Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Arbejdet blev finansieret af Canada Research Chair i Sleep Molecular Fysiologi. Forfatterne er taknemmelige for Chloé Provost og Caroline Bouchard for teknisk hjælp.

Alle metoder er godkendt af Comité d'éthique de l'expérimentation animale of the Recherche CIUSSS-NIM og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra Canadian Council on Animal Care. Se tabellen over materialer for reagenser, udstyr og materialer, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af kirurgi
<ol><li>Fremstilling af ECoG- og EMG-elektroder<ol>
<li>For hvert dyr skal du fremstille tre ECoG-elektroder: Ved hjælp af et loddejern skal der anbringes en lille dråbe blyfri lodde på skruehætten på en guldbeklædt skrue og lodde en guldtråd med en diameter på 4 mm og en guldtråd med en diameter på 4 mm (ikke-isoleret) på toppen af skruehætten ved hjælp af den blyfri lodde (Figur 1A). Forbered 2 elektroder med guldtråden lige op, og en med en 45 ° vinkel fra lodret.</li>
		<li>For hvert dyr skal du forberede to EMG-elektroder: Skær en 0,2 mm diameter guldtråd til en længde på 1,5 cm og en anden til 2 cm. Kurve begge ledninger for disse til at omfavne kurven af kraniet op til nakkemusklerne, holde en lige ende, der vil blive loddet til stikket (Figur 1B).</li>
		<li>For hvert dyr skal du forberede et stik: Brug et 6-kanals stik (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalstifter), og tilsæt blyfri lodde til 5 af de 6 metalstifter (udelade en mellemstift; Figur 1C). Dæk toppen af stikket med tape for at undgå kuld eller vandinfiltration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af AAV'er og sprøjtepumpe<ol>
<li>Forbered testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) og/eller kontrol AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) ved at fortynde bestanden AAV mix (es) (her, AAV'er i en opløsning af fosfat-bufferet saltvand indeholdende nonionisk overfladeaktivt middel [0,001%]) med steril saltvand for at opnå den ønskede virale titer (generelt 1012-13 genomkopier [GC]/mL) og det krævede volumen for antallet af mus, der skal behandles. BEMÆRK: Et injiceret volumen på 1 μL pr. kortikalt område pr. mus kræver, at der forekom 2 μL.</li>
		<li>Fastgør en 10 μL sprøjte til en sprøjtepumpe og fyld den med destilleret vand.</li>
		<li>Fyld et PE50-rør med en længde på ca. 60 cm med destilleret vand med en 1 mL sprøjte og en 21 G nål. Det er vigtigt, at 21G-nålen og sprøjten er på plads efter påfyldning. Tilslut PE50-røret til sprøjtepumpen. Lad 21 G-kanylen/sprøjten stå i den ene ende af PE50-røret, og tilslut den anden ende til 10 μL-sprøjten.</li>
		<li>Når røret er fastgjort til 10 μL sprøjten, skal du fjerne nålen i den anden ende og skubbe stemplet på 10 μL sprøjten for at fylde hullet efterladt af nålen med vand. BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er nogen luftboble, og at røret er helt fyldt med vand.</li>
		<li>Installer en 28 G kanyle for enden af røret, hvor nålen blev fjernet. Skub vand ind i kanylen med 10 μL sprøjten for at fylde den helt. Fastgør kanylen tæt på den stereotaxiske arm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilberedning af dyr BEMÆRK: C57BL6/J han- og hunmus på ~12 uger er tidligere blevet tilpasset i mindst 2 uger til at huse i individuelle bure og til en 12-timers lys:12-timers mørk cyklus med ad libitum mad og vand og adgang til en træterning.<ol>
<li>Afveje musene forsigtigt og intraperitoneally en blanding af ketamin/xylazin (120/10 mg/kg) for anæstesi. Vent ca. 10 minutter på dybbedøvelse.</li>
		<li>Barber håret fra bagsiden af ørerne til forsiden af hovedet mellem øjnene ved hjælp af en hårtrimmer. BEMÆRK: Pas på ikke at skære whiskers (beskyt whiskers med en finger under barbering) som whisker trimning vil ændre sensoriske indgange og ECoG aktivitet35,36.</li>
		<li>Tilsæt en generøs dråbe oftalmisk salve på hvert øje for at forhindre dehydrering. Kontroller dybden af anæstesi regelmæssigt under proceduren ved at klemme en tå fra bagpoten. Giv musen 0,5-1,5% isoflurane for at sikre dyb anæstesi, hvis der opstår en tåklemrefleks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intracortical AAV injektion med en sprøjte pumpe
BEMÆRK: Udfør alle følgende trin med steriliserede instrumenter og i et rent miljø. Brug 70% ethanol til yderligere vask af steriliserede instrumenter og til vask af elektroder tilberedt i punkt 1.1 samt ankerskruer (ikke-gulddækkede skruer), før operationen påbegyndes.
