Name: crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip
Uploaded: 2021-03-20T14:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Författarna erkänner swiss light source (Villigen, Schweiz) för beamtime tilldelning till projektet på beamlines X10SA (PXII) och X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm för hennes bidrag till strukturförfining, Clarissa Worsdale för inspelning av voiceover och François Schnell (Université de Strasbourg) för hans hjälp i videoredigering och SFX. Detta arbete stöddes av det franska centret National de la Recherche Scientifique (CNRS), universitetet i Strasbourg. LabEx-konsortiet "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en doktorandfinansiering till R.dW från Excellence-initiativet (IdEx) vid universitetet i Strasbourg inom ramen för det franska nationella programmet "Investissements d'Avenir", en doktorandfinansiering till K.R. från det fransk-tyska universitetet (UFA-DFH, beviljar nej. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag nr. Mo 634/10-1). Författarna drog nytta av samarbetsprogrammet PROCOPE Hubert Curien (franska utrikesdepartementet och Deutscher Akademischer Austauschdienst).

1. Ställa in kristalliseringsanalyser i ChipX
OBS: ChipX mikrofluidiska enhet kan erhållas från författarna. En beskrivning av chippet ges i figur 1. Lösningar som innehåller kristallint (eller kristalliserande medel) som används för att utlösa kristallisering kan vara av kommersiellt ursprung eller beredda av experimenteraren.
<ol><li>Lastning av biomolekylprovet OBS: Den provvolym som faktiskt krävs för att utföra en individuell motdiffusionsanalys i den raka delen av varje kanal av ChipX är 300 nL. Men för bekvämlighet föreslår vi att ladda 5 μL för att helt fylla de åtta kanalerna med hänsyn till den varierande längden på deras böjda sektion och inlopp döda volymer.<ol>
<li>Rör 5 μL enzymlösningar med standard 10 μL rör och spets.</li>
		<li>För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera lösningen tills de åtta kanalerna fylls upp till sin motsatta ände (inmatning av kristallbehållaren).</li>
		<li>Injicera 1 μL paraffinolja i provinloppet för att koppla bort kanalerna från varandra.</li>
		<li>Återvinn den extra lösningen i kristallnedbehållaren i änden av varje kanal med en standardledning på 10 μL.</li>
		<li>Försegla provinloppet med en tejp på 1 cm x 1 cm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laddar kristalliseringslösningarna<ol>
<li>Rör 5 μL kristalliseringslösning med standard 10 μL rör och spets. Reservoarvolymen är 10 μL, men om du bara lastar hälften av den undviks spill vid tätning med tejp och underlättar ytterligare tillsats av ligand för blötläggningsexperiment. Om initiala kristalliseringsförhållanden erhölls genom ångdiffusion, öka kristallintkoncentrationen med en faktor 1,5 - 2. Lösningar kan vara olika i varje reservoar (i det presenterade fallet användes 1 M diammonium vätefosfat, 100 mM natriumacetat, pH 4,5 hela).</li>
		<li>Orientera rörspetsen mot kanalens ingång i den trattformade delen av behållaren för att undvika bildandet av en luftbubbla vid lösningsdeposition. Det skulle förhindra kontakten mellan de två lösningarna och kristallande diffusion i kanalen.</li>
		<li>Injicera kristallnedlösningen i behållaren.</li>
		<li>Försegla behållarna med en tejp på 2,5 cm x 1 cm.</li>
		<li>Inkubera chipet vid 20 °C (temperaturen kan justeras beroende på målet, vanligtvis mellan 4 och 37 °C 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Proteinmärkning med karboxyrhodamin för fluorescensdetektering
Obs: Det här steget är valfritt. Det måste utföras före provbelastning för att underlätta detektion av kristaller i chipet med fluorescens. Den detaljerade metoden för spår fluorescerande märkning beskrevs av Pusey och medarbetare7. Alla steg utförs vid rumstemperatur.
