Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Het werk werd gefinancierd door de Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. De auteurs zijn Chloé Provost en Caroline Bouchard dankbaar voor de technische hulp.

Alle methoden zijn goedgekeurd door het Comité d'éthique de l'expérimentation animale van de Recherche CIUSSS-NIM en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. Zie de tabel met materialen voor reagentia, apparatuur en materialen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van de operatie
<ol><li>Voorbereiding van ECoG- en EMG-elektroden<ol>
<li>Bereid voor elk dier drie ECoG-elektroden: plaats met behulp van een soldeerbout een kleine druppel loodvrij soldeer op de schroefdop van een met goud bedekte schroef en soldeer een 4 mm lange gouddraad met een diameter van 0,2 mm (niet-geïsoleerd) aan de bovenkant van de schroefdop met behulp van het loodvrije soldeer (afbeelding 1A). Bereid 2 elektroden voor met de gouddraad recht omhoog en één met een hoek van 45° vanaf de verticaal.</li>
		<li>Bereid voor elk dier twee EMG-elektroden voor: snijd een gouden draad met een diameter van 0,2 mm tot een lengte van 1,5 cm en een tweede tot 2 cm. Buig beide draden om de kromming van de schedel tot aan de nekspieren te omarmen, waarbij een recht uiteinde wordt behouden dat aan de connector wordt gesoldeerd (figuur 1B).</li>
		<li>Bereid voor elk dier één connector voor: gebruik een 6-kanaals connector (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalen pinnen) en voeg loodvrij soldeer toe aan 5 van de 6 metalen pinnen (waarbij één middelste pen wordt weggelaten; Figuur 1C). Bedek de bovenkant van de connector met tape om zwerfvuil of waterinfiltratie te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van AAV's en spuitpomp<ol>
<li>Bereid de test AAV (hier, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) en/of de controle-AAV (hier, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) door de AAV-mix(s) te verdunnen (hier, AAV's in een oplossing van fosfaatgebufferde zoutoplossing die niet-ionische oppervlakteactieve stof [0,001%]) bevat met steriele zoutoplossing om de gewenste virale titer te verkrijgen (over het algemeen10 12-13 genoomkopieën [GC]/ml) en het vereiste volume voor het te behandelen aantal muizen. OPMERKING: Een geïnjecteerd volume van 1 μL per corticale gebied per muis vereist de bereiding van 2 μL.</li>
		<li>Bevestig een spuit van 10 μL aan een spuitpomp en vul deze met gedestilleerd water.</li>
		<li>Vul een PE50-buis van ongeveer 60 cm lengte met gedestilleerd water met een spuit van 1 ml en een naald van 21 G. Belangrijk is dat u de 21G-naald en -spuit na het vullen op hun plaats laat. Sluit de PE50-buis aan op de spuitpomp; laat de 21 G naald/spuit op het ene uiteinde van de PE50-buis zitten en sluit het andere uiteinde aan op de spuit van 10 μL.</li>
		<li>Zodra de buis aan de spuit van 10 μL is bevestigd, verwijdert u de naald aan de andere kant en duwt u de zuiger van de 10 μL-spuit om de opening die de naald heeft achtergelaten met water te vullen. OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbel is en dat de buis volledig gevuld is met water.</li>
		<li>Installeer een canule van 28 G aan het einde van de buis waar de naald is verwijderd. Duw water in de canule met de spuit van 10 μL om deze volledig te vullen. Bevestig de canule stevig aan de stereotaxic arm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van dieren OPMERKING: C57BL6/J mannelijke en vrouwelijke muizen van ~ 12 weken oud werden eerder gedurende ten minste 2 weken aangepast aan huisvesting in individuele kooien en aan een donkere cyclus van 12 uur: 12 uur met ad libitum voedsel en water en toegang tot een houten kubus.<ol>
<li>Weeg de muizen zorgvuldig af en injecteer intraperitoneaal een mix van ketamine/xylazine (120/10 mg/kg) voor anesthesie. Wacht ongeveer 10 minuten op diepe anesthesie.</li>
		<li>Scheer het haar van de achterkant van de oren naar de voorkant van het hoofd tussen de ogen met behulp van een haartrimmer. OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om de snorharen niet te snijden (bescherm de snorharen met een vinger tijdens het scheren) omdat het trimmen van de snorharen de sensorische ingangen en ECoG-activiteit35,36zal wijzigen.</li>
		<li>Voeg een royale druppel oogzalf toe aan elk oog om uitdroging te voorkomen. Controleer regelmatig de diepte van de anesthesie tijdens de procedure door een teen van de achterpoot te knijpen. Voorzie de muis van 0,5-1,5% isofluraan om diepe anesthesie te garanderen als er een teenknijpreflex verschijnt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intracortical AAV injectie met een spuitpomp
OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit met gesteriliseerde instrumenten en in een schone omgeving. Gebruik 70% ethanol om gesteriliseerde instrumenten verder te wassen en om elektroden bereid in punt 1.1 te wassen, evenals ankerschroeven (niet met goud bedekte schroeven) voordat u met de operatie begint.