<ol><li>Fastgør forsigtigt musens hoved på det stereotaxiske apparat med ørestænger. BEMÆRK: Sørg for, at hovedet ikke bevæger sig sideværts.</li>
	<li>Træk forsigtigt dyrets tunge ud af munden for at undgå kvælning, og fastgør musens næse med den stereotaxiske adapter. BEMÆRK: Overvåg vejrtrækningen ofte under proceduren.</li>
	<li>Steriliser det barberede område af hovedet med 70% ethanol og ved at holde huden med en ekstra fin Graefe pincet, skære huden fra bunden af ørerne til niveauet af øjnene med væv saks. Brug fire kirurgiske klemmer til at strække huden og eksponere kraniet (to på hver side af snittet; se figur 1D).</li>
	<li>Skrab kraniets overflade med en skarp saksespids: Undgå samtidig knogle suturer, fjern periosteum og opret overlappende striber i to eller flere retninger. Fjern knoglefragmenterne, og tør kraniet med 70% ethanol. BEMÆRK: Ridserne og striberne vil hjælpe med at gøre optagelsesmontagen mere robust ved at forbedre cementens tilslutning til kraniet (se nedenfor).</li>
	<li>Med kanylen fastgjort til den stereotaxiske arm, identificere placeringen af bregma (dvs. skæringspunktet mellem kraniet koronar og sagittal suturer; Figur 1D) og lambda (dvs. skæringspunktet mellem kraniet sagittal sutur og en lige linje, der forbinder venstre og højre lambdoid sutur; Figur 1D), og bemærk de stereotaxiske koordinater for hver. Hvis forskellen mellem z-koordinaterne (lodret akse) for bregma og lambda er større end 0,3 mm, justeres næsens højde ved hjælp af den stereotaxiske adapter, indtil z-positionen for bregma og lambda er justeret.</li>
	<li>Marker kanylens position på kraniet med en pen ved disse koordinater (motorisk cortex): 1,5 mm lateral ret til midterlinje og 1,5 mm forreste til bregma. Gennembor forsigtigt kraniet på kanylens position med en 0,7 mm borebit i en retning vinkelret på kraniets overflade (justeret med den lodrette akse). Vask det gennemborede kranium med en steril bomuldsspids imprægneret med en 10% providone-jodopløsning.</li>
	<li>Kanylen fyldes med en 1 μL luftboble ved at trække 10 μL sprøjtestemplet tilbage med 1 μL. Indlæs testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) eller styringen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) i kanylen, der tidligere var fyldt med luftboblen: Bland AAV'en ved langsomt at pipette op og ned 1,7 μL på en steril petriskål og aspirat 1,5 μL af opløsningen i kanylen ved langsomt at trække i stemplet på 10 μL sprøjten. Marker luftboblens position på PE50-røret, så injektionen kan spores.</li>
	<li>Juster kanylen med hullet på kraniet for den lodrette position af kanylen for at nå den øverste kant af kraniet (dvs. kraniets overflade). Fra kraniets overflade sænkes langsomt kanylen med 1,5 mm (for at nå 1,5 mm under kraniets overflade og lag V af den motoriske cortex). BEMÆRK: Pas meget på ikke at sænke kanylen for meget for at undgå unødvendig læsion af hjernevævet.</li>
	<li>Start sprøjtepumpen for at injicere 1 μL AAV i løbet af 40 minutter (hastighed: 0,025 μL/min for at minimere vævsskader). Hold styr på injektionen på PE50-røret med luftboblens bevægelse, og foretag justeringer, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Når injektionen er afsluttet, skal du lade kanylen være på plads i 5 minutter for at sikre tilstrækkelig diffusion og undgå tilbageløb. Løft derefter langsomt og forsigtigt den stereotaxiske arm for at fjerne kanylen fra cortex.</li>
</ol>3. ECoG/EMG elektrodeimplantation
<ol><li>Brug lige Kelly pincet, langsomt skrue en ECoG elektrode (med lige guld-wire) i den lodrette akse (samme vinkel, at hullet blev gennemboret) i hullet, hvor AAV blev injiceret. Lad mindst 2,5 mm af skruen ud af kraniet for at minimere skader på dura og hjernebark (dvs. for en omtrentlig dybde på 1,1 mm fra kraniets overflade; Figur 1D).</li>
	<li>Marker placeringen af den bageste ECoG elektrode og referenceelektroden på kraniet med en pen ved disse koordinater: bageste elektrode (visuel cortex) 1,5 mm lateral ret til midterlinje og 1,5 mm forreste til lambda, referenceelektrode (somatosensorisk cortex) 2,6 mm lateral ret til midterlinje og 0,7 mm posterior til bregma. Marker også placeringen af tre vedligeholdelsesskruer (der fungerer som ankre mellem kraniet og tandcementen for at størkne hovedmontage) på venstre halvkugle uden specifikke koordinater, men så fjernt som muligt fra hinanden og fra ECoG-elektroderne.</li>
	<li>Gennembor forsigtigt kraniet på den markerede position af de andre elektroder og ankerskruer med 0,7 mm boret. Pierce i en retning vinkelret på kraniets overflade for hver skrue (dvs. lodret akse til den bageste elektrode, men med en vinkel fra den lodrette akse til andre steder). Vask det gennemborede kranium med en 10% providone-jodopløsning, og bloker hullerne med små, rullede stykker delikate opgaveviskere, før du installerer skruerne for at forhindre blødning og forurening.</li>
	<li>Brug den lige Kelly pincet, skrue vedligeholdelse skruer i venstre halvkugle og derefter skrue de sidste to elektroder i højre halvkugle. Sørg for at skrue med samme vinkel, som hullerne blev gennemboret, og at efterlade mindst 2,5 mm af hver skrue ud af kraniet (Figur 1D). BEMÆRK: For at maksimere soliditeten af den endelige montage og kvaliteten af de elektrofysiologiske signaler skal du passe på ikke at røre ved nogen skrue, når du installerer den næste.</li>
	<li>Placer et par små dråber dental cement i midten af ringen-lignende rum inde i skruerne. Den buede ende af en EMG-elektrode (fremstillet ved trin 1.1.2) indsættes ca. 1-2 mm i nakkemusklerne ved at holde den buede ekstremitet ved hjælp af Dumont #5 pincet og løfte huden over musklerne med ekstra fine Graefe-pincet. Placer derefter elektrodens buede side og albue i tandcementen; gentages for den anden EMG-elektrode. BEMÆRK: Den lige ende af den længere EMG-elektrode skal være justeret med den forreste ECoG-elektrode og den kortere EMG-elektrode med den bageste ECoG-elektrode. Sørg for, at de to EMG-elektroder ikke rører hinanden eller nogen af skruerne.</li>
	<li>Dæk musenes øjne, og påfør lys i 3-5 minutter for at hjælpe med cementstørkning. Når EMG-elektroderne holder fast, skal du dække bunden af ECoG-elektroderne og bunden af ankerskruerne med dentalcement for at danne en kroneformet kontur. Dæk musenes øjne, og påfør lys i 3-5 minutter for at hjælpe med cementstørkning. BEMÆRK: Påfør ikke cement på ECoG- og EMG-elektrode ekstremiteterne (guldtråd, der vil blive loddet på stikket) eller på huden.</li>
	<li>Fyld midten af montagen med tidligere blandet akrylcement. Under cement størkning, fjerne de fire kirurgiske klemmer holde huden (og vask disse straks med sarte opgave vinduesviskere). BEMÆRK: Påfør ikke cement på ECoG- og EMG-elektrode ekstremiteterne (guldtråd, der vil blive loddet på stikket) eller på huden.</li>
	<li>Sutur huden på bagsiden og forsiden af montagen, så kraniet ikke er udsat (men undgå at strække huden for meget) ved hjælp af en sutur nål (13 mm 3 /8 c) og syntetisk absorberelig monofilamenter.</li>
	<li>Hold stikket over montagen med buede pincet, og juster forsigtigt elektrodernes guldtråd med stikstifterne. Loddeelektrode ekstremiteter til stikstifter med loddejernet. BEMÆRK: Fortsæt hurtigt for at undgå overophedning og beskadigelse af det kortikale væv. Sørg for, at hver elektrode kommer godt i kontakt med den tilsvarende stikstift, og at elektroderne ikke er forbundet med hinanden.</li>
	<li>Fjern musen fra den stereotaxiske ramme. Dæk det tomme rum mellem stikket og hovedet med tidligere blandet akrylcement ved at dække alle forbindelser mellem elektroder og stikstifter. BEMÆRK: Undgå cementinfiltration inde i stikket ved at holde musen med stikket over hovedet (hovedet lige hælder ikke).</li>
	<li>Vej musen og læg den i et rent bur (helst udstyret med et ikke-masket låg) på en varmepude (individuelt hus for at undgå skader på hovedmontagen). Monitor dyret regelmæssigt, og administrere 0,1 mg/kg buprenorphin subkutanly ved opvågnen, og 12 timer senere, hvis dyret viser tegn på smerte (f.eks unormal kropsholdning, skelede øjne). BEMÆRK: Vægtforøgelsen i forhold til vægt før operationen bør ikke overstige 1,5 g.</li>
</ol>4. Optagelser
<ol><li>Husmus individuelt for at undgå skader på hovedmontagen som følge af gensidig pleje samt skade og sammenfiltring af optagekablerne. BEMÆRK: Til denne protokol blev mus anbragt med ad libitum adgang til mad, vand og en trækube, og daglig overvågning blev udført.</li>
	<li>Tilslut musene til optagelseskabler 2 uger efter operationen for tilpasning til kabler betingelser.</li>
	<li>Optag ECoG/EMG-signaler i 24 timer (eller længere/kortere afhængigt af forskningsspørgsmål). BEMÆRK: ECoG/EMG-signaloptagelse blev udført ved hjælp af et kabel, et drejestik (for at tillade rotation af kablet), en 36-kanals bærbar boks og en forstærker, der var tilsluttet en computer. Der udtages prøver af signaler ved 256 Hz (eller mere afhængigt af forskningsspørgsmål) og registreres med kommerciel software (se materialeoversigten). For at sikre tilstrækkeligt viralt udtryk skal forsøgene udføres mindst 3 uger efter AAV-injektionen som beskrevet tidligere29,37.</li>
	<li>Efter optagelse ofre musene ved livmoderhalskræft dislokation (eller andre metoder afhængigt af immunostaining protokollen), og høste hjernen til immunostaining.</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol beskriver en præcis og ligetil metode til at overvåge ECoG- og EMG-aktivitet under manipulation af molekylære mål ved hjælp af AAV'er. For at sikre en passende sammenligning mellem grupperne anbefales det på det kraftigste altid at planlægge kirurgiske procedurer (AAV-injektion og elektrodeimplantation) samme dag for forsøgs- og kontroldyr og at registrere deres elektrofysiologiske signaler samtidigt. For at opnå et lignende viralt udtryk mellem forsøgs- og kontroldyrene er det ønskeligt at injicere den samme virale titer. I det foreliggende tilfælde var den virale kontroltitre AAV blevet reduceret til halvdelen af testenS AAV for at sikre et lignende viralt udtryk. Forsøgsfolk bør være meget forsigtige med målinger af stereotaxiske koordinater for at sikre lav variation mellem dyr i hjernens område/ kortikale lagmålretning. Da injektionsdybden beregnes ud fra kraniets overflade, og kraniets tykkelse varierer efter alder og køn, bør kanylens placering altid kontrolleres ved hjælp af histologi efter protokollen eller immunohistochemisteri (f.eks. figur 2) for at sikre tilstrækkelig positionering/dybde af injektionen, og de stereotaxiske koordinater bør om nødvendigt justeres. I løbet af 40-minutters AAV-injektionen er det meget vigtigt at overvåge injektionshastigheden for hurtigt at opdage og rette potentielle problemer såsom pumpeblokering. Nogle eksperimentelle trin er også afgørende for at opnå optimale elektrofysiologiske signaler. For eksempel må du ikke overscrew under elektrodeimplantation; skruer skal stikke ud af kraniet med mindst 2,5 mm for at minimere skader på hjernebarken og dannelsen af et glial ar. Bagefter er det også uhyre vigtigt at i) undgå at påføre cement til elektrodernes ekstremiteter, ii) sikre en hurtig lodning af elektroderne til stikket, og iii) sørg for, at der ikke er nogen kontakt mellem elektroderne.
Den procedure, der præsenteres her for ECoG- og EMG-optagelse, er ekstremt veletableret, enkel og meget udbredt til at overvåge vågenhed og søvn hos mus2,11,13,34. Kontinuerlige ECoG- og EMG-optagelser kan udføres i flere på hinanden følgende dage (og endda uger) og generere et meget rigt datasæt, der kan bruges til at udføre flere analyselinjer, der omfatter variabler relateret til vågenhed og søvnmængde og arkitektur2,11,12 (f.eks. tid brugt i forskellige tilstande pr. lys og mørke perioder, antal episoder i hver stat, 24-timers fordeling af søvn), vågenhed og søvnspektralindhold34,41 (f.eks. effekt i forskellige frekvensbånd [svarendetil figur 3 ], skalafri aktivitet) og karakteristika for individuelle bølger42,43,44 (f.eks. langsom bølge amplitude og hældning). Når det anvendes i kombination med AAV-medierede molekylære manipulationer, er en yderligere fordel at undgå potentiel udviklingskompensation, der kan forekomme hos transgene dyr. Med øvelse kan hele proceduren, herunder 40-minutters AAV-injektionen, udføres på ca. 90 minutter. Dødeligheden bør være (meget) lav, da operationen er minimalt invasiv.
Samtidig brug af ECoG/ EMG-optagelse og målrettet manipulation med AAV tilbyder en række andre fordele og applikationer. For eksempel er præcisionen af stereotaxisk målretning, når den udføres tilstrækkeligt, meget høj og replikerbar og er nyttig til at bestemme den specifikke rolle, som en given hjerneregion (og / eller en celletype eller et molekylært element i regionen) spiller i reguleringen af søvn eller andre fysiologiske processer. Flere forskellige kortikale områder kan således let målrettes ved hjælp af tilpasninger af den nuværende protokol. Desuden kan målmanipulationer ved hjælp af AAV'er rettes mod et kortikalt/subkortikalt område, der er forskelligt fra ECoG-registreringsstederne. I sådanne tilfælde kan burrhullet til AAV-injektion dækkes af en lille glasovertræksdækning, der er fastgjort ved hjælp af dentalcement (eller knoglevoks). For øget specificitet indeholder AAV-konstruktionen ofte en promotor, der tillader målrettet infektion af en præcis celletype14. En CamKIIα promotor blev brugt i denne protokol til specifikt at målrette excitatoriske pyramideceller14,29,45af den motoriske cortex. Denne strategi har gjort det muligt at inaktivere cofilin (ved hjælp af cofilinS3D)32,33 i excitatoriske neuroner af den motoriske cortex og observation af statsspecifikke ændringer i ECoG-aktivitet ( Figur3). For at vurdere infektions-/transduktionseffektiviteten kunne fremtidige protokolbrugere kombinere den præsenterede AAV-ECoG-protokol med en co-farvning ved immunfluorescens og bruge billeder med høj forstørrelse til at beregne antallet af celler, der viser dobbeltmærkning ud af det samlede antal celler, der viser enkeltmærkning af målet (her CaMKIIα-udtrykkende neuroner). I en nylig undersøgelse blev en AAV-ECoG-metode svarende til den, der er beskrevet her, brugt til at overekspressere skrøbelig X mental retardering syndrom-relateret protein 1 (FXR1) i alle neuroner af den motoriske cortex ved hjælp af en AAV, der indeholder en synapsinpromotor og afslørede en effekt af denne manipulation på årvågenhedstilstandsfordeling og spektralindhold28. Disse fund illustrerer, hvordan manipulering af et givet molekyle i en målhjerneregion ved hjælp af AAV'er kan afsløre roller i reguleringen af specifikke vågenheds- / søvnparametre.
En begrænsning af den beskrevne protokol er den lille læsion af hjernevæv, der forekommer med kanyleplacering, før AAV-injektionen udføres, hvilket også kan ledsages af en inflammatorisk reaktion. Dette kan give anledning til særlig bekymring, når der foretages AAV-injektion i subkortikale områder, og bør altid tackles ved hjælp af passende kontroller. Alternativt kan den nuværende protokol efterfølges af kvantificering af reaktiv gliose og/eller mikroglial aktivering (f.eks. ved hjælp af immunfluorescens) for at sikre lignende niveauer i kontrol- og testgrupper og dermed på ECoG-udlæsningen. En anden begrænsning vedrører risikoen for dårlig forbindelse mellem en elektrode og stikket, hvilket kan resultere i et kontinuerligt eller lejlighedsvis dårligt elektrofysiologisk signal. Solidt skruet, loddet og cementeret elektroder vil minimere forekomsten af dette problem. En tredje begrænsning er relateret til dyr, der bindes via hovedmontage under optagelsen, hvilket kan begrænse bevægelse og anden adfærd, i det mindste til en vis grad, og lejlighedsvis resultere i kablerskader og signaltab. Endelig er den præsenterede protokol mere egnet til voksne mus, da kraniestørrelsen af yngre dyr kan forårsage vanskeligheder med at installere den afbildede hovedmontage, som beskrevet tidligere2.
Kombineret ECoG/ EMG-optagelse og AAV-medieret manipulation af et præcist mål gælder også for andre forskningsområder end neurovidenskab af søvn. Blandt andet kan det bruges til at studere og manipulere epileptiske begivenheder i dyremodeller af beslaglæggelse og er et kraftfuldt værktøj til at modulere hjernesvingninger, der er involveret i hukommelseskodning og konsolidering46,47. Derfor omfatter potentielle anvendelser helt sikkert områderne grundforskning inden for psykiatri og neurologi, herunder neurodegenerative sygdomme. Ud over evnen til at udtrykke en inaktiv form af et molekyle kan og er AAV'er blevet brugt til at overekspressere eller nedregulere (f.eks. små forstyrrende RNA, CRISPR/Cas9) eller til at redde ekspressionen af et molekyle i en helkrops KO. Det er vigtigt, at den dobbelte metode i den nuværende protokol også gælder for andre pattedyrarter som rotter og døgn gnavere, der repræsenterer interessante modeller til at forstå både søvn og neurodegeneration48,49.

Elektroencefalografiske (eller generelt elektrokortografiske [ECoG] i gnavere) og elektromyografiske (EMG) optagelser anvendes i vid udstrækning i søvnforskning såvel som mere bredt inden for neurovidenskab, neurologi og psykiatri. Tilsammen giver disse elektrofysiologiske signaler mulighed for identifikation af årvågenhedstilstande og den efterfølgende kvantificering af statens varighed og spektralsammensætning, både hos mennesker og gnavere1,2,3,4. En sådan kvantificering har været nyttig til at forstå, hvordan søvn ændres under patologiske tilstande som neurodegenerative sygdomme og model5,6,7 eller ved genetisk modifikation8,9. For eksempel blev knockout (KO) af forskellige gener forbundet med neuronal kommunikation vist sig at ændre varigheden af vågenhed og søvn i både musen og frugt flyve10,11,12,13. For at tackle den potentielle udviklingskompensation, der følger af undersøgelsen af fuldkrops-KO hos gnavere, og for at muliggøre en finere kontrol med genmanipulation er en effektiv måde at manipulere genekspression på at anvende adeno-associerede vira (AAV'er). En AAV-medieret genmanipulation kan bruges til at nedregulere et givet molekylært mål og til at begrænse manipulationen til en bestemt cellepopulation ved hjælp af forskellige typer initiativtagere14. AAV'er anvendes også i vid udstrækning som leveringsmetode i de grupperede, der regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-teknologi15,16. Disse metoder giver mulighed for bedre tidsmæssig og rumlig kontrol af genmanipulation, som generelt er forbundet med udtrykket af en reporter, der tillader kvantificering af det inficerede område ved hjælp af immunfluorescens.
AAV'er repræsenterer også hovedvektoren for celletypespecifikke manipulationer af neuronal aktivitet via optogenetics og kemogetik17,18,19, som er blevet udbredt i nyere forskning i neurodegenerative sygdomme, adfærd, kognition og søvn20,21,22. I søvnforskning har anvendelsen af optogenetics til aktivering eller hæmning af visse hjerneregioner, såsom basal forhjernen, hypothalamus og sublaterodorsal tegmentum, været nyttig til at bestemme deres roller i kontrollen af ophidselse, langsom bølge søvn (også kendt som ikke-hurtig øjenbevægelsessøvn), paradoksal søvn (eller hurtig øjenbevægelsessøvn) og katapleksi23, 24,25. Desuden har AAV-medierede manipulationer hjulpet med at belyse vigtige søvnregulerende kredsløb og molekyler , der bidrager til de negative virkninger af søvntab26,27,28. For eksempel, et protein vist sig at være impliceret i søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse er cofilin29,30. Dette protein er et filamentøst actin-severing protein, der deltager i reorganiseringen af actin filamenter ved fysisk bindende for actin og fremme demontering af filamenter på en dynamisk måde31. Hæmmende cofilinaktivitet ved hjælp af en AAV-medieret tilgang viste sig at forhindre tab af rygsøjlen samt synaptisk plasticitet og hukommelsesunderskud forårsaget af søvnmangel hos mus29. Samlet understreger disse undersøgelser nytten og relevansen af AAV-medierede manipulationer for at forstå søvnregulering og konsekvenserne af søvnmangel hos gnavere.
Her beskrives en protokol, der kombinerer ECoG og EMG elektrodeimplantation og optagelse med manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde af vilde mus (WT) ved hjælp af en AAV. Mere præcist injiceres en AAV (serotype 9), der udtrykker kodningssekvensen af en fosformisk form af musens cofilin (cofilinS3D), hvilket gør den inaktiv32,33, injiceret i den motoriske cortex (M1 og M2). En ECoG-elektrode implanteres direkte på injektionsstedet for at sikre registrering af de inficerede cellers synkroniserede kortikale aktivitet. ECoG/EMG-optagelsen udføres i 24 timer under uforstyrrede forhold tre uger efter operationen for at give mulighed for genopretning, tilpasning og høj cofilinS3D-udtryk. Optagelsen bruges derefter til identifikation af årvågenhedstilstande og ECoG-spektralanalyse som beskrevet i tidligere undersøgelser11,34. Denne metode kan specifikt afsløre, hvordan kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG signaler i mus. Denne kombination af elektrofysiologiske optagelser og AAV-medieret genmanipulation er særlig relevant for at undersøge forskellige molekylære elementers roller i specifikke hjernefunktioner og kan anvendes på kortikale (og subkortikale) hjerneområder af interesse for WT og genetisk modificerede mus af begge køn og endda andre arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Brugen af elektrokortografiske (ECoG) optagelser i gnavere er relevant for søvnforskning og for studiet af en lang række neurologiske tilstande. Adeno-associerede vira (AAV'er) bruges i stigende grad til at forbedre forståelsen af hjernekredsløb og deres funktioner. Den AAV-medierede manipulation af specifikke cellepopulationer og/eller af præcise molekylære komponenter har været uhyre nyttig til at identificere nye søvnregulerende kredsløb/molekyler og nøgleproteiner, der bidrager til de negative virkninger af søvntab. For eksempel forhindrer hæmmende aktivitet af den filamentøse actin-afskærende protein cofilin ved hjælp af AAV søvnmangel-induceret hukommelsesnedsættelse. Her beskrives en protokol, der kombinerer manipulation af cofilin-funktion i et hjernebarkområde med registrering af ECoG-aktivitet for at undersøge, om kortikal cofilin modulerer vågenhed og søvn ECoG-signaler. AAV-injektion udføres under samme kirurgiske procedure som implantationen af ECoG og elektromyografiske (EMG) elektroder hos voksne han- og hunmus. Mus bedøves, og deres hoveder barberes. Efter hudrensning og indsnit bestemmes stereotaxiske koordinater for den motoriske cortex, og kraniet gennembores på dette sted. En kanyle fyldt med en AAV, der udtrykker cofilinS3D, en inaktiv form for cofilin, er langsomt placeret i det kortikale væv. Efter AAV-infusion skrues gulddækkede skruer (ECoG-elektroder) gennem kraniet og cementeres til kraniet med guldtråde indsat i nakkemusklerne (EMG-elektroder). Dyrene får tre uger til at komme sig og sikre tilstrækkeligt udtryk for cofilinS3D. Det inficerede område og celletype verificeres ved hjælp af immunhistokemi, og ECoG analyseres ved hjælp af visuel identifikation af årvågenhedstilstande og spektralanalyse. Sammenfattende gør denne kombinerede metodologiske tilgang det muligt at undersøge det præcise bidrag fra molekylære komponenter, der regulerer neuronal morfologi og forbindelse til reguleringen af synkroniseret hjernebarkaktivitet under vågenhed og søvn.

Efter elektrofysiologiske optagelser anvendes immunfluorescens til at definere det område, der er inficeret med AAV-injektionen, og til at validere udtrykket af cofilinS3D (figur 2). Immunostaining kan udføres ved hjælp af en metode svarende til det , der tidligere er beskrevet29,37,38,39. AAV udtrykker en inaktiv form for cofilin smeltet sammen med en hemagglutinin (HA)-Tag (cofilinS3D-HA),som påvises ved immunfluorescens ved hjælp af et anti-HA antistof og et sekundært antistof (Alexa Fluor 488). De inficerede excitatoriske neuroner (her, målrettet med en calcium/calmodulin-afhængig protein kinase II alpha [CamKIIα] promotor, der styrer ekspressionen af transgenet indeholdt i AAV) er plettet med anti-HA antistof. En vellykket infektion er indikeret ved farvning af neuronerne i den motoriske cortex omkring injektionsstedet(Figur 2A,B). I dette repræsentative eksempel viste hjernebarken på den anden halvkugle ikke nogen mærkbar farvning. Ikke desto mindre, da excitatoriske neuroner kan projicere til fjerne hjerneområder, er farvning i den kontralaterale halvkugle ikke nødvendigvis en indikation af mislykket injektion. Højere forstørrelse af det inficerede område viste farvning af cellelegemer og fremskrivninger, hvilket bekræftede, at kun specifikke celler i det målrettede kortikale område var inficeret (Figur 2C).
Co-farvning med markører af excitatoriske neuroner (f.eks vesikulær glutamat transportør 1, CaMKIIα) kan også udføres for at validere celle type-specificitet. Alternativt kan co-farvning med markører af hæmmende neuroner eller astrocytter udføres, hvis disse celler er målrettet ved hjælp af forskellige initiativtagere. Co-farvning af cofilinS3D-HAog CaMKIIα blev også udført i samme dyr for et område mere bageste til injektionsstedet, der stadig viste anti-HA farvning i den motoriske cortex (Figur 2D). Det højere forstørrelsesbillede af området viser celler, der tydeligt udtrykker cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figur 2E) og CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figur 2F). Sammenstillingen af cofilinS3D-HAog CaMKIIα farvning afslører, at de fleste (hvis ikke alle) celler farves til cofilinS3D-HAer også positive for CaMKIIα (Figur 2G). Denne observation understøtter infektionens specificitet for excitatoriske neuroner.
For at vurdere cofilinmanipulationens indvirkning på ECoG-aktiviteten bruges ECoG- og EMG-signaler til at udføre en visuel identifikation af årvågenhedstilstande (vågenhed, langsom bølgesøvn, paradoksal søvn). Dette gøres på 4-s epoker på grund af den hurtige ændring i årvågenhed tilstand i musen2, og her, for en fuld 24-timers optagelse. Standardanalyser omfatter beregning af søvnarkitektur og spektralanalysevariabler , som tidligere udført for forskellige datasæt11,12,13,28,34. Navnlig vil spektralanalysen af ECoG-signalet fra de forskellige stater indeksere statens sammensætning og kvalitet. For at fjerne forskelle, der kan opstå, f.eks. fra forskellige dybder af elektroderne, kan spektralanalysedata udtrykkes i forhold til den samlede effekt af alle tilstande af et givet dyr (Figur 3A). I betragtning af den meget lave relative amplitude af ECoG aktivitet i højere frekvenser, relative effektspektre for vågenhed, langsom bølge søvn, og paradoksal søvn er blevet log-forvandlet til mere passende visualisere og samtidig sammenligne aktiviteten i lave og høje frekvenser. Denne analyse viser de statsspecifikke forskelle i spektralaktiviteten under betingelser for cofilinininaktivering (figur 3B). Mere præcist påpeger disse foreløbige fund, der kombinerer mandlige og kvindelige mus, at cofilinininaktivering øger spektraleffekten betydeligt i hurtige frekvenser (14-30 Hz) under vågenhed og i langsomme frekvenser (1-4 Hz) under paradoksal søvn, mens ECoG-aktiviteten under langsom bølgesøvn hovedsageligt er upåvirket. Desuden synes cofilinininaktivering at øge variabiliteten mellem musene i ECoG-aktiviteten (især mærkbar fra fejllinjer for vågenhed i figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Figur 1: Forberedelse af ECoG/EMG montagekomponenter og repræsentativt eksempel på ECoG elektrodeplacering. (A) En ECoG-elektrode: En guldtråd med en diameter på 4 mm og en guldtråd med en diameter på 4 mm (ikke-isoleret) smeltes på hovedet af en guldbeklædt skrue (1,9 mm hoveddiameter, 1,14 mm gevindmajometer, 3,6 mm totallængde) ved hjælp af blyfri lodde. (B) EMG-elektroder: To guldtråde (1,5 og 2 cm) er buede til at omfavne kraniets kurve op til nakkemusklen, og den anden ende holdes lige til loddet til stikket. (C) Et 6-kanals stik: Blyfri lodde tilsættes til 5 af de 6 metalstifter (uden en i midten) på stikket (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalstifter). Toppen af stikket er dækket af tape for at undgå kuld / vand infiltration. (D) Eksempel på placeringen af de tre vedligeholdelsesskruer på kraniet på venstre halvkugle og af de tre ECoG-elektroder (herunder en referenceelektrode) på højre halvkugle. De nøjagtige stereotaxiske koordinater for ECoG-elektroderne er angivet i trin 2.6 og 3.2 og er beregnet i henhold til bregma- og lambdaens placering (som er angivet med de gule prikker). Forkortelser: ECoG = elektrokortografisk; EMG = elektromyografisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Figur 2: Repræsentativ immunosang til definition af AAV-inficeret område og celletype. (A) Skematisk gengivelse, der viser injektionsstedet for koronaskiven, der præsenteres i panel B. Positionen er 1,1 mm foran bregmaen, og kanylen (vist med rødt) var målrettet mod lag V af den rigtige primære motoriske cortex (M1). Repræsentation ændret fra Franklin og Paxinos40. (B) Immunostaining af HA til påvisning af cofilin S3D-HA-ekspression i neuroner vist for en koronar skive af den fulde hjerne placeret ca. 1,1 mm forreste til bregma. Det inficerede område lokaliserer hovedsageligt til lag V og VI (infragranular lag) af højre primære og sekundære motor cortices (M1 og M2). Skalastang = 500 μm. Pladsen repræsenterer det område, der er vist i C. (C) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af inficerede celler og bekræfter udtryk for cofilinS3D-HA i dybere lag af den motoriske cortex. Skalastang = 100 μm. (D) Co-immunostaining af HA og CaMKIIα for at vurdere celletypespecifikitet vist for en koronarskive på højre halvkugle placeret ca. 0,5 mm forreste til bregma og derfor bagest til injektionsstedet (samme mus som i panelerne B og C). Det inficerede område lokaliseres til motor cortices (M1 og hovedsagelig M2). Skalastang = 500 μm. Kvadratet repræsenterer det område, der er vist i E, F og G. (E) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af inficerede celler og bekræfter udtryk for cofilinS3D-HA. Skalastang = 100 μm. (F) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser farvning af CaMKIIα-positive celler. Skalastang = 100 μm. (G) Højere forstørrelse af det inficerede område, der viser cofilincofilin S3D-HA og CaMKIIα, hvilket bekræfter, at inficerede celler er CaMKIIα-positive. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; M1 = primær motorisk cortex; M2 = sekundær motorisk cortex; CPu = caudate putamen (striatum); LV = lateral ventrikel; HA= hemagglutinin; CamKIIα = calcium/calmodulinafhængig protein kinase II alpha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative effektspektre for vågenhed, langsom bølgesøvn og paradoksal søvn opnået efter viral manipulation af cofilin-funktionen. Hanmus (n = 5 pr. gruppe) og hunmus (n = 2 pr. gruppe) injiceret med AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA(viral titer 2,58 × 1013 GC/mL) eller med kontrol AAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1,25 ×10 13 GC/mL; halvdelen af testtitlen til kontrol for det forstærkede signal fra denne kontrol AAV) i lag V af den motoriske cortex blev registreret i 24 timer, og det elektrokortografiske signal blev underkastet spektralanalyse (hurtig Fourier Transform til beregning af spektraleffekt mellem 0,5 og 30 Hz med en opløsning på 0,25 Hz). (A)Effektspektre i de tre årvågenhedstilstande udtrykt i forhold til alle staters samlede magt. (B) Relativ effektspektrestamme, der omdannes til mere passende at repræsentere gruppeforskelle i højere frekvenser. Undertrykkelsen af cofilinaktiviteten i den motoriske cortex ved hjælp af AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HAøger elektrokorttisk aktivitet betydeligt i betaområdet (14-30 Hz) under vågenhed, og i deltaområdet (1-4 Hz) under paradoksal søvn i forhold til kontrolinjektioner (røde linjer over x akser indikerer Mann-Whitney U-test på frekvensbåndseffekt p < 0,05). Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus GC = genomkopier; HA= hemagglutinin; CamKIIα = calcium/calmodulinafhængig proteinkinase II alpha; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Denne artikel beskriver en protokol for manipulation af molekylære mål i hjernebarken ved hjælp af adeno-associerede vira og til overvågning af virkningerne af denne manipulation under vågenhed og søvn ved hjælp af elektrokorttiske optagelser.

Elektrokortografisk optagelse af cerebral cortex-områder manipuleret ved hjælp af en Adeno-associeret virus, der er målrettet cofilin hos mus

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Denne protokol kan bruges til at identificere specifikke individuelle molekylære måls rolle i reguleringen af elektrokortografisk aktivitet under forskellige Vigilin-tilstande. Blandt fordelene ved at bruge adeno-associeret virus er evnen til præcist at målrette en given hjerneregion og en bestemt celletype. Julien Dufort-Gervais, en forskningsmedarbejder fra mit team, demonstrerer protokollen.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids refleks i en bedøvet 12-ugers gammel mus, skal du bruge en hår trimmer til at barbere håret fra bagsiden af ørerne til forsiden af hovedet mellem øjnene. Tilsæt en generøs dråbe oftalmisk salve til hvert øje for at forhindre dehydrering og brug ørestængerne til omhyggeligt at fastgøre musens hoved på et stereotaxisk apparat. Træk forsigtigt tungen ud af munden for at undgå kvælning.Fastgør musens næse til apparatet og brug 70% ethanol til at sterilisere den udsatte hud på hovedet. Hold huden med ekstra fine Graefe pincet, bruge væv saks til at skære huden fra bunden af ørerne til niveauet af øjnene og placere to kirurgiske klemmer på hver side af snittet til at strække huden og til at udsætte kraniet. Undgå hjerne suturer, skal du bruge en saks spids til at ridse kraniet overfladen for at fjerne periosteum og til at skabe overlappende striber i to eller flere retninger.Brug 70% ethanol til at fjerne knoglefragmenterne og desinficere kraniet. Med en tidligere forberedt kanyle fastgjort til den stereotaxiske arm, identificere placeringen af bregma og lambda og bemærk stereotaxic koordinater af hver. Brug den stereotaxiske arm og en pen til at markere kanylens position på kraniet 1,5 millimeter sideværts lige til midterlinjen og 1,5 millimeter foran bregmaen.Ved hjælp af en 0,7 millimeter borebit, forsigtigt gennembore kraniet på den markerede position vinkelret på kraniets overflade og afstemt med den lodrette akse og vask kraniet med en steril bomuldsspids gennemblødt i en 10% betadine povidone jodopløsning, og træk derefter stemplet af en 10 mikroliter sprøjte af en mikroliter for at indlæse kanylen med en mikroliter luftboble. Bland derefter AAV-blandingen af interesse med langsom pipering og tilsæt 1,7 mikroliter af blandingen til en steril petriskål. Brug denne sprøjte til at indlæse 1,5 mikroliter af opløsningen i kanylen og markere luftboblens position på det tilsluttede PE50-rør.Lodret justere kanylen med hullet i kraniet, således at kanylen når den øverste kant af knoglen og markere Z-koordinaten af kraniets overflade. Sænk langsomt kanylen, indtil spidsen når 1,5 millimeter under kraniets overflade og lag fem af den motoriske cortex og start sprøjtepumpen med en 0,025 mikroliter pr. Minut flowhastighed for at levere en mikroliter AAV over 40 minutter. Brug luftboblen i røret til at spore injektionen, og foretag eventuelle justeringer efter behov.Når hele virusvolumen er blevet leveret, skal du lade kanylen være på plads i fem minutter for at sikre en tilstrækkelig diffusion og for at undgå tilbagestrømning, før du langsomt og forsigtigt løfter den stereotaxiske arm for at fjerne kanylen fra cortex. Til elektrodeimplantation skal du bruge lige Kelly-pincet til langsomt at skrue en elektrocorticografisk elektrode med en lige guldtråd ind i den lodrette akse i hullet, hvor AAV blev injiceret, hvilket efterlader mindst 2,5 millimeter skrue uden for kraniet for at minimere skaderne på duraen og hjernebarken. Brug en pen til at markere placeringen af referenceelektroden 2,6 millimeter sideværts til midterlinjen og 0,7 millimeter posterior til bregma og placeringen af den bageste elektrokardiografiske elektrode ved 1,5 millimeter sideværts lige til midterlinjen og 1,5 millimeter foran lambda og placeringen af tre vedligeholdelsesskruer på venstre halvkugle uden specifikke koordinater, men så fjernt som muligt fra hinanden og fra de elektrokortografiske elektroder.Brug boret til forsigtigt at gennembore kraniet vinkelret på kraniets overflade på de markerede positioner af de andre elektroder og skruer og vask det gennemborede kranium med en 10%povidone jodopløsning. Bloker hullerne med små rullede stykker delikat opgavetørring, før du installerer skruerne for at forhindre blødning og forurening, og brug lige Kelly-tang til at indsætte skruerne i borehullerne i samme vinkel, som hullerne blev gennemboret. Placer et par små dråber dental cement i midten af ringen-lignende rum inde i skruerne og bruge ekstra fine Graefe pincet til at løfte huden over nakkemusklerne.Brug Dumont nummer fem pincet, hold den buede ekstremitet af en elektromyografisk elektrode og indsætte det cirka en til to millimeter i musklerne. Placer elektrodens buede side og foldepunkt i tandcementen, og indsæt den anden elektromyografiske elektrode på samme måde. Efter at have dækket dyrets øjne, skal du anvende lys i tre til fem minutter for at størkne cementen og bruge yderligere dentalcement til at dække bunden af de elektrokortografiske elektroder og ankerskruerne til at danne en kroneformet kontur.Efter påføring af tre til fem minutters lys mere, fyld midten af montagen med akrylcement og fjern de kirurgiske klemmer. Brug en syntetisk absorberbar monofilamenter sutur til at lukke huden på forsiden og bagsiden af montagen, så kraniet ikke er udsat og bruge buede pincet til at holde stikket over montagen til omhyggeligt at tilpasse guldtråde af elektroderne med stikket stifter, derefter hurtigt lodde hver elektrode ekstremitet til en enkelt tilsvarende stik pin. Når du har fjernet musen fra rammen, skal du dække det tomme mellemrum mellem stikket og hovedet med akrylcementen.Og efter vejning skal du placere musen i et rent bur med et ikke-maskeret låg på en varmepude. To uger efter operationen skal musene forbindes til optagelseskabler, og mindst en uge senere registreres de elektrokortografiske og elektromyografiske signaler i 24 timer eller mere. En vellykket infektion bekræftes af HA farvning af neuronerne i den motoriske cortex omkring injektionsstedet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af cofilin S3D HA. Co-farvning med excitatoriske neuron markør CaMKII alpha angiver klar cofilin S3D HA og CaMKII alpha co-udtryk under høj forstørrelse.Log forvandlet relative magt spektre for vågenhed, langsom bølge søvn, og paradoksale søvn viser statsspecifikke forskelle i spektral aktivitet under cofilin inaktivering. Kombinationen af elektrokortografisk optagelse og AAV-medieret manipulation af præcise molekylære mål gælder også for flere hjerneregioner og for andre neurovidenskabsunderfelter såsom forskning i epilepsi eller hukommelse ud over søvn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionel Imaging af Auditory Cortex i voksne katte ved hjælp af High-felt fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og Tips til intravenøs indgift af Adeno-associeret Virus at rotter og evaluering af centralnervesystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live Imaging af primære hjernebarken celler ved hjælp af en 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associeret Virus-medieret transgen udtryk i genetisk definerede neuroner i rygmarven

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte Intratekal injektion af rekombinant Adeno-associeret virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...