<ol><li>Lös upp 5 mg karboxyrhodaminesterpulver i 1 mL vattenfri dimetylformamid, dela lösningen i 0,6 μL alikvoter som ska förvaras vid -20 °C.</li>
	<li>Förbered en 1 M Na-borate pH 8,75 lagerlösning.</li>
	<li>Späd ut beståndet för att förbereda reaktionsbufferten vid 0,05 M Na-borat pH 8,75.</li>
	<li>Skölj en avsaltningskolonn (7 kDa MWCO, 0,5 ml) med 800 μL reaktionsbuffert.</li>
	<li>Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g, ta bort filtratet.</li>
	<li>Upprepa den här åtgärden två gånger (steg 2.4-2.5) för att tvätta kolonnen.</li>
	<li>Deponera 80 μL protein i sin lagringsbuffert på kolonnen (proteinet kan spädas ner till 1 mg/ml för att öka volymen vid behov).</li>
	<li>Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g. Detta steg är avsett att överföra proteinet från dess lagringsbuffert till reaktionsbufferten.</li>
	<li>Återvinn genomflödet (som innehåller proteinet i reaktionsbufferten) och blanda det med 0,6 μL karboxyrhodaminlösning.</li>
	<li>Inkubera 5 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Skölj under tiden kolonnen 3 x med lagringsbufferten, centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g och kassera filtratet.</li>
	<li>Sätt in reaktionslösningen på kolumnen.</li>
	<li>Centrifugera kolonnen i 1 min vid 1400 x g och återställ genomflödet (dvs. lösning av märkt protein i lagringsbufferten).</li>
	<li>Komplettera stamproteinlösningen med 0,1-1 % (w/w) märkt protein.</li>
	<li>Ställ in ChipX kristalliseringsanalyser enligt beskrivningen i avsnitt 1.</li>
	<li>Kontrollera förekomsten av proteinkristaller i analyserna genom att spännande fluorescerande sonden med en 520 nm våglängdsljuskälla.</li>
</ol>3. Kristallobservation
OBS: ChipX-enheten kan hanteras utan särskild försiktighet, även med kristaller inuti, förutom om temperaturen behöver kontrolleras.
<ol><li>Använd stereomikroskop för att kontrollera resultatet av kristalliseringsanalyser i ChipX. Dess fotavtryck har standardmåtten på mikroskopbilder och är kompatibelt med alla system och glidhållare.</li>
	<li>Kontrollera innehållet i mikrofluidkanaler som börjar från behållaren där kristallnedhalten är högst till provinloppet där kristallhalten är den lägsta. ChipX-materialet är transparent för synligt ljus, kompatibelt med användning av polarisatorer, samt med UV-belysning för proteinkristallidentifiering genom inneboende tryptofanfluorescens8.</li>
	<li>Registrera kristallpositioner med hjälp av etiketterna som är präglade längs kanalerna eller markera kristallplatser med en permanent markör genom att rita färgpunkter bredvid dem på spånytan.</li>
</ol>4. Kristall blötläggning med ligands
OBS: Den här proceduren är valfri. Det används för att introducera ligands, enzymsubstrat eller tunga atomer i kristallerna och bör utföras minst 24-48 h före röntgenanalys för att tillåta den sammansatta diffusionen längs kanalerna och in i kristallerna.
<ol><li>Ta försiktigt bort tätningstejpen från reservoarerna.</li>
	<li>Lägg till upp till 5 μL ligandlösning i en eller flera reservoarer med en 10 μL mikropipet (i exemplet tillsattes 3 μL 10 mM cytidin-5'-[(α,β)-methyleno] triphosphate (CMPcPP) lösning för att uppnå en slutlig koncentration på 3,75 mM). CMPcPP är en icke-hydrolizable analog av CTP, ett naturligt substrat av enzymet.</li>
	<li>Försegla behållarna med en tejp på 2,5 cm x 1 cm.</li>
	<li>Inkubera chipet under kontrollerad temperatur i 24-48 h för att möjliggöra ligand diffusion längs chipens kanaler.</li>
</ol>5. Kristallanalys genom seriell kristallografi
OBS: Denna del av protokollet måste anpassas beroende på strållinjens inställning och kristallens diffraktionsegenskaper. Endast allmänna indikationer ges för den kristallografiska analysen baserad på experiment utförda vid X06DA beamline (SLS, Villigen, Schweiz).
<ol><li>ChipX montering på beamline goniometern OBS: Filen för 3D-utskrift av ChipX-hållaren finns i ref4.<ol>
<li>Stäng av strållinens kryostråle. Analysen här utförs vid rumstemperatur.</li>
		<li>Montera ChipX på en dedikerad hållare med kanalen som innehåller kristallerna som ska analyseras placerade i mitten av hållaren. ChipX-hållaren 4 kräver ingen skruv eller ytterligare del, eftersom den är utformad för att ge en perfekt passform för ChipX.</li>
		<li>Fäst hållaren på goniometern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Datainsamling<ol>
<li>Orientera det tjockaste lagret (översta skiktet, figur 1) av ChipX (i denna orientering är etiketter längs kanalerna direkt läsbara med hjälp av strållinjens centrerande kamera), mot direktstrålen och det tunnaste ansiktet bakom kristallen för att minimera diffractedsignalens diffractedsignal enligt beskrivningen i ref3.</li>
		<li>För att undvika kollision mellan ChipX och det omgivande materialet (beamstop, collimator), begränsa goniometerrörelserna i intervallet ±30° (0° vilket motsvarar kanalerna som är vinkelräta mot röntgenstrålen).</li>
		<li>Hitta kristaller position med hjälp av etiketterna präglade längs kanalerna.</li>
		<li>Välj en kristallposition.</li>
		<li>Centrera kristallen antingen genom standard screening med låg dos grid/raster eller 1-klicksprocedur (videon visar ett exempel på rutnätsscreening).</li>
		<li>Samla in diffraktionsdata inom intervallet -30° / +30°.</li>
		<li>Starta om proceduren i steg 5.2.4-5.2.6 på en annan kristall i samma kanal efter översättning av chippet.</li>
		<li>Justera manuellt en annan ChipX-kanal i mitten av hållaren och fortsätt datainsamlingen på kristaller som finns i denna kanal.</li>
		<li>Använd standardkristallografiska paket och procedurer för att bearbeta och sammanfoga data och sedan lösa och förfina strukturen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gieg&#233;, R., Sauter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocrystallography:+past,+present,+future.">Biocrystallography: past, present, future.</a> HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).</li><li>Dhouib, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+the+crystallization+of+biomacromolecules+by+counter-diffusion+and+on-chip+crystal+X-ray+analysis.">Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).</li><li>Pinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChipX:+A+Novel+Microfluidic+Chip+for+Counter-Diffusion+Crystallization+of+Biomolecules+and+in+Situ+Crystal+Analysis+at+Room+Temperature.">ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature.</a> Crystal Growth &amp; Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).</li><li>de Wijn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+versatile+microfluidic+device+for+efficient+biomacromolecule+crystallization+and+structural+analysis+by+serial+crystallography.">A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography.</a> IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).</li><li>Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supersaturation+wave+of+protein+crystallization.">A supersaturation wave of protein crystallization.</a> Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+fluorescent+labeling+for+protein+crystallization.">Trace fluorescent labeling for protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).</li><li>Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+methods+of+fluorescence-based+protein+crystal+identification.">Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).</li><li>Betat, H., Rammelt, C., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+nucleotidyltransferases:+ancient+catalysts+with+an+unusual+mechanism+of+polymerization.">tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).</li><li>Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., J&#252;hling, F., Betat, H., M&#246;rl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+of+tRNA+nucleotidyltransferases:+A+tradeoff+in+activity,+stability+and+fidelity.">Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity.</a> RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).</li><li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography.">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).</li><li>Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Gieg&#233;, R., Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+-+General+Methods.">Crystallization - General Methods.</a> International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. , 99-120 (2012).</li><li>Garman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cool"+crystals:+macromolecular+cryocrystallography+and+radiation+damage.">"Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -. P., Weik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+and+dose+limits+in+serial+synchrotron+crystallography+at+cryo-+and+room+temperatures.">Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).</li><li>Nave, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Imperfections+in+Protein+Crystals.">Description of Imperfections in Protein Crystals.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Nuvarande protokoll inom biokristallografi innebär beredning av kristaller med metoder som ångdiffusion eller sats13,14, och deras överföring till en mikroloop för kryokylning15,16 innan diffraktionsanalysen utförs i en kvävestråle vid kryogena förhållanden. Däremot är direkt kristall cryo-kylning inte möjligt i ChipX3 och kristaller kan inte extraheras från deras mikrofluidiska kanal, vilket kan ses som begränsningar för denna installation. Det protokoll som beskrivs i artikeln ger dock en helt integrerad rörledning för bestämning av kristallstrukturer vid rumstemperatur (dvs. under mer fysiologiska förhållanden). Även om datainsamling vid rumstemperatur orsakar en ökning avstrålningsskador 19, uppvägs denna effekt av snabb datainsamlingstid (högst 60° rotation samlas in på varje kristall) och genom sammanslagning av flera partiella datamängder. Både ChipX design och material optimerades för att minska bakgrundsspridning och diffraktionssignaldämpning3, och datainsamling kan utföras på kristaller med dimensioner motsvarande hälften av kanalerna (40 μm)4.
Sammanfattningsvis är de viktigaste fördelarna med protokollet följande. Kristallerna produceras i en konvektionsfri miljö (mikrofluidiska kanaler), vilket är mycket gynnsamt för tillväxten av högkvalitativa kristaller. Den motdiffusionsmetod som implementeras i ChipX är mycket effektiv vid screening av övermättnadslandskapet; diffusionen av kristallaner i spånkanalen skapar en koncentrations- och övermättnadsvåg som hjälper till att bestämma lämpliga nukleations- och tillväxtförhållanden5. Kristaller hanteras aldrig direkt, men analyseras på plats, inuti chipet, som bevarar deras äkta diffraktionsegenskaper (dvs. förändrar inte kristallmosaik genom fysisk interaktion eller kryokylning)20. Diffraktionsanalysen utförs på en serie kristaller som distribueras längs chipkanalerna med låg dosexponering för att minimera strålningsskador, och en fullständig datauppsättning monteras genom sammanslagning av partiella data från serien. ChipX standardavtryck och enkla design kommer i framtiden att möjliggöra en fullständig automatisering av in situ-datainsamling med hjälp av synkrotron- eller XFEL-anläggningar. Alla steg i protokollet utförs i ChipX. Från experimenterarsynpunkt är spåninställningen enkel och enkel att utföra med standardrör och kräver ingen extra utrustning. Den trädliknande kanalanslutningen vid provinloppet minimerar döda volymer i systemet, vilket är viktigt när du arbetar med prover som är svåra att rena eller som endast är tillgängliga i begränsad mängd.
Sammanfattningsvis förenklar och miniatyriserar lab-on-a-chip-metoden som implementeras i ChipX och miniatyriserar effektivt kristalliseringsprocessen genom kontradiffusion och kristallstrukturbestämning, vilket gör det möjligt att gå från provet till dess 3D-struktur i en enda enhet. Det är allmänt tillämpligt och erbjuder en användarvänlig, kostnadseffektiv lösning för rutinmässiga seriella biokristallografiundersökningar vid rumstemperatur.

Kristallografi är en metod för att dechiffrera 3D-arkitekturen hos biologiska makromolekyler. Det senare är viktigt för att förstå hur ett enzym väljer och bearbetar sina substrat. Bestämningen av en kristallstruktur kräver kristallisering av målmakromolekylen och kristallens konditionering för deras analys genom röntgendiffraktion1. Både kristallberedning och hantering är avgörande men känsliga steg som kan påverka kristallkvalitet och diffraktionsegenskaper, och därmed upplösningen (dvs. noggrannheten) för den resulterande 3D-strukturen. För att underlätta beredningen av högkvalitativa kristaller och eliminera onödig hantering för att bevara deras diffraktionsegenskaper designade vi en användarvänlig och mångsidig mikrofluidisk enhet som heter ChipX2,3,4.
I den här artikeln kommer vi att visa hur man laddar proteinlösningen i ChipX-kanaler med konventionellt laboratoriematerial för att förbereda kristaller genom motdiffusion. Denna kristalliseringsmetod ger en effektiv screening av övermättnad och av potentiella nukleationsförhållanden längs de mikrofluidiska kanalerna som innehåller enzymlösningen på grund av koncentrationsgradienten som genereras av diffusionen av kristalliserande medel5,6.
Chipinställningen är enkel, den använder bara standard laboratorierör och kräver ingen dyr utrustning. När kristaller har vuxit i ChipX kan enzymens ligands introduceras genom diffusion. Diffraktionsdata samlas sedan in vid rumstemperatur på en serie kristaller som finns i chipens kanaler med hjälp av en synkrotronröntgenkälla. Den strukturella studien som beskrivs här ledde till bestämning av strukturer av en tRNA mognad enzym i sin apo form och i komplex med en analog av dess CTP substrat införs genom blötläggning. Detta protein som kallas CCA-tillsatsande enzym polymeriserar CCA-trinukleotidsvansen i 3' änden av tRNAs. Jämförelsen av de två 3D-bilderna som erhållits genom seriell kristallografi avslöjar de lokala konformationsändringarna relaterade till bindningen av ligand under förhållanden som är mer fysiologiska än de som används i kryokristallografi. Protokollet som beskrivs i denna video är allmänt tillämpligt på alla biomolekyler, vare sig det är ett protein, en nukleinsyra eller ett multikomponentkomplex.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axioscope A1 stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyrhodamine succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-6157</td>
			<td>Protein labeling (step 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMPcPP</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-438</td>
			<td>Crystal soaking (step 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal clear sealing tape</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td>ChipX sealing&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafin oil</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td>HR3-411</td>
			<td>ChipX loading&#160; (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker 2 extended+</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer - Representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td>Xtal Concepts Gmbh</td>
			<td>XtalLight100c</td>
			<td>Crystal observation&#160; (step 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba spin desalting column 7K MWCO</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td>Protein labeling&#160; (step 2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and structural determination of an enzyme:substrate complex by serial crystallography in a versatile microfluidic chip

Beredningen av väldriffande kristaller och deras hantering före röntgenanalysen är två kritiska steg i biokristallografiska studier. Vi beskriver ett mångsidigt mikrofluidiskt chip som möjliggör produktion av kristaller med den effektiva metoden för motdiffusion. Den konvektionsfria miljön som tillhandahålls av de mikrofluidiska kanalerna är idealisk för kristalltillväxt och användbar för att sprida ett substrat till det kristallina enzymets aktiva plats. Här tillämpade vi detta tillvägagångssätt på CCA-adderande enzymet av den psykiska bakterien Planococcus halocryophilus i det presenterade exemplet. Efter kristallisering och substrat diffusion/blötläggning bestämdes kristallstrukturen i enzymet: substratkomplexet vid rumstemperatur genom seriell kristallografi och analys av flera kristaller direkt inuti chipet. Hela proceduren bevarar provens äkta diffraktionsegenskaper eftersom det inte kräver någon kristallhantering.