<ol><li>Bevestig de kop van de muis voorzichtig op het stereotaxic-apparaat met oorstangen. OPMERKING: Zorg ervoor dat het hoofd niet zijdelings beweegt.</li>
	<li>Trek voorzichtig de tong van het dier uit de mond om verstikking te voorkomen en bevestig de neus van de muis met de stereotaxic-adapter. OPMERKING: Controleer de ademhaling regelmatig tijdens de procedure.</li>
	<li>Steriliseer het geschoren deel van het hoofd met 70% ethanol en door de huid vast te houden met een extra fijne Graefe-tang, snijdt u de huid van de basis van de oren tot het niveau van de ogen met een tissueschaar. Gebruik vier chirurgische klemmen om de huid te strekken en de schedel bloot te leggen (twee aan elke kant van de incisie; zie figuur 1D).</li>
	<li>Krab het schedeloppervlak met een scherpe schaarpunt: verwijder het periosteum terwijl u bot hechtingen en creëer overlappende strepen in twee of meer richtingen. Verwijder de botfragmenten en droog de schedel met 70% ethanol. OPMERKING: Het krabben en strepen helpen de opnamemontage robuuster te maken door de hechting van het cement aan de schedel te verbeteren (zie hieronder).</li>
	<li>Identificeer met de canule bevestigd aan de stereotaxic arm de locatie van de bregma (d.w.z. het snijpunt tussen de schedel coronale en sagittale hechtingen; Figuur 1D) en lambda (d.w.z. het snijpunt tussen de schedelsagittale hechting en een rechte lijn die de linker- en rechterlamdoïde hechtdraad verbindt; Figuur 1D), en noteer de stereotaxic coördinaten van elk. Als het verschil tussen z-coördinaten (verticale as) van de bregma en lambda groter is dan 0,3 mm, moet u de hoogte van de neus aanpassen met behulp van de stereotaxic-adapter totdat de z-positie van bregma en lambda is uitgelijnd.</li>
	<li>Markeer de positie van de canule op de schedel met een pen op deze coördinaten (motorische cortex): 1,5 mm laterale rechts naar middellijn en 1,5 mm voor bregma. Doorboor de schedel voorzichtig op de positie van de canule met een boor van 0,7 mm in een richting loodrecht op het schedeloppervlak (uitgelijnd met de verticale as). Was de doorboorde schedel met een steriele katoenen punt geïmpregneerd met een providone-jodiumoplossing van 10%.</li>
	<li>Laad de canule met een luchtbel van 1 μL door de zuiger van de 10 μL spuit met 1 μL terug te trekken. Laad de test AAV (hier AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) of de besturing AAV (hier AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) in de canule die eerder met de luchtbel was geladen: meng de AAV door langzaam op en neer te pipetten, pipet 1,7 μL op een steriele Petrischaal en aspireer 1,5 μL. Markeer de positie van de luchtbel op de PE50-buis om de injectie te kunnen volgen.</li>
	<li>Lijn de canule uit met het gat op de schedel voor de verticale positie van de canule om de bovenrand van de schedel (d.w.z. schedeloppervlak) te bereiken. Laat vanaf het schedeloppervlak de canule langzaam 1,5 mm zakken (om 1,5 mm onder het schedeloppervlak en laag V van de motorische cortex te bereiken). OPMERKING: Zorg ervoor dat u de canule niet te veel laat zakken om onnodige laesie van het hersenweefsel te voorkomen.</li>
	<li>Start de spuitpomp om 1 μL AAV te injecteren in de loop van 40 minuten (snelheid: 0,025 μL/min om weefselschade te minimaliseren). Houd de injectie op de PE50-buis bij met de beweging van de luchtbel en breng indien nodig aanpassingen aan.</li>
	<li>Nadat de injectie is voltooid, laat u de canule 5 minuten op zijn plaats om voldoende diffusie te garanderen en terugstroming te voorkomen. Til vervolgens langzaam en voorzichtig de stereotaxic arm op om de canule uit de cortex te verwijderen.</li>
</ol>3. ECoG/EMG elektrode implantatie
<ol><li>Schroef met behulp van een rechte Kelly-tang langzaam één ECoG-elektrode (met rechte gouddraad) in de verticale as (dezelfde hoek waarin het gat is doorboord) in het gat waar de AAV is geïnjecteerd. Laat ten minste 2,5 mm van de schroef uit de schedel om schade aan de dura en hersenschors te minimaliseren (d.w.z. voor een geschatte diepte van 1,1 mm van het schedeloppervlak; Figuur 1D).</li>
	<li>Markeer de positie van de posterieure ECoG-elektrode en de referentie-elektrode op de schedel met een pen op deze coördinaten: posterieure elektrode (visuele cortex) 1,5 mm laterale rechts naar middellijn en 1,5 mm anterieure naar lambda, referentie-elektrode (somatosensorische cortex) 2,6 mm laterale rechts naar middellijn en 0,7 mm posterieur naar bregma. Markeer ook de positie van drie onderhoudsschroeven (die fungeren als ankers tussen de schedel en tandcement om hoofdmontage te stollen) op de linkerhersenhelft zonder specifieke coördinaten, maar zo ver mogelijk van elkaar en van de ECoG-elektroden.</li>
	<li>Doorboor de schedel voorzichtig op de gemarkeerde positie van de andere elektroden en ankerschroeven met de boor van 0,7 mm. Prik in een richting loodrecht op het schedeloppervlak voor elke schroef (d.w.z. verticale as voor de achterste elektrode, maar met een hoek van de verticale as voor andere locaties). Was de doorboorde schedel met een providone-jodiumoplossing van 10% en blokkeer de gaten met kleine, gerolde stukken delicate taakwissers voordat u de schroeven installeert om bloedingen en verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Schroef met behulp van de rechte Kelly-tang de onderhoudsschroeven in de linkerhersenhelft en schroef vervolgens de laatste twee elektroden in de rechterhersenhelft. Zorg ervoor dat u met dezelfde hoek schroeft dat de gaten zijn doorboord en laat ten minste 2,5 mm van elke schroef uit de schedel (afbeelding 1D). OPMERKING: Om de stevigheid van de uiteindelijke montage en de kwaliteit van de elektrofysiologische signalen te maximaliseren, moet u ervoor letten dat u geen schroef aanraakt bij het installeren van de volgende.</li>
	<li>Plaats een paar kleine druppels tandcement in het midden van de ringachtige ruimte in de schroeven. Steek het gebogen uiteinde van één EMG-elektrode (voorbereid bij stap 1.1.2) ongeveer 1-2 mm in de nekspieren door de gebogen extremiteit vast te houden met dumont #5 tang en de huid boven de spieren op te tillen met extra fijne Graefe-tang. Plaats vervolgens de gebogen kant en elleboog van de elektrode in het tandcement; herhaal dit voor de tweede EMG-elektrode. OPMERKING: Het rechte uiteinde van de langere EMG-elektrode moet worden uitgelijnd met de voorste ECoG-elektrode en die van de kortere EMG-elektrode met de achterste ECoG-elektrode. Zorg ervoor dat de twee EMG-elektroden elkaar of een van de schroeven niet raken.</li>
	<li>Bedek de ogen van de muizen en breng 3-5 minuten licht aan om cementstolling te helpen. Zodra de EMG-elektroden stevig vast zitten, bedekt u de basis van de ECoG-elektroden en de basis van de ankerschroeven met tandcement om een kroonvormige contour te vormen. Bedek de ogen van de muizen en breng 3-5 minuten licht aan om cementstolling te helpen. OPMERKING: Breng geen cement aan op de ledematen van de ECoG- en EMG-elektrode (gouddraad die aan de connector wordt gesoldeerd) of op de huid.</li>
	<li>Vul het midden van de montage met eerder gemengd acrylcement. Verwijder tijdens de cementstolling de vier chirurgische klemmen die de huid vasthouden (en was deze onmiddellijk met delicate taakwissers). OPMERKING: Breng geen cement aan op de ledematen van de ECoG- en EMG-elektrode (gouddraad die aan de connector wordt gesoldeerd) of op de huid.</li>
	<li>Hecht de huid aan de achterkant en de voorkant van de montage zodat de schedel niet wordt blootgesteld (maar vermijd het uitrekken van de huid te veel) met behulp van een hechtnaald (13 mm 3/8 c) en synthetisch absorbeerbaar monofilament.</li>
	<li>Houd de connector boven de montage met gebogen tang en lijn de gouden draad van elektroden voorzichtig uit met de connectorpennen. Soldeerelektrode extremiteiten aan verbindingspennen met de soldeerbout. OPMERKING: Ga snel te werk om oververhitting en beschadiging van het corticale weefsel te voorkomen. Zorg ervoor dat elke elektrode goed contact maakt met de bijbehorende verbindingspen en dat de elektroden niet met elkaar zijn verbonden.</li>
	<li>Verwijder de muis uit het stereotaxic frame. Bedek de lege ruimte tussen de connector en de kop met eerder gemengd acrylcement door alle verbindingen tussen elektroden en connectorpennen te bedekken. OPMERKING: Vermijd cementinfiltratie in de connector door de muis met de connector boven het hoofd te houden (kop recht niet leunend).</li>
	<li>Weeg de muis en plaats deze in een schone kooi (bij voorkeur uitgerust met een deksel zonder gaas) op een warmtekussen (individuele behuizing om schade aan de hoofdmontage te voorkomen). Controleer het dier regelmatig en dien 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan toe bij het ontwaken en 12 uur later als het dier tekenen van pijn vertoont (bijv. abnormale houding, scheelziende ogen). OPMERKING: Gewichtstoename ten opzichte van het gewicht vóór de operatie mag niet groter zijn dan 1,5 g.</li>
</ol>4. Opnames
<ol><li>Huismuizen individueel om schade aan de hoofdmontage als gevolg van wederzijdse verzorging en schade en verstrengeling van de opnamekabels te voorkomen. OPMERKING: Voor dit protocol werden muizen gehuisvest met ad libitum toegang tot voedsel, water en een houten kubus, en er werd dagelijks toezicht gehouden.</li>
	<li>Sluit de muizen 2 weken na de operatie aan op opnamekabels voor aanpassing aan bekabelingsomstandigheden.</li>
	<li>Neem ECoG/EMG-signalen 24 uur (of langer/korter op, afhankelijk van onderzoeksvragen). OPMERKING: De opname van het ECoG/EMG-signaal werd uitgevoerd met behulp van een kabel, een draaibare connector (om rotatie van de kabel mogelijk te maken), een 36-kanaals draagbare doos en een versterker, die op een computer was aangesloten. Signalen worden bemonsterd bij 256 Hz (of meer afhankelijk van onderzoeksvragen) en opgenomen met commerciële software (zie de tabel met materialen). Om voldoende virale expressie te garanderen, moeten experimenten ten minste 3 weken na AAV-injectie worden uitgevoerd, zoals eerder beschreven29,37.</li>
	<li>Na de opname offert u de muizen op door cervicale dislocatie (of andere methoden afhankelijk van het immunostainingprotocol) en oogst u de hersenen voor immunostaining.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dit protocol beschrijft een nauwkeurige en eenvoudige methode om de ECoG- en EMG-activiteit te monitoren tijdens de manipulatie van moleculaire doelen met behulp van AAV's. Voor een adequate vergelijking tussen de groepen wordt ten zeerste aanbevolen om chirurgische procedures (AAV-injectie en elektrodeimplantatie) altijd op dezelfde dag te plannen voor test- en controledieren en hun elektrofysiologische signalen tegelijkertijd op te nemen. Om een vergelijkbare virale expressie tussen de test- en controledieren te verkrijgen, is het injecteren van dezelfde virale titer wenselijk. In het onderhavige geval was de virale Titer van controle-AAV teruggebracht tot de helft van de test-AAV om een vergelijkbare virale expressie te garanderen. Experimenteerders moeten zeer voorzichtig zijn met metingen van stereotaxic coördinaten om te zorgen voor een lage variabiliteit tussen dieren in hersengebied / corticale laagtargeting. Aangezien de injectiediepte wordt berekend vanaf het schedeloppervlak en de schedeldikte varieert afhankelijk van leeftijd en geslacht, moet de plaatsing van de canule altijd worden gecontroleerd met behulp van postprotocol histologie of immunohistochemie (bijv. figuur 2) om een adequate positionering/diepte van de injectie te garanderen, en de stereotaxic-coördinaten moeten indien nodig worden aangepast. Gedurende de 40 minuten durende AAV-injectie is het erg belangrijk om de injectiesnelheid te controleren om mogelijke problemen zoals pompblokkades snel te detecteren en te corrigeren. Sommige experimentele stappen zijn ook cruciaal om optimale elektrofysiologische signalen te verkrijgen. Draai bijvoorbeeld niet te veel tijdens elektrodeimplantatie; schroeven moeten minstens 2,5 mm uit de schedel steken om schade aan de hersenschors en de vorming van een glialitteken te minimaliseren. Daarna is het ook enorm belangrijk om i) te voorkomen dat cement op de uiteinden van de elektroden wordt aangebracht, ii) ervoor te zorgen dat de elektroden snel aan de connector worden gesoldeerd, en iii) ervoor te zorgen dat er geen contact is tussen de elektroden.
De hier gepresenteerde procedure voor ECoG- en EMG-opname is uiterst goed ingeburgerd, eenvoudig en wordt veel gebruikt om wakkerheid en slaap bij muizen2,11,13,34te controleren. Continue ECoG- en EMG-opnamen kunnen meerdere opeenvolgende dagen (en zelfs weken) worden uitgevoerd en genereren een zeer rijke dataset die kan worden gebruikt om verschillende analyselijnen uit te voeren, bestaande uit variabelen met betrekking tot wakkerheid en slaaphoeveelheid en architectuur2,11,12 (bijv. tijd doorgebracht in verschillende toestanden per lichte en donkere periode, aantal afleveringen van elke toestand, 24-h verdeling van de slaap), wakkerheid en slaapspectraal gehalte34,41 (bijv. vermogen in verschillende frequentiebanden [vergelijkbaar met figuur 3],schaalvrije activiteit) en kenmerken van individuele golven42,43,44 (bijv. langzame golfamplitude en helling). Bij gebruik in combinatie met AAV-gemedieerde moleculaire manipulaties is een bijkomend voordeel het vermijden van potentiële ontwikkelingscompensatie die kan optreden bij transgene dieren. Met de praktijk kan de hele procedure, inclusief de 40-min AAV-injectie, in ongeveer 90 minuten worden uitgevoerd. Het sterftecijfer moet (zeer) laag zijn omdat de operatie minimaal invasief is.
Het gelijktijdige gebruik van ECoG/EMG-opname en gerichte manipulatie met AAV biedt een verscheidenheid aan andere voordelen en toepassingen. De precisie van stereotaxic targeting, wanneer adequaat uitgevoerd, is bijvoorbeeld zeer hoog en reproduceerbaar en is nuttig om de specifieke rol van een bepaald hersengebied (en/of een celtype of een moleculair element binnen de regio) in de regulering van slaap of andere fysiologische processen te bepalen. Verschillende corticale gebieden kunnen dus gemakkelijk worden gericht met behulp van aanpassingen van het huidige protocol. Bovendien kunnen doelmanipulaties met behulp van AAV's worden gericht op een corticale / subcorticale gebied dat verschilt van de ECoG-opnamelocaties. In dergelijke gevallen kan het braamgat voor AAV-injectie worden bedekt met een kleine glazen afdeklip die is bevestigd met tandcement (of botwas). Voor verbeterde specificiteit bevat de AAV-constructie vaak een promotor die gerichte infectie van een nauwkeurig celtype14mogelijk maakt. Een CamKIIα promotor werd in het huidige protocol gebruikt om specifiek excitatory piramidale cellen14,29,45van de motorische cortex te richten. Deze strategie heeft de inactivatie van cofiline mogelijk gemaakt (met behulp van cofilineS3D)32,33 in excitatory neuronen van de motorische cortex en de observatie van staatsspecifieke veranderingen in ECoG-activiteit ( Figuur3). Om de effectiviteit van infectie/transductie te beoordelen, konden toekomstige protocolgebruikers het gepresenteerde AAV-ECoG-protocol combineren met een van co-kleuring door immunofluorescentie, en hoge vergrotingsafbeeldingen gebruiken om het aantal cellen te berekenen dat dubbel labeling toont van het totale aantal cellen met single-labeling van het doel (hier CaMKIIα-expresserende neuronen). In een recente studie werd een AAV-ECoG-methode vergelijkbaar met de hier beschreven methode gebruikt om fragiele X mentale retardatie syndroom-gerelateerde eiwit 1 (FXR1) in alle neuronen van de motorische cortex uit te expressie te brengen met behulp van een AAV met een synapspromotor en onthulde een effect van deze manipulatie op de verdeling van de waakzaamheidstoestand en spectrale inhoud28. Deze bevindingen illustreren hoe het manipuleren van een bepaald molecuul in een doelhersengebied met behulp van AAV's rollen kan onthullen in de regulering van specifieke wakkerheids-/slaapparameters.
Een beperking van het beschreven protocol is de kleine laesie van hersenweefsel die optreedt met canuleplaatsing voordat de AAV-injectie wordt uitgevoerd, wat ook gepaard kan gaan met een ontstekingsreactie. Dit kan met name van belang zijn bij het uitvoeren van AAV-injecties in subcorticale gebieden en moet altijd worden aangepakt met behulp van adequate controles. Als alternatief zou het huidige protocol kunnen worden gevolgd door de kwantificering van reactieve gliose en/of microgliale activering (bv. met behulp van immunofluorescentie) om vergelijkbare niveaus in controle- en testgroepen te garanderen, en dus op de ECoG-uitlezing. Een tweede beperking heeft betrekking op het risico van een slechte verbinding tussen een elektrode en de connector, wat kan leiden tot een continu of soms slecht elektrofysiologisch signaal. Stevig geschroefde, gesoldeerde en gecementeerde elektroden minimaliseren de incidentie van dit probleem. Een derde beperking houdt verband met dieren die tijdens de opname via de hoofdmontage worden vastgebonden, wat de voortbeweging en ander gedrag, althans tot op zekere hoogte, kan beperken en af en toe kan leiden tot bekabelingsschade en signaalverlies. Ten slotte is het gepresenteerde protocol meer geschikt voor volwassen muizen, aangezien de schedelgrootte van jongere dieren problemen kan veroorzaken bij het installeren van de afgebeelde hoofdmontage, zoals eerder beschreven2.
Gecombineerde ECoG/EMG-opname en AAV-gemedieerde manipulatie van een nauwkeurig doel is ook van toepassing op andere onderzoeksgebieden dan de neurowetenschappen van slaap. Het kan onder andere worden gebruikt om epileptische gebeurtenissen in diermodellen van epileptische aanvallen te bestuderen en te manipuleren en is een krachtig hulpmiddel om hersenschommelingen te moduleren die betrokken zijn bij geheugencodering en consolidatie46,47. Dienovereenkomstig omvatten potentiële toepassingen zeker de gebieden van fundamenteel onderzoek in de psychiatrie en neurologie, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Naast het vermogen om een inactieve vorm van een molecuul uit te drukken, kunnen en zijn AAV's gebruikt om te overexpresseren of te downreguleren (bijv. klein interfererend RNA, CRISPR/Cas9) of om de expressie van een molecuul in een full-body KO te redden. Belangrijk is dat de dubbele methodologie van het huidige protocol ook van toepassing is op andere zoogdiersoorten zoals ratten en dag knaagdieren die interessante modellen vertegenwoordigen om zowel slaap als neurodegeneratie te begrijpen48,49.

Elektro-encefalografische (of over het algemeen elektrocorticografische [ECoG] bij knaagdieren) en elektromyografische (EMG) opnames worden uitgebreid gebruikt in slaaponderzoek en meer in het algemeen in neurowetenschappen, neurologie en psychiatrie. In combinatie maken deze elektrofysiologische signalen het mogelijk waakzaamheidstoestanden te identificeren en de daaropvolgende kwantificering van de toestandsduur en spectrale samenstelling, zowel bij mensen als bij knaagdieren1,2,3,4. Een dergelijke kwantificering is nuttig geweest om te begrijpen hoe slaap wordt gewijzigd in pathologische omstandigheden zoals neurodegeneratieve ziekten en modellen5,6,7 of door genetische modificatie8,9. Bijvoorbeeld, de knock-out (KO) van verschillende genen gekoppeld aan neuronale communicatie bleek de duur van wakkerheid en slaap te veranderen in zowel de muis als fruitvlieg10,11,12,13. Om mogelijke ontwikkelingscompensatie als gevolg van de studie van full-body KO bij knaagdieren aan te pakken en een fijnere controle van genetische manipulatie mogelijk te maken, is een efficiënte manier om genexpressie te manipuleren het gebruik van adeno-geassocieerde virussen (AAV's). Een AAV-gemedieerde genetische manipulatie kan worden gebruikt om een bepaald moleculair doel te verlagen of te upreguleren en om de manipulatie te beperken tot een specifieke celpopulatie met behulp van verschillende soorten promotors14. AAV 's worden ook veel gebruikt als leveringsmethode in de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas9-technologie15,16. Deze methodologieën maken een betere temporele en ruimtelijke controle van genetische manipulatie mogelijk, wat over het algemeen wordt geassocieerd met de expressie van een verslaggever die kwantificering van het geïnfecteerde gebied met behulp van immunofluorescentie toestaat.
AAV 's vertegenwoordigen ook de belangrijkste vector voor celtypespecifieke manipulaties van neuronale activiteit via optogenetica en chemogenetica17,18,19, die veel zijn gebruikt in recent onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten, gedrag, cognitie en slaap20,21,22. In slaaponderzoek is de toepassing van optogenetica voor de activering of remming van bepaalde hersengebieden, zoals de basale voorhersenen, hypothalamus en sublaterodorsaal tegmentum, nuttig geweest om hun rol te bepalen bij de controle van opwinding, langzame slaap (ook bekend als niet-snelle oogbewegingsslaap), paradoxale slaap (of snelle oogbewegingsslaap) en kataplexie23, 24,25. Bovendien hebben AAV-gemedieerde manipulaties geholpen bij het ophelderen van belangrijke slaapregulerende circuits en moleculen die bijdragen aan de nadelige effecten van slaapverlies26,27,28. Een eiwit dat bijvoorbeeld betrokken blijkt te zijn bij slaaptekort-geïnduceerde geheugenstoornissen is cofiline29,30. Dit eiwit is een filamenteus actine-scheidend eiwit dat deelneemt aan de reorganisatie van actinefilamenten door zich fysiek te binden aan actine en de demontage van de filamenten op een dynamische manier te bevorderen31. Het remmen van cofiline-activiteit met behulp van een AAV-gemedieerde aanpak bleek wervelkolomverlies te voorkomen, evenals synaptische plasticiteit en geheugentekorten veroorzaakt door slaaptekort bij muizen29. Gezamenlijk benadrukken deze studies het nut en de relevantie van AAV-gemedieerde manipulaties om slaapregulatie en de gevolgen van slaaptekort bij knaagdieren te begrijpen.
Hier wordt een protocol beschreven dat ECoG- en EMG-elektrodeimplantatie en -opname combineert met de manipulatie van de cofilinefunctie in een hersenschorsgebied van wilde muizen (WT) met behulp van een AAV. Meer precies, een AAV (serotype 9) die de coderingssequentie van een fosfomimetische vorm van de muiscofiline (cofilineS3D)uitdrukt, waardoor deze inactief wordt32,33, wordt geïnjecteerd in de motorische cortex (M1 en M2). Een ECoG-elektrode wordt direct op de injectieplaats geïmplanteerd om de gesynchroniseerde corticale activiteit van de geïnfecteerde cellen te registreren. De ECoG/EMG-opname wordt drie weken na de operatie gedurende 24 uur onder ongestoorde omstandigheden uitgevoerd om herstel, aanpassing en hoge cofilineS3D-expressie mogelijk te maken. De registratie wordt vervolgens gebruikt voor de identificatie van waakzaamheidstoestanden en ECoG-spectrale analyse , zoals beschreven in eerdere studies11,34. Deze methodologie kan specifiek onthullen hoe corticale cofiline wakkerheid en slaap ECoG-signalen bij muizen moduleert. Deze combinatie van elektrofysiologische opnames en AAV-gemedieerde genetische manipulatie is bijzonder relevant om de rol van verschillende moleculaire elementen in specifieke hersenfuncties te onderzoeken en kan worden toegepast op corticale (en subcorticale) hersenruimte(s) die van belang zijn voor WT en genetisch gemodificeerde muizen van beide geslachten en zelfs andere soorten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Het gebruik van elektrocorticografische (ECoG) opnames bij knaagdieren is relevant voor slaaponderzoek en voor de studie van een breed scala aan neurologische aandoeningen. Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) worden steeds vaker gebruikt om het begrip van hersencircuits en hun functies te verbeteren. De AAV-gemedieerde manipulatie van specifieke celpopulaties en/of van precieze moleculaire componenten is enorm nuttig geweest om nieuwe slaapregulerende circuits/moleculen en belangrijke eiwitten te identificeren die bijdragen aan de nadelige effecten van slaapverlies. Bijvoorbeeld, remmende activiteit van de filamenteuze actine-scheidende eiwit cofiline met behulp van AAV voorkomt slaaptekort-geïnduceerde geheugenstoornis. Hier wordt een protocol beschreven dat de manipulatie van de cofilinefunctie in een hersenschorsgebied combineert met de registratie van ECoG-activiteit om te onderzoeken of corticale cofiline de wakkerheid en slaap-ECoG-signalen moduleert. AAV-injectie wordt uitgevoerd tijdens dezelfde chirurgische procedure als de implantatie van ECoG- en elektromyografische (EMG)-elektroden bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen. Muizen worden verdoofd en hun hoofden worden geschoren. Na huidreiniging en incisie worden stereotaxic-coördinaten van de motorische cortex bepaald en wordt de schedel op deze locatie doorboord. Een canule voorgevuld met een AAV die cofilineS3Duitdrukt, een inactieve vorm van cofiline, wordt langzaam in het corticale weefsel geplaatst. Na AAV-infusie worden met goud bedekte schroeven (ECoG-elektroden) door de schedel geschroefd en op de schedel gecementeerd met gouden draden die in de nekspieren zijn ingebracht (EMG-elektroden). De dieren krijgen drie weken de tijd om te herstellen en te zorgen voor voldoende expressie van cofilineS3D. Het geïnfecteerde gebied en celtype worden geverifieerd met behulp van immunohistochie en de ECoG wordt geanalyseerd met behulp van visuele identificatie van waakzaamheidstoestanden en spectrale analyse. Samengevat maakt deze gecombineerde methodologische benadering het mogelijk om de precieze bijdrage van moleculaire componenten te onderzoeken die neuronale morfologie reguleren en connectiviteit met de regulering van gesynchroniseerde hersenschorsactiviteit tijdens wakkerheid en slaap.

Na elektrofysiologische opnames wordt immunofluorescentie gebruikt om het door de AAV-injectie geïnfecteerde gebied te definiëren en de expressie van cofilineS3D te valideren (figuur 2). Immunostaining kan worden uitgevoerd met behulp van een methodologie die vergelijkbaar is met wat eerder is beschreven29,37,38,39. De AAV drukt een inactieve vorm van cofiline uit die is gefuseerd met een hemagglutinine (HA)-Tag (cofilineS3D-HA), die wordt gedetecteerd door immunofluorescentie met behulp van een anti-HA-antilichaam en een secundair antilichaam (Alexa Fluor 488). De geïnfecteerde excitatory neuronen (hier gericht met een calcium/calmodulin-afhankelijk eiwit kinase II alpha [CamKIIα] promotor die de expressie van het transgene in de AAV controleert) zijn gekleurd met het anti-HA antilichaam. Een succesvolle infectie wordt aangegeven door de kleuring van de neuronen in de motorische cortex rond de injectieplaats (figuur 2A, B). In dit representatieve voorbeeld vertoonde de hersenschors van de andere hemisfeer geen merkbare vlekken. Niettemin, gezien het feit dat excitatory neuronen kunnen projecteren naar verre hersengebieden, kleuring in de contralaterale hemisfeer is niet noodzakelijk een indicatie van mislukte injectie. Hogere vergroting van het geïnfecteerde gebied vertoonde kleuring van cellichamen en projecties, wat bevestigde dat alleen specifieke cellen van het beoogde corticale gebied waren geïnfecteerd (Figuur 2C).
Co-kleuring met markers van excitatory neuronen (bijv. vesiculaire glutamaat transporter 1, CaMKIIα) kan ook worden uitgevoerd om celtype-specificiteit te valideren. Als alternatief kunnen co-kleuring met markers van remmende neuronen of astrocyten worden uitgevoerd in het geval deze cellen zijn gericht met behulp van verschillende promotors. Co-kleuring van cofilineS3D-HA en CaMKIIα werd ook uitgevoerd bij hetzelfde dier voor een gebied dat meer posterieur was voor de injectieplaats dat nog steeds anti-HA-kleuring vertoonde in de motorische cortex (Figuur 2D). Het hogere vergrotingsbeeld van het gebied toont cellen die duidelijk cofilineS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figuur 2E)en CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figuur 2F)uitdrukken. De superpositie van de cofilineS3D-HA en CaMKIIα kleuring laat zien dat de meeste (zo niet alle) cellen die gekleurd zijn voor cofilineS3D-HA ook positief zijn voor CaMKIIα (Figuur 2G). Deze observatie ondersteunt de specificiteit van de infectie voor excitatory neuronen.
Om de impact van cofilinemanipulatie op ECoG-activiteit te beoordelen, worden ECoG- en EMG-signalen gebruikt om een visuele identificatie van waakzaamheidstoestanden uit te voeren (wakkerheid, langzame golfslaap, paradoxale slaap). Dit wordt gedaan op 4-s tijdperken vanwege de snelle verandering in waakzaamheidstoestand in de muis2, en hier, voor een volledige 24-uurs opname. Standaardanalyses omvatten berekening van slaaparchitectuur en spectrale analysevariabelen, zoals eerder uitgevoerd voor verschillende datasets11,12,13,28,34. Met name spectrale analyse van het ECoG-signaal van de verschillende staten zal de samenstelling en kwaliteit van de toestand indexeren. Om verschillen te verwijderen die bijvoorbeeld kunnen ontstaan uit verschillende diepten van de elektroden, kunnen spectrale analysegegevens worden uitgedrukt ten opzichte van het totale vermogen van alle toestanden van een bepaald dier (figuur 3A). Gezien de zeer lage relatieve amplitude van ECoG-activiteit in hogere frequenties, zijn relatieve vermogensspectra voor wakkerheid, langzame golfslaap en paradoxale slaap log-getransformeerd om de activiteit in lage en hoge frequenties beter te visualiseren en tegelijkertijd te vergelijken. Deze analyse geeft staatsspecifieke verschillen in spectrