Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

تم تمويل العمل من قبل كرسي البحوث الكندية في علم وظائف الأعضاء الجزيئية النوم. ويشكر المؤلفان كلوي بروفوست وكارولين بوشار على المساعدة التقنية.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة ومباشرة لمراقبة نشاط ECoG و EMG أثناء التلاعب بالأهداف الجزيئية باستخدام AAVs. للمقارنة الكافية بين المجموعات، يوصى بشدة بالتخطيط دائما للإجراءات الجراحية (حقن AAV وزرع الأقطاب الكهربائية) في نفس اليوم لاختبار الحيوانات والتحكم فيها، وتسجيل إشاراتها الكهربية في وقت واحد. للحصول على تعبير فيروسي مماثل بين الاختبار والتحكم ، من المستحسن حقن نفس التيتر الفيروسي. في هذه الحالة، انخفض titer الفيروسية للسيطرة AAV إلى نصف اختبار AAV لضمان التعبير الفيروسي مماثلة. يجب على المجربين توخي الحذر الشديد مع قياسات الإحداثيات الاستريوتاكسيكية لضمان انخفاض التباين بين الحيوانات في منطقة الدماغ / استهداف الطبقة القشرية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن عمق الحقن يتم حسابه من سطح الجمجمة ، وأن سمك الجمجمة يختلف باختلاف العمر والجنس ، يجب دائما التحقق من وضع القنية باستخدام علم الأنسجة بعد البروتوكول أو الكيمياء المناعية (على سبيل المثال ، الشكل 2)لضمان تحديد المواقع / عمق الحقن بشكل كاف ، وينبغي تعديل الإحداثيات الاستريوتاكسيكية إذا لزم الأمر. في جميع أنحاء حقن AAV 40 دقيقة، من المهم جدا لرصد سرعة الحقن للكشف بسرعة وتصحيح القضايا المحتملة مثل انسداد المضخة. بعض الخطوات التجريبية هي أيضا حاسمة للحصول على إشارات الفيزيولوجيا الكهربائية الأمثل. على سبيل المثال، لا يفرط في crew أثناء زرع القطب. يجب أن تخرج البراغي من الجمجمة بمقدار 2.5 ملم على الأقل لتقليل الأضرار التي لحقت بالقشرة الدماغية وتشكيل ندبة جلتية. بعد ذلك ، من المهم للغاية أيضا أن أ) تجنب تطبيق الأسمنت على أطراف الأقطاب الكهربائية ، 2) ضمان لحام سريع للأقطاب الكهربائية إلى الموصل ، و3) تأكد من عدم وجود اتصال بين الأقطاب الكهربائية.
الإجراء المعروض هنا لتسجيل ECoG و EMG راسخ للغاية وبسيط ويستخدم على نطاق واسع لمراقبة اليقظة والنوم في الفئران2و11و13و34. يمكن إجراء تسجيلات ECoG و EMG المستمرة لعدة أيام متتالية (وحتى أسابيع) وتوليد مجموعة بيانات غنية جدا يمكن استخدامها لأداء عدة خطوط من التحليل تتضمن متغيرات تتعلق باليقظة وكمية النوم والهندسة المعمارية2و11و12 (على سبيل المثال ، الوقت الذي يقضيه في حالات مختلفة لكل فترات ضوئية ومظلمة ، وعدد الحلقات في كل ولاية ، توزيع النوم على مدار 24 ساعة) واليقظة والمحتوى الطيفي للنوم34و41 (على سبيل المثال، الطاقة في نطاقات تردد مختلفة [على غرار الشكل 3]،والنشاط الخالي من النطاق)، وخصائص الموجات الفردية42و43و44 (على سبيل المثال، اتساع الموجة البطيئة والمنحدر). عند استخدامها في تركيبة مع التلاعب الجزيئي بوساطة AAV ، فإن الميزة الإضافية هي تجنب التعويض التنموي المحتمل الذي يمكن أن يحدث في الحيوانات المعدلة وراثيا. مع الممارسة، يمكن إجراء الإجراء كله، بما في ذلك حقن AAV 40 دقيقة، في حوالي 90 دقيقة. يجب أن يكون معدل الوفيات منخفضا (جدا) لأن الجراحة طفيفة التوغل.
الاستخدام المتزامن لتسجيل ECoG / EMG والتلاعب المستهدف مع AAV يوفر مجموعة متنوعة من المزايا والتطبيقات الأخرى. فعلى سبيل المثال، تكون دقة الاستهداف الاستريوتاكزي، عند أدائها على نحو كاف، عالية جدا ويمكن تكرارها ومفيدة لتحديد الدور المحدد لمنطقة معينة من الدماغ (و/أو نوع الخلية أو عنصر جزيئي داخل المنطقة) في تنظيم النوم أو العمليات الفسيولوجية الأخرى. وبالتالي يمكن استهداف العديد من المناطق القشرية المختلفة بسهولة باستخدام تعديلات البروتوكول الحالي. وعلاوة على ذلك، يمكن توجيه عمليات التلاعب المستهدفة باستخدام مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى منطقة قشرية/تحت القشرية تختلف عن مواقع تسجيل المركبات الكهربائية. في مثل هذه الحالات، يمكن تغطية ثقب التجشؤ لحقن AAV بواسطة غطاء زجاجي صغير ثابت باستخدام أسمنت الأسنان (أو شمع العظام). لتعزيز خصوصية، وبناء AAV غالبا ما يتضمن المروج الذي يسمح العدوى المستهدفة من نوع الخليةالدقيقة 14. تم استخدام مروج CamKIIα في البروتوكول الحالي لاستهداف الخلايا الهرمية المثيرة14و29و45على وجه التحديد من قشرة المحرك. وقد مكنت هذه الاستراتيجية تعطيل cofilin (باستخدام cofilinS3D)32،33 في الخلايا العصبية مثير من القشرة الحركية ومراقبة التغيرات الخاصة للدولة في نشاط ECoG ( الشكل3). لتقييم فعالية العدوى / النقل ، يمكن لمستخدمي البروتوكول في المستقبل الجمع بين بروتوكول AAV-ECoG المقدم مع واحد من التلطيخ المشترك عن طريق الفلورة المناعية ، واستخدام صور التكبير العالية لحساب عدد الخلايا التي تظهر وضع علامات مزدوجة من العدد الإجمالي للخلايا التي تظهر وسمة واحدة للهدف (هنا ، الخلايا العصبية المعبرة عن CaMKIIα). في دراسة حديثة، تم استخدام طريقة AAV-ECoG مماثلة لتلك الموصوفة هنا للإفراط في التعبير عن البروتين الهش المرتبط بمتلازمة التخلف العقلي X 1 (FXR1) في جميع الخلايا العصبية في القشرة الحركية باستخدام AAV يحتوي على مروج synapsin وكشف عن تأثير هذا التلاعب على توزيع حالة اليقظة والمحتوى الطيفي28. توضح هذه النتائج كيف يمكن أن يكشف التلاعب بجزيء معين في منطقة الدماغ المستهدفة باستخدام AAVs عن أدوار في تنظيم معلمات اليقظة / النوم المحددة.
أحد قيود البروتوكول الموصوف هو الآفة الصغيرة لأنسجة الدماغ التي تحدث مع وضع القنية قبل إجراء حقن AAV ، والتي يمكن أن تكون مصحوبة أيضا باستجابة التهابية. وهذا يمكن أن يكون مصدر قلق خاص عند إجراء حقن AAV في المناطق تحت القشرية وينبغي دائما معالجتها باستخدام ضوابط كافية. وبدلا من ذلك، يمكن أن يتبع البروتوكول الحالي تحديد كمي للغليوسيس التفاعلي و/أو التنشيط المجهري (على سبيل المثال، استخدام الفلورة المناعية) لضمان مستويات مماثلة في مجموعات التحكم والاختبار، وبالتالي، على قراءات مجموعة ال ECoG. ويتعلق القيد الثاني بخطر وجود اتصال سيئ بين القطب الكهربائي والموصل، مما قد يؤدي إلى إشارة كهربية كهربية سيئة باستمرار أو في بعض الأحيان. سوف مشدود بقوة، لحام، والأقطاب الكهربائية عززت تقليل وقوع هذه المسألة. ويرتبط القيد الثالث بالحيوانات التي يتم ربطها عبر مونتاج الرأس أثناء التسجيل ، مما قد يحد من الحركة والسلوكيات الأخرى ، على الأقل إلى حد ما ، ويؤدي أحيانا إلى تلف الكابلات وفقدان الإشارة. وأخيرا، فإن البروتوكول المعروض هو أكثر ملاءمة للفئران البالغة، بالنظر إلى أن حجم الجمجمة للحيوانات الأصغر سنا قد يسبب صعوبات في تركيب المونتاج الرأس يصور، كما هو موضح سابقا2.
كما ينطبق تسجيل ECoG/EMG المشترك والتلاعب بوساطة AAV لهدف دقيق على مجالات البحث بخلاف علم الأعصاب للنوم. من بين أمور أخرى، يمكن استخدامه لدراسة والتلاعب أحداث الصرع في النماذج الحيوانية من الاستيلاء وهو أداة قوية لتعديل ذبذبات الدماغ المشاركة في ترميز الذاكرة وتوطيد46،47. وبناء على ذلك، تشمل التطبيقات المحتملة بالتأكيد مجالات البحوث الأساسية في الطب النفسي والأعصاب، بما في ذلك الأمراض العصبية. بالإضافة إلى القدرة على التعبير عن شكل غير نشط من جزيء، يمكن أن تستخدم AAVs وقد استخدمت للتعبير المفرط أو downregulate (على سبيل المثال، الجيش الملكي النيبالي الصغيرة التدخل، CRISPR/Cas9) أو لإنقاذ التعبير عن جزيء في KO كامل الجسم. الأهم من ذلك ، فإن المنهجية المزدوجة للبروتوكول الحالي تنطبق أيضا على أنواع الثدييات الأخرى مثل الفئران والقوارض النهارية التي تمثل نماذج مثيرة للاهتمام لفهم كل من النوم والتنكس العصبي48،49.

تستخدم تسجيلات تخطيط الدماغ الكهربائي (أو الكهربائي الكهربائي عموما [ECoG] في القوارض) والتسجيلات الكهربية (EMG) على نطاق واسع في أبحاث النوم وكذلك على نطاق أوسع في علم الأعصاب والأعصاب والطب النفسي. في تركيبة, هذه الإشارات الكهربية تسمح لتحديد الدول اليقظة والتحديد الكمي اللاحقة لمدة الدولة وتكوين الطيفية, على حد سواء في البشر والقوارض1,2,3,4. وقد كان هذا القياس الكمي مفيدا لفهم كيفية تعديل النوم في الحالات المرضية مثل الأمراض العصبية والنماذج5و6و7 أو عن طريق التعديل الوراثي8و9. على سبيل المثال، تبين أن خروج المغلوب (KO) من الجينات المختلفة المرتبطة بالاتصالات العصبية لتغيير مدة اليقظة والنوم في كل من الماوس والفاكهة يطير10،11،12،13. لمعالجة التعويض التنموي المحتمل الناشئ عن دراسة KO كامل الجسم في القوارض والسماح للسيطرة الدقيقة على التلاعب الجيني ، فإن الطريقة الفعالة للتلاعب بالتعبير الجيني هي استخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs). ويمكن استخدام التلاعب الجيني AAV بوساطة إلى أسفل أو upregulate هدف جزيئي معين وتقييد التلاعب إلى مجموعة خلايا محددة باستخدام أنواع مختلفة من المروجين14. AAVs تستخدم أيضا على نطاق واسع كوسيلة التسليم في تتجمع بانتظام بين متباعدة يكرر palindromic قصيرة (CRISPR) / Cas9 التكنولوجيا15،16. وتسمح هذه المنهجيات بتحسين التحكم الزمني والمكاني في التلاعب الجيني، الذي يرتبط عموما بتعبير المراسل الذي يسمح بالقياز الكمي للمنطقة المصابة باستخدام الفلورة المناعية.
AAVs تمثل أيضا الناقل الرئيسي للتلاعب نوع الخلية الخاصة من نشاط الخلايا العصبية عن طريق علم الوراثة البصرية وchemogenetics17,18,19, التي استخدمت على نطاق واسع في البحوث الحديثة على الأمراض العصبية, سلوك, الإدراك, والنوم20,21,22. في أبحاث النوم ، كان تطبيق علم الوراثة البصرية لتنشيط أو تثبيط مناطق معينة من الدماغ ، مثل الدماغ الأمامي القاعدي ، وتحت المهاد ، وtegmentum تحت الأضلاع ، مفيدا لتحديد أدوارهم في التحكم في الإثارة ، والنوم البطيء الموجة (المعروف أيضا باسم النوم غير السريع لحركة العين) ، والنوم (أو النوم السريع لحركة العين) ، والكاتابلكسي23، 24،25. وعلاوة على ذلك، ساعدت التلاعبات بوساطة AAV في توضيح الدوائر التنظيمية الهامة للنوم والجزيئات التي تساهم في الآثار السلبية لفقدان النوم26و27و28. على سبيل المثال، بروتين واحد تبين أن متورطة في ضعف الذاكرة الناجم عن الحرمان من النوم هو كوفلين29،30. هذا البروتين هو بروتين قطع أكتين خيوط التي تشارك في إعادة تنظيم خيوط أكتين عن طريق ملزمة جسديا إلى أكتين وتعزيز تفكيك خيوط بطريقة ديناميكية31. تثبيط نشاط كوفلين باستخدام نهج AAV بوساطة ثبت لمنع فقدان العمود الفقري، فضلا عن اللدونة متشابك والعجز في الذاكرة الناجمة عن الحرمان من النوم في الفئران29. بشكل جماعي ، تؤكد هذه الدراسات على فائدة وأهمية التلاعب بوساطة AAV لفهم تنظيم النوم وعواقب الحرمان من النوم في القوارض.
هنا ، يتم وصف بروتوكول يجمع بين زرع قطب ECoG و EMG والتسجيل مع التلاعب بوظيفة الكفيلين في منطقة قشرة الدماغ من الفئران البرية (WT) باستخدام AAV. وبشكل أكثر دقة، يتم حقن AAV (النمط المصلي 9) الذي يعبر عن تسلسل الترميز لشكل فوسفوميميتيك من كوفلين الماوس (cofilinS3D)،مما يجعله غير نشط32،33، في قشرة المحرك (M1 و M2). يتم زرع قطب ECoG مباشرة في موقع الحقن لضمان تسجيل النشاط القشري المتزامن للخلايا المصابة. يتم إجراء تسجيل ECoG / EMG لمدة 24 ساعة في ظل ظروف غير مضطربة بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة للسماح بالتعافي والتكيف والتعبير العالي عن cofilinS3D. ثم يستخدم التسجيل لتحديد حالات اليقظة والتحليل الطيفي ECoG ، كما هو موضح في الدراسات السابقة11،34. يمكن أن تكشف هذه المنهجية على وجه التحديد كيف يعدل الكفيل القشري اليقظة وإشارات ECoG أثناء النوم في الفئران. هذا المزيج من التسجيلات الكهربية والتلاعب الجيني بوساطة AAV وثيق الصلة بشكل خاص للتحقيق في أدوار العناصر الجزيئية المختلفة في وظائف الدماغ المحددة ويمكن تطبيقه على منطقة الدماغ القشرية (وشبه القشرية) ذات الاهتمام في WT والفئران المعدلة وراثيا من كلا الجنسين وحتى الأنواع الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

استخدام التسجيلات الكهربائية القشرية (ECoG) في القوارض ذات الصلة لأبحاث النوم ودراسة مجموعة واسعة من الحالات العصبية. تستخدم الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs) بشكل متزايد لتحسين فهم دوائر الدماغ ووظائفها. كان التلاعب بوساطة AAV لخلايا محددة و / أو المكونات الجزيئية الدقيقة مفيدا للغاية لتحديد الدوائر التنظيمية للنوم الجديدة / الجزيئات والبروتينات الرئيسية التي تساهم في الآثار السلبية لفقدان النوم. على سبيل المثال، يمنع تثبيط نشاط الكوفلين البروتيني الخيطي الذي يقطع أكتين باستخدام AAV ضعف الذاكرة الناجم عن الحرمان من النوم. هنا، يتم وصف بروتوكول يجمع بين التلاعب في وظيفة كوفلين في منطقة قشرة الدماغ مع تسجيل نشاط ECoG لدراسة ما إذا كان الكفيلين القشري يعدل إشارات ECoG اليقظة والنوم. يتم إجراء حقن AAV خلال نفس العملية الجراحية مثل زرع أقطاب ECoG والكهربائية (EMG) في الفئران البالغة من الذكور والإناث. الفئران مخدرة ورؤوسها حليقة بعد تنظيف الجلد وشق، يتم تحديد إحداثيات ستيريوتاكسيك من القشرة الحركية، ويتم ثقب الجمجمة في هذا الموقع. يتم وضع قنية مملوءة مسبقا مع AAV التعبير عن كوفلينS3D، وهو شكل غير نشط من كوفلين ، ببطء في الأنسجة القشرية. بعد ضخ AAV ، يتم تثبيت البراغي المغطاة بالذهب (أقطاب ECoG) من خلال الجمجمة وترسيخها في الجمجمة مع إدخال أسلاك ذهبية في عضلات الرقبة (أقطاب EMG). يسمح للحيوانات ثلاثة أسابيع للتعافي وضمان التعبير الكافي عن cofilinS3D. يتم التحقق من المنطقة المصابة ونوع الخلية باستخدام الكيمياء المناعية ، ويتم تحليل ECoG باستخدام التحديد البصري لولايات اليقظة والتحليل الطيفي. وباختصار، فإن هذا النهج المنهجي المشترك يسمح بالتحقيق في المساهمة الدقيقة للمكونات الجزيئية التي تنظم مورفولوجيا الخلايا العصبية والاتصال بتنظيم نشاط قشرة الدماغ المتزامنة أثناء اليقظة والنوم.

بعد التسجيلات الكهربية، يتم استخدام immunofluorescence لتحديد المنطقة المصابة بالحقن AAV والتحقق من صحة التعبير عنcofilin S3D (الشكل 2). يمكن إجراء التخسين المناعي باستخدام منهجية مشابهة لما تم وصفه سابقا29،37،38،39. AAV يعبر عن شكل غير نشط من كوفلين تنصهر مع hemagglutinin (HA) - الوسم (cofilinS3D-HA) ، والتي يتم الكشف عنها عن طريق immunofluorescence باستخدام الأجسام المضادة لها وأجسام مضادة ثانوية (اليكسا فلور 488). الخلايا العصبية المثيرة المصابة (هنا، المستهدفة بالبروتين المعتمد على الكالسيوم / كالمودولين كيناز الثاني ألفا [CamKIIα] المروج السيطرة على التعبير عن المتحولين الواردة في AAV) ملطخة بالأجسام المضادة ل HA. ويشار إلى عدوى ناجحة من قبل تلطيخ الخلايا العصبية في القشرة الحركية المحيطة موقع الحقن (الشكل 2A, B). في هذا المثال التمثيلي، لم تظهر قشرة الدماغ في نصف الكرة الآخر أي تلطيخ ملحوظ. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن الخلايا العصبية المثيرة يمكن أن تؤدي إلى مناطق الدماغ البعيدة ، فإن التلطيخ في نصف الكرة الأرضية ليس بالضرورة مؤشرا على الحقن غير الناجح. وأظهر ارتفاع التكبير في المنطقة المصابة تلطيخ أجسام الخلايا وإسقاطاتها، مما يؤكد أن خلايا محددة فقط من المنطقة القشرية المستهدفة أصيبت(الشكل 2C).
يمكن أيضا إجراء تلطيخ مشترك مع علامات الخلايا العصبية المثيرة (على سبيل المثال ، ناقل الغلوتامات المركبات 1 ، CaMKIIα) للتحقق من صحة خصوصية نوع الخلية. بدلا من ذلك، يمكن إجراء تلطيخ مشترك مع علامات الخلايا العصبية المثبطة أو الخلايا الفلكية في حالة استهداف هذه الخلايا باستخدام مروجين مختلفين. كما تم تنفيذ تلطيخ مشترك من كوفلينS3D-HA وCaMKIIα في نفس الحيوان لمنطقة أكثر الخلفي لموقع الحقن التي لا تزال تظهر تلطيخ المضادة HA في القشرة الحركية(الشكل 2D). تظهر صورة التكبير الأعلى للمنطقة الخلايا التي تعبر بوضوح عن كوفلينS3D-HA (أليكسا فلور 488، الشكل 2E)وCaMKIIα (أليكسا فلور 568، الشكل 2F). ويكشف التراكب من cofilinS3D-HA و CaMKIIα تلطيخ أن معظم (إن لم يكن كل) الخلايا الملطخة لكوفلينS3D-HA هي أيضا إيجابية لCaMKIIα (الشكل 2G). تدعم هذه الملاحظة خصوصية العدوى للخلايا العصبية المثيرة.
لتقييم تأثير التلاعب بالكوفلين على نشاط ECoG ، يتم استخدام إشارات ECoG و EMG لإجراء تحديد مرئي لولايات اليقظة (اليقظة ، نوم الموجة البطيء ، النوم التناقضي). ويتم ذلك على 4-s العهود بسبب التغير السريع في حالة اليقظة في الماوس2، وهنا ، لتسجيل كامل 24 ساعة. وتشمل التحليلات القياسية حساب بنية النوم ومتغيرات التحليل الطيفي، كما أجريت سابقا لمجموعاتالبيانات المختلفة11و12و13و28و34. وعلى وجه الخصوص، فإن التحليل الطيفي لإشارة مجموعة ال ECoG لمختلف الدول سيفهرس تكوين الدولة وجودتها. لإزالة الاختلافات التي يمكن أن تنشأ، على سبيل المثال، من أعماق مختلفة من الأقطاب الكهربائية، يمكن التعبير عن بيانات التحليل الطيفي بالنسبة إلى القوة الإجمالية لجميع الدول من معين(الشكل 3A). وبالنظر إلى السعة النسبية المنخفضة جدا لنشاط ECoG في الترددات الأعلى ، فقد تم تحويل أطياف الطاقة النسبية لليقظة ، والنوم البطيء للموجة ، والنوم التناقضي إلى تصور أكثر ملاءمة ومقارنة النشاط في نفس الوقت بترددات منخفضة وعالية. يشير هذا التحليل إلى الاختلافات الخاصة بالدولة في النشاط الطيفي في ظل ظروف تعطيل الكفيلين(الشكل 3B). وبشكل أكثر دقة، تشير هذه النتائج الأولية التي تجمع بين الفئران الذكور والإناث إلى أن تعطيل الكفيلين يزيد بشكل كبير من القوة الطيفية في الترددات السريعة (14-30 هرتز) أثناء اليقظة وفي الترددات البطيئة (1-4 هرتز) أثناء النوم التناقضي، مع ترك نشاط ECoG أثناء النوم البطيء الموجة دون أن يتأثر بشكل رئيسي. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن تعطيل cofilin لزيادة التباين بين الماوس في نشاط ECoG (ملحوظ بشكل خاص من أشرطة الخطأ لليقظة في الشكل 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> الشكل 1:إعداد مكونات المونتاج ECoG /EMG ومثال تمثيلي لوضع القطب ECoG. (أ)قطب ECoG: 4 مم طويلة، 0.2 مم قطرها سلك ذهبي (غير معزول) تنصهر على رأس المسمار المغطى بالذهب (1.9 مم قطر الرأس، 1.14 مم الخيط قطر رئيسي، 3.6 مم الطول الإجمالي) باستخدام لحام خالية من الرصاص. (B) أقطاب EMG: سلكان ذهبيان (1.5 و 2 سم) منحنيان لاحتضان منحنى الجمجمة حتى عضلة الرقبة ، ويتم الاحتفاظ بالطرف الآخر مباشرة ليتم لحامه إلى الموصل. (C) موصل 6 قنوات: يضاف لحام خالية من الرصاص إلى 5 من 6 دبابيس معدنية (حذف واحد في الوسط) من الموصل (5 مم × 8 ملم × 8 ملم + 3 ملم دبابيس معدنية). الجزء العلوي من الموصل مغطى بشريط لتجنب تسرب القمامة/ المياه. (د)مثال لتحديد المواقع من مسامير الصيانة الثلاثة على الجمجمة في نصف الكرة الأيسر وثلاثة أقطاب ECoG (بما في ذلك القطب المرجعي) على نصف الكرة الأيمن. ويشار إلى الإحداثيات المجسمة الدقيقة لأقطاب ECoG في الخطوتين 2.6 و3.2 وتم حسابها وفقا لموقع البريغما واللامدا (التي تشير إليها النقاط الصفراء). الاختصارات: ECoG = القشرة الكهربائية؛ EMG = الكهروميوغرافيا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> الشكل 2: التمثيل المناعي لتحديد المنطقة المصابة AAV ونوع الخلية. (أ)تمثيل تخطيطي يظهر موقع حقن الشريحة التاجية المعروضة في اللوحة B. الموضع هو 1.1 مم الأمامي إلى bregma، وكان الهدف من القنية (هو مبين باللون الأحمر) إلى طبقات الخامس من القشرة الحركية الأولية اليمنى (M1). تمثيل تعديل من فرانكلين وباكسينوس40. (ب) مناعة HA للكشف عن التعبير cofilinS3D-HA في الخلايا العصبية هو مبين لشريحة تاجية من الدماغ الكامل تقع ما يقرب من 1.1 مم الأمامي إلى bregma. المنطقة المصابة أساسا المترجمة إلى طبقات الخامس والسادس (طبقات تحت الحبوب) من القشريات الحركية الأولية والثانوية الحق (M1 و M2). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يمثل المربع المنطقة الموضحة في C. (C) تكبير أعلى للمنطقة المصابة يظهر تلطيخ الخلايا المصابة وتأكيد التعبير عن cofilinS3D-HA في طبقات أعمق من قشرة المحرك. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (D) مناعة مشتركة من HA وCaMKIIα لتقييم خصوصية نوع الخلية الموضحة لشريحة تاجية من نصف الكرة الأيمن تقع حوالي 0.5 مم الأمامي إلى bregma وبالتالي، الخلفي إلى موقع الحقن (نفس الماوس كما هو الحال في لوحات B و C). المنطقة المصابة موضعية إلى القشريات الحركية (M1 و M2 أساسا). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يمثل المربع المنطقة الموضحة في E و F و G. (E) تكبير أعلى للمنطقة المصابة يظهر تلطيخ الخلايا المصابة وتأكيد التعبير عن cofilinS3D-HA. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (F) تكبير أعلى للمنطقة المصابة يظهر تلطيخ الخلايا الإيجابية CaMKIIα. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (G) تكبير أعلى للمنطقة المصابة يظهر الوسم المشترك للكوفلينS3D-HA وCaMKIIα ، مما يؤكد أن الخلايا المصابة إيجابية CaMKIIα. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. المختصرات: AAV = فيروس مرتبط بال أدينو؛ M1 = القشرة الحركية الأساسية. M2 = القشرة الحركية الثانوية; CPu = بوتامين caudate (المخطط)؛ LV = البطين الجانبي; HA = هيماغلوتينين; CamKIIα = الكالسيوم / كالمودولين تعتمد على البروتين كيناز الثاني ألفا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> الشكل 3: أطياف الطاقة التمثيلية لليقظة ، وبطء نوم الموجة ، والنوم التناقضي الذي تم الحصول عليه بعد التلاعب الفيروسي بوظيفة الكفيلين. ذكر (ن = 5 لكل مجموعة) وأنثى (ن = 2 لكل مجموعة) الفئران حقن مع AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA (titer الفيروسية 2.58 × 1013 GC / مل) أو مع عنصر تحكم A تم تسجيلAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1.25 ×10 13 GC/mL؛ نصف titer الاختبار للتحكم في الإشارة المحسنة لهذا التحكم AAV) في الطبقة الخامسة من القشرة الحركية لمدة 24 ساعة، وخضعت الإشارة الكهربائية القشرية للتحليل الطيفي (تحويل فورييه السريع لحساب القوة الطيفية بين 0.5 و 30 هرتز بدقة 0.25-هرتز). (أ)أطياف الطاقة خلال الدول الثلاث اليقظة أعرب نسبة إلى القوة الكلية لجميع الدول. (ب)سجل أطياف الطاقة النسبية التي تحولت إلى أكثر ملاءمة تمثل اختلافات المجموعة في الترددات العالية. قمع نشاط الكوفلين في القشرة الحركية باستخدام AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA يزيد بشكل كبير من النشاط الكهربائي في نطاق بيتا (14-30 هرتز) أثناء اليقظة ، وفي نطاق دلتا (1-4 هرتز) أثناء النوم متناقض بالمقارنة مع حقن التحكم (خطوط حمراء فوق محاور x تشير مان ويتني U-اختبارعلى تردد الفرقة السلطة p < 0.05). المختصرات: AAV = الفيروس المرتبط بال أدينو GC = نسخ الجينوم؛ HA = هيماغلوتينين; CamKIIα = الكالسيوم / كالمودولين تعتمد على البروتين كيناز الثاني ألفا; eGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

تصف هذه المقالة بروتوكولا للتلاعب بالأهداف الجزيئية في قشرة الدماغ باستخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو ورصد آثار هذا التلاعب أثناء اليقظة والنوم باستخدام التسجيلات الكهربائية.

التسجيل الكهربائي لمناطق القشرة الدماغية التي تم التلاعب بها باستخدام فيروس مرتبط بال أدينو يستهدف كوفلين في الفئران

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد دور أهداف جزيئية فردية محددة في تنظيم النشاط الكهربائي خلال حالات فيجيلين المختلفة. من بين فوائد استخدام الفيروس المرتبط بال أدينو هو القدرة على استهداف منطقة معينة في الدماغ ونوع معين من الخلايا على وجه التحديد. إثبات البروتوكول سيكون جوليان دوفورت جيرفيه، باحث مشارك من فريقي.بعد التأكد من عدم وجود استجابة لرد الفعل قرصة إصبع القدم في مخدر الماوس 12 أسبوعا من العمر، واستخدام أداة تشذيب الشعر لحلاقة الشعر من الجزء الخلفي من الأذنين إلى الجزء الأمامي من الرأس بين العينين. إضافة قطرة سخية من مرهم العيون إلى كل عين لمنع الجفاف واستخدام قضبان الأذن لإصلاح بعناية رأس الماوس على جهاز ستيريوتاكسيك. سحب اللسان بلطف من الفم لتجنب الاختناق.إصلاح أنف الفأرة للجهاز واستخدام 70٪ الإيثانول لتعقيم الجلد المكشوفة على الرأس. عقد الجلد مع ملقط Graefe غرامة اضافية، واستخدام مقص الأنسجة لقطع الجلد من قاعدة الأذنين إلى مستوى العينين ووضع اثنين من المشابك الجراحية على كل جانب من شق لتمتد الجلد وتعريض الجمجمة. تجنب خياطة الدماغ، استخدم طرف مقص لخدش سطح الجمجمة لإزالة الغشاء المحيطي وخلق خطوط متداخلة في اتجاهين أو أكثر.استخدام الإيثانول 70٪ لإزالة شظايا العظام وتطهير الجمجمة. مع قنية أعدت سابقا ثابتة على الذراع ستيريوتاكسيك، وتحديد موقع bregma ولامدا ونلاحظ إحداثيات ستيريوتاكسيك من كل. استخدام الذراع ستيريوتاكسيك وقلم لوضع علامة على موقف القنية على الجمجمة 1.5 ملليمتر الحق الجانبي إلى خط الوسط و 1.5 ملليمتر الأمامي إلى bregma.باستخدام بت حفر 0.7 ملليمتر، اخترق بعناية الجمجمة في موقف ملحوظ عمودي على سطح الجمجمة ومحاذاة مع المحور الرأسي وغسل الجمجمة مع طرف القطن العقيم غارقة في محلول اليود بيتادين بوفيدوني 10٪، ثم التراجع عن المكبس من حقنة 10 ميكرولتر بواسطة ميكرولتر واحد لتحميل قنية مع فقاعة الهواء ميكروليتر واحد. بعد ذلك، اخلطي خليط AAV من الاهتمام مع الأنابيب البطيئة وأضف 1.7 ميكرولتر من الخليط إلى طبق بيتري معقم. استخدم هذه الحقنة لتحميل 1.5 ميكرولتر من المحلول في القنية ووضع علامة على موضع فقاعة الهواء على أنبوب PE50 المتصل.عموديا محاذاة القنية مع ثقب في الجمجمة بحيث تصل القنية إلى الحافة العليا من العظام ووضع علامة على تنسيق Z من سطح الجمجمة. خفض ببطء قنية حتى الطرف يصل إلى 1.5 ملليمتر تحت سطح الجمجمة وطبقة خمسة من قشرة المحرك وبدء مضخة حقنة بمعدل تدفق 0.025 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لتقديم ميكرولتر واحد من AAV على مدى 40 دقيقة. استخدام فقاعة الهواء في أنبوب لتتبع الحقن، وإجراء أي تعديلات حسب الضرورة.عندما يتم تسليم الحجم الكامل للفيروس، اترك القنية في مكانها لمدة خمس دقائق لضمان انتشار كاف وتجنب التدفق الخلفي قبل رفع الذراع المجسمة ببطء وبعناية لإزالة القنية من القشرة. لزرع القطب الكهربائي، استخدم ملقط كيلي المستقيم لشد قطب كهربائي واحد ببطء بسلك ذهبي مستقيم في المحور الرأسي للثقب الذي تم حقن AAV فيه، تاركا ما لا يقل عن 2.5 ملليمتر من المسمار خارج الجمجمة لتقليل الضرر الذي لحق بالدورا والقشرة الدماغية. استخدام قلم لوضع علامة على موقف القطب المرجعي 2.6 ملليمتر الحق الجانبي إلى خط الوسط و0.7 ملليمتر الخلفي إلى bregma وموقف القطب الكهربائي الخلفي في 1.5 ملليمتر الجانب الأيمن إلى خط الوسط و 1.5 ملليمتر الأمامي إلى لامبدا ومواقف ثلاثة مسامير الصيانة على نصف الكرة الأيسر مع عدم وجود إحداثيات محددة، ولكن بعيدة قدر الإمكان عن بعضها البعض ومن الأقطاب الكهربائية.استخدام الحفر لثقب بعناية الجمجمة عمودي على سطح الجمجمة في المواقف ملحوظ من الأقطاب الكهربائية الأخرى ومسامير وغسل الجمجمة مثقوبة مع محلول اليود 10٪povidone. كتلة الثقوب مع قطع صغيرة تدحرجت من مسح مهمة حساسة قبل تثبيت مسامير لمنع النزيف والتلوث واستخدام ملقط كيلي على التوالي لإدراج مسامير في ثقوب الحفر في نفس الزاوية التي تم ثقب الثقوب. ضع بضع قطرات صغيرة من أسمنت الأسنان في وسط الفضاء الشبيه بالحلقة داخل البراغي واستخدم ملقط Graefe فائق الغرامة لرفع الجلد فوق عضلات الرقبة.باستخدام Dumont رقم خمسة ملقط، عقد الطرف المنحني من قطب كهربائي واحد وإدراجه ما يقرب من 1-2 ملليمتر في العضلات. ضع الجانب المنحني ونقطة الطي للقطب الكهربائي في أسمنت الأسنان وأدخل القطب الكهربائي الثاني بنفس الطريقة. بعد تغطية عيون الحيوان، وتطبيق الضوء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لترسيخ الاسمنت واستخدام أسمنت الأسنان إضافية لتغطية قاعدة الأقطاب الكهربائية ومسامير مرساة لتشكيل كفاف على شكل تاج.بعد تطبيق ثلاث إلى خمس دقائق أخرى من الضوء، وملء مركز المونتاج مع الاسمنت الاكريليك وإزالة المشابك الجراحية. استخدم خياطة أحادية الفلترة قابلة للامتصاص الاصطناعية لإغلاق الجلد في الجزء الأمامي والخلف من المونتاج بحيث لا تتعرض الجمجمة واستخدام ملقط منحني لتثبيت الموصل فوق المونتاج لمحاذاة الأسلاك الذهبية للأقطاب الكهربائية بعناية مع دبابيس الموصل ، ثم سرعان ما يلحام كل طرف قطب كهربائي إلى دبوس موصل واحد مقابل. بعد إزالة الماوس من الإطار، قم بتغطية المساحة الفارغة بين الموصل والرأس باستخدام الاسمنت الأكريليك.وبعد وزنها، ضع الماوس في قفص نظيف مع غطاء غير متشابك على لوحة الحرارة. بعد أسبوعين من الجراحة، قم بتوصيل الفئران بتسجيل الكابلات وبعد أسبوع واحد على الأقل، سجل الإشارات الكهربائية والكهروميوغرافية لمدة 24 ساعة أو أكثر. يتم تأكيد العدوى الناجحة عن طريق تلطيخ HA للخلايا العصبية داخل القشرة الحركية المحيطة بموقع الحقن ، مما يشير إلى وجود cofilin S3D HA. تلطيخ مشترك مع علامة الخلايا العصبية مثير CaMKII ألفا يشير واضحة cofilin S3D HA وCaMKII ألفا التعبير المشترك تحت التكبير عالية.سجل تحول أطياف الطاقة النسبية لليقظة، والنوم موجة بطيئة، والنوم متناقضة تظهر الاختلافات الخاصة بالدولة في النشاط الطيفي تحت تعطيل كوفلين. وينطبق الجمع بين التسجيل الكهربائي والتلاعب بوساطة AAV للأهداف الجزيئية الدقيقة أيضا على مناطق الدماغ المتعددة وعلى مجالات فرعية أخرى في علم الأعصاب مثل البحث في الصرع أو الذاكرة بالإضافة إلى النوم.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...