Det mikrofluidiska chipet som beskrivs här var utformat för att möjliggöra enkel installation av kristalliseringsanalyser och kristallanalys vid rumstemperatur. Förfarandet som beskrivs ovan och i videon tillämpades inom ramen för den strukturella karakteriseringen av CCA-adderande enzym från den kall-anpassade bakterien Planococcus halocryophilus. Detta enzym tillhör en essentiell polymerasfamilj som katalyserar den sekventiella tillsatsen av 3' CCA-sekvensen på tRNAs med CTP och ATP9,10.
Chipet användes först för att förbereda kristaller av enzymet för strukturell analys med hjälp av metoden för motdiffusion. För detta ändamål laddades enzymlösningen i de åtta mikrofluidkanalerna (kristalliseringskammare) genom en enda injektion i chipens provinlopp (se figur 1). Enzymet användes vid 5,5 mg/ml i sin lagringsbuffert som innehöll 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl och 5 mM MgCl2. Detta steg utfördes manuellt med en standard 10 μL mikropipet. Kristalliseringslösningar (100 mM natriumacetat pH 4,5,1 M diammonium vätefosfat) deponerades sedan i reservoarerna vid den andra änden av kanalerna.
Lastningsförfarandet är enkelt och tar inte längre tid än fem minuter (figur 2). Kristallintet sprider sig sedan in i kanalerna, skapar en gradient av koncentration som utlöser kristallkärna och tillväxt. Denna gradient utvecklas dynamiskt och utforskar ett kontinuum av övermättnad tillstånd5,6 tills man når en jämvikt av kristallned koncentration mellan kanalerna och reservoaren. Kristalliseringsanalyser kontrolleras vanligtvis under mikoscopet under en period av 2- 4 veckor för att spåra tillväxten av kristaller. Bipyramidala kristaller av CCA-tillsatsande enzym uppträdde i kanalerna efter några dagars inkubation vid 20 °C (figur 3). Den valfria fluorescerandemärkningen 7 av proteinet underlättar i hög grad identifieringen av proteinkristaller och deras diskriminering från saltkristaller (figur 4).
Vi utnyttjade den diffusa miljön i spånkanaler för att leverera ett substrat till enzymet som bygger upp kristallerna. I det aktuella fallet tillsattes CMPcPP, en CTP-analog, till reservoarlösningarna vid en slutlig koncentration på 3,75 mM (figur 5). Detta tillägg utfördes två dagar före den kristallografiska analysen för att cmpcpp ska kunna nå och uppta enzymets katalytiska plats, vilket senare bekräftades av kristallstrukturen (se nedan).
Vi tillverkade en spånhållare (figur 6) i polylaktisk syra med hjälp av en 3D-skrivare. Hållaren möjliggör spånmontering på gonimetrar med hjälp av vanliga magnetiska huvuden. Därför kan chipet enkelt placeras och översättas i röntgenstrålen för att föra kristallerna i diffraktionsläge. Datainsamlingsstrategin måste anpassas beroende på strållinjeegenskaper och kristallegenskaper. När det gäller CCA-adderande enzym samlades data in vid röntgen- och X10SA-strållinjer, swiss light source (SLS), med en röntgenvåglängd på 1,0 Å respektive Pilatus 2M-F respektive 6M pixeldetektorer. 30-60° rotation samlades in på varje kristall vid rumstemperatur med bilder på 0,1° eller 0, 2° och 0, 1 s exponering (se tabell 1). Partiella datamängder bearbetades individuellt och klipptes när upplösningen av diffraktionsmönster började förfalla på grund av strålningsskador (detekterades av minskningen av signal-till-brusförhållandet <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png" style="margin: 0"> och CC1/2, och en ökning avR-meas i det högupplösta skalet). Fullständiga datamängder rekonstruerades genom sammanslagning av data från 5 kristaller (tabell 1). Kristallstrukturer härleddes genom molekylär ersättning med hjälp av kristallografiska standardförpackningar och procedurer för databehandling11 och förfining12. Jämförelsen av enzymens strukturer och dess komplex med CMPcPP avslöjar den lokala konformationsanpassningen som åtföljer substratbindning på det aktiva området för CCA-adderande enzym (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig01.jpg"> Bild 1: ChipX-design. Chippet består av ett toppskikt av COC (tjocklek: 1 mm) där åtta mikrofluidiska kanaler och reservoarer är inpräntade. Hela chipet är förseglat med ett lager COC (tjocklek: 0,1 mm). Alla kanaler är anslutna till ett enda inlopp på vänster sida för samtidig provinjektion och till enskilda reservoarer på höger sida där kristalliseringslösningar deponeras. Kanalerna, som utgör chipets faktiska kristalliseringskammare, är 4 cm långa och har ett tvärsnitt på 80 μm x 80 μm. Etiketter (A1, A2, A3 osv.) präglade längs kanalerna underlättar kristallpositionering under mikroskopet och upprättande av en provlista för datainsamling. ChipX har storleken på en standardmikroskopbild (7,5 cm x 2,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig02.jpg"> Figur 2:Ställa in kristalliseringsanalyser i ChipX. 1) Deponera 5-6 μL enzymlösningar med standard 10 μL rör och spets. 2) För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera lösningen i de åtta kanalerna. 3) Rör 1 μL paraffinolja. 4) För in spetsen vertikalt i provinloppet och injicera oljan för att koppla bort kanalerna från varandra. 5) Försegla inloppet med en bit tejp. 6) Rör 5 μL kristalliseringslösning med standard 10 μL rör och spets. Lösningar kan vara olika i varje reservoar (t.ex. från ett screeningkit). 7) Orientera rörspetsen mot kanalens ingång i behållarens trattformade del (för att undvika bildandet av en luftbubbla vid lösningsdeposition) och injicera kristalllösningen i behållaren. 8) Försegla reservoarerna med en bit tejp och inkubera chipet vid kontrollerad temperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig03.jpg"> Figur 3:Kristaller av CCA-tillsatsande enzym som odlas genom motdiffusion i ChipX mikrofluidiska kanaler. Skalstrecket är 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig04.jpg"> Bild 4:Kristall blötläggningsprocedur. 1) Ta försiktigt bort tejpen från reservoarerna. 2) Deponera upp till 5 μL ligandlösning med en 10 μL mikropipet. 3) Tillsätt ligand i en eller flera reservoarer. 4) Försegla reservoarerna igen med en tejpbit och inkubera chipet under kontrollerad temperatur i 24-48 timmar före datainsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig05.jpg"> Figur 5: Spår fluorescerande märkning diskriminerar protein (vänster) från salt (höger) kristaller. Den CCA-tillsatsande enzymlösningen innehöll 0,4 % (w/w) protein märkt med karboxyrhodamin. Till höger belyses kristaller med en 520 nm våglängdsljuskälla och bilden är tagen med ett lågpassfilter vid 550 nm (LP550); (inset) struktur av carboxyrhodamine-succinimidyl ester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig06.jpg"> Bild 6: (Vänster) Ritning av ChipX-hållaren och (höger) ChipX monterad på goniometern för beamline X06DA vid SLS (Villigen, Schweiz) för seriell kristallanalys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61972/61972fig07.jpg"> Figur 7: Jämförelse av CCA-tillsatsande enzym aktivt ställe i apoform (i rosa) och i komplexet med en CTP-analog (i grönt). Även om den övergripande konformationen av enzymet inte påverkas, åtföljs bindningen av CMPcPP ligand av en liten omorganisation av sidokedjor på den aktiva platsen. 2Fo-Fc elektrontäthetskarta (i blått) är konturerad vid 1,2 sigma. Skillnaden elektrontäthetskarta konturerad vid 4 sigma (i grönt) bekräftar närvaron av ligand på den aktiva platsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61972/61972fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kristalliserat prov</td>
			<td>CCA-tillsatsande enzym</td>
			<td>CCA-adderande enzym + CMPcPP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristallanalys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Röntgenstrålelinje</td>
			<td>SLS – X06DA</td>
			<td>SLS – X10SA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Våglängd (Å)</td>
			<td>1.000</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatur (K)</td>
			<td>293</td>
			<td>293</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektor</td>
			<td>Pilatus 2M-F</td>
			<td>Pilatus 6M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristalldetektoravstånd (mm)</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristaller insamlade</td>
			<td>6</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristaller markerade</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotationsområde per bild (°)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exponeringstid per bild (er)</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nej. av markerade bilder</td>
			<td>1000</td>
			<td>540</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt rotationsområde (°)</td>
			<td>100</td>
			<td>108</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rymdgrupp</td>
			<td>P43212</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>
a, c (Å)</td>
			<td>71.5, 293.8</td>
			<td>71.4, 293.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genomsnittlig mosaikitet (°)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Upplösningsområde (Å)</td>
			<td>46 – 2.54 (2.6 – 2.54)</td>
			<td>48 – 2.3 (2.4 – 2.3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt antal. av reflektioner</td>
			<td>176105 (9374)</td>
			<td>232642 (32937)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nej. av unika reflektioner</td>
			<td>23922 (1598)</td>
			<td>34862 (4066)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullständighet (%)</td>
			<td>90.6 (84.6)</td>
			<td>99.5 (100.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Redundans</td>
			<td>7.5 (6.0)</td>
			<td>6.7 (8.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61972/61972eq1.png"></td>
			<td>8.1 (1.3)</td>
			<td>6.9 (0.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (%) §</td>
			<td>18.6 (126.0)</td>
			<td>18.0 (231.2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2 (%) £</td>
			<td>98.7 (55.0)</td>
			<td>98.7 (46.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total B-faktor från Wilson plot (Å2)</td>
			<td>57.4</td>
			<td>60.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kristallografisk förfining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Nej. reflektioner, arbetsset /testuppsättning</td>
			<td>23583 / 1180</td>
			<td>34840 / 3405</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutlig Rcryst (%) /R-fri (%)</td>
			<td>18.8 / 21.4</td>
			<td>20.0 / 22.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nej. av icke-H-atomer: totalt / protein / ligand / lösningsmedel</td>
			<td>2998 / 2989 / 0 / 9</td>
			<td>3057 / 2989 / 29 / 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>R.m.s. avvikelser för obligationer (Å) / vinklar (°)</td>
			<td>0.009 / 1.23</td>
			<td>0.010 / 1.22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genomsnittliga B-faktorer (Å2): totalt / protein / ligand / lösningsmedel</td>
			<td>60.1 / 60.1 / 0 / 52.7</td>
			<td>62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ramachandran plot: mest gynnad (%) / tillåten (%)</td>
			<td>98.1 / 1.9</td>
			<td>97.2 /  2.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>PDB-ID</td>
			<td>6IBP (på 6IBP)</td>
			<td>6Q52 (på 6Q52)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Statistik över insamling och förfining av uppgifter
§ Redundansoberoende Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Ii(hkl)- <I(hkl)>| / ΣhklΣi i(hkl), där N är datamultiplikationen 17.
£ Data med låg <I/σ(I)> i yttre skal (<2.0) inkluderades baserat på CC1/2-kriterium (korrelation mellan två slumpmässiga halvor av datauppsättningen > 50%) enligt Karplus & Diederichs 18.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip at JoVE.com

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

En mångsidig mikrofluidisk anordning beskrivs som möjliggör kristallisering av ett enzym med hjälp av motdiffusionsmetoden, införandet av ett substrat i kristallerna genom blötläggning och 3D-strukturbestämningen av enzymet: substratkomplex genom en seriell analys av kristaller inuti chipet vid rumstemperatur.

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Hej, och välkommen till laboratoriearkitekturen och reaktiviteten hos RNA vid Institutet för molekylär- och cellbiologi i Strasbourg. Att odla välföraktande kristaller är ett kritiskt steg i alla kristallografiska studier. I den här videon kommer vi att demonstrera användningen av ett nytt mikrofluidiskt verktyg för att odla kristaller av en biomolekyl och bestämma dess 3D-struktur genom in situ-röntgendiffraktion.Den mikrofluidiska enheten som kallas ChipX har flera fördelar. Det är utformat för att miniatyrisera och underlätta kristalliseringstillgångar med hjälp av motdiffusion. Dess uppsättning är enkel och utförs med standardlabbmaterial.Det är också optimerat för direkt karakterisering av kristaller som odlas i chipet genom seriell röntgenkristallografi. ChipX eliminerar kristallhantering och kryokylningssteg och bevarar den inneboende kvaliteten på kristallerna som analyseras på plats och vid rumstemperatur. ChipX har formatet av en mikroskopbild, 7,5 x 2,5 centimeter.Den innehåller åtta mikrofluidiska kanaler som används som kristalliseringskammare med en sektion av 80 gånger 18 mikrometer och en längd på fyra centimeter. Inloppet på vänster sida möjliggör manuell injektion av biomolekyllösningen som fyller de åtta kanalerna upp till reservoarerna. Kristalliseringslösningar deponeras i dessa reservoarer på höger sida.Kristalliseringen utlöses av ett fenomen som kallas kontraspridande. När kristalliseringsmedlet sprids till biomolekyllösningen och skapar en koncentration och en supermättnadsgradient. Etiketter och bost längs kanalerna hjälper till att hitta kristallerna lättare.Att sätta upp ett chip kräver fem till sex mikroliter biomolekyllösning vid en typisk koncentration av fem till 10 milligram per milliliter. En mikroliter paraffinolja, fem mikroliter kristalliseringslösning per reservoar och tejp. Lastningen av ChipX utförs manuellt med en mikropipett och standardtips.En blå provlösning används i det här exemplet för en bättre visualisering av injektionsprocessen. För att undvika läckage sätts spetsen in i provintaget vinkelrätt mot chippet. En mikroliter paraffinolja laddas efter provet för att separera kanalerna från varandra.Provinloppet förseglas sedan med tejp. De åtta reservoarerna laddas individuellt med fem mikroliter kristalliserande agentlösning. För att göra det placeras pipettspetsen nära kanalens ände i en vinkel på ca 45 grader.Detta förhindrar bildandet av en luftbubbla mellan provet och kristalliseringsmedlet. Reservoarer kan fyllas med cocktails som innehåller olika buffertar, polymerer eller salter, etc. för screening eller optimering. Reservoarer förseglas med tejp.Som visats här är det enkelt att sätta upp ett chip och tar bara några minuter. I ChipX sker kristallisering genom motdiffusion. Kristalliserande medel som deponeras i reservoarerna sprider sig i kanalerna som innehåller biomolekylen.Detta skapar koncentrationsgradienter och supermättnad som utlöser kristallisering. Dessa är exempel på kristaller av ett enzym som erhålls inuti kanalerna. De kan växa för att fylla kanalerna som har ett tvärsnitt på 80 med 80 mikrometer.Kristaller kan lätt detekteras i ChipX genom fluorescensmikroskopi med hjälp av den naturliga fluorescensen av tryptofanrester under UV-ljus, eller som visas här med hjälp av ett fluorescerande märkt protein. Det här avsnittet visar en Chris telegrafisk analys utförd på schweizisk ljuskälla i filaggrins Schweiz. Chipsen kan transporteras till synkrotronen utan ytterligare utrustning eller särskild försiktighet.Låt oss gå in i hallen av schweizisk ljuskälla. Elektroner cirkulerar i den centrala ringen och genererar ett brett spektrum av elektromagnetiska vågor, inklusive röntgenstrålar som utnyttjas vid olika strållinjer. Denna video spelades in på X06, som är en beamline tillägnad makromolekylär kristallografi.Protokollet kan ändras från en synkrotronanläggning till en annan, men den övergripande principen förblir densamma. ChipX är monterat på en 3D-utskriven hållare. Denna hållare fästs sedan på magneten på en vanlig goniometer.Den seriella analysen samlar konsekvent in data från en serie kristaller som odlas i chipet. Listor över kristallpositioner upprättas med hjälp av etiketter och bost längs spånkanalerna. Forskare flyttar chippet för att centrera kristallerna i röntgenstrålen som symboliseras av det gula fönstret.En snabb centreringsprocedur med röntgenstrålen lanseras. Strålstoppet går upp på plats och detektorn rör sig mot provet. Nätgallrets avskärmning utförs för att säkerställa att kristallen är i linje med strålen.Samma procedur upprepas efter att chipet roterats med 30 grader. Det andra steget är viktigt eftersom chipmaterialet skapar en parallaxeffekt som leder till en förskjutning av diffraktionsgränsen med avseende på den observerade kristallpositionen. Så snart kristallen är centrerad i strålen startar datainsamlingen.Den här sekvensen visar datainsamling i realtid. Chippet roterar med 30 grader. Under tiden samlas motsvarande diffraktionsbilder in av detektorn.Karakteriseringen av denna kristall är fullständig. Chipet översatt till nästa kristall i kanalen och hela proceduren upprepas. Observera att denna analys används på plats utan direkt hantering av kristallen och vid rumstemperatur.Data som samlas in på en serie kristaller slås sedan samman för att erhålla en fullständig diffraktionsdatauppsättning som används för att beräkna en elektrontäthetskarta, som visas i blått, och för att bygga atommodellen. Förfarandet som beskrivs i denna video tillämpades inom ramen för den strukturella karakteriseringen av tRNA modifiering enzym. Det CCA-adderande enzymet från den kallanpassade bakterien Planococcus halocryophilus.ChipX användes för att kristallisera enzymet genom motdiffusion i närvaro av ammoniumsulfid som kristalliserande medel. By-pyramidal kristaller uppträdde längs kanalerna, efter några dagars inkubation vid 20 grader Celsius. Proteinets fluorescerande märkning underlättade identifieringen av proteinkristaller och deras diskriminering från saltkristaller.En serie kristaller analyserades på plats och vid rumstemperatur. Deras diffraktionsdata slogs samman och ledde till kristallstrukturen i APOE-enzymet med en upplösning på 2,5 angstrom. Dessutom utnyttjades miljöspridningen i spånkanaler för att leverera ett substrat till enzymet som bygger upp kristallerna.I förevarande fall lades en CTP analog till i reservoar lösningarna två dagar före synchrotron analys. Detta gjorde det möjligt för föreningen att sprida och nå enzymets katalytiska plats. Som ses i kristallstrukturen i komplexet bestämd med en upplösning på 2,3 angstrom.Protokollet som visas i denna video är allmänt tillämpligt och har testats på en mängd olika biomolekyler. Avslutningsvis är ChipX ett Lab-chipverktyg som integrerar alla steg i en kristallografisk studie och låter dig gå från den biomedicinska lösningen till kristallstrukturen i en unik mikrofluidisk enhet. Tack för att du tittade på den här videon.och vi hoppas att vi har övertygat dig om fördelarna med att använda ChipX för att kristallisera och bestämma kristallstrukturen hos dina favoriter av Biomolecule.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding och zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Framställning av Giant vesiklar inkapslande mikrosfärer genom centrifugering av en vatten-i-olja-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...