума дифракции по отношению к наблюдаемому кристаллическому положению. Как только кристалл центрируется в луче, начинается сбор данных.Эта последовательность показывает сбор данных в режиме реального времени. Чип вращается на 30 градусов. Между тем, соответствующие изображения дифракции собираются детектором.Характеристика этого кристалла завершена. Чип переводится на следующий кристалл в канале и вся процедура повторяется. Обратите внимание, что этот анализ работает на месте без непосредственной обработки кристалла и при комнатной температуре.Данные, собранные по ряду кристаллов, затем объединяются для получения полного набора данных дифракции, который используется для вычисления карты плотности электронов, показанной синим цветом, и для построения атомной модели. Процедура, описанная в этом видео, была применена в рамках структурной характеристики фермента модификации тРНК. Фермент CCA-добавляя от холодной адаптированной бактерии, галококка галокрифилы.ChipX был использован для кристаллизации фермента путем встречного диффузии в присутствии сульфида аммония в качестве кристаллизирующего агента. По-пирамидальные кристаллы появились вдоль каналов, после нескольких дней инкубации при 20 градусах по Цельсию. Флуоресцентная маркировка белка способствовала выявлению кристаллов белка и их дискриминации от кристаллов соли.Серия кристаллов была проанализирована на месте и при комнатной температуре. Их данные дифракции были объединены и привели к кристаллической структуре фермента APOE с разрешением 2,5 ангстрема. Кроме того, диффузия окружающей среды в чиповых каналах использовалась для доставки субстрата ферменту, который создает кристаллы.В данном случае аналог CTP был добавлен в решения резервуара за два дня до синхротронного анализа. Это позволило соединению рассеяться и достичь каталитического участка фермента. Как видно из кристаллической структуры комплекса определяется при разрешении 2,3 ангстрема.Протокол, продемонстрированый в этом видео, как правило, применим и был протестирован на различных биомолекулах. Для заключения ChipX является инструментом чипа Lab, который интегрирует все этапы кристаллографического исследования и позволяет перейти от биомедицинского решения к кристаллической структуре в уникальном микрофлюидальном устройстве. Спасибо за просмотр этого видео.и мы надеемся, что мы убедили вас в преимуществах использования ChipX для кристаллизации и определения кристаллической структуры ваших любимых Biomolecule.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Термостабилизации, Expression, очистки и кристаллизации Серотонин Transporter человека Обязанный<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Производство, Кристаллизация и структура Определение<em&gt; C. несговорчивый</em&gt; PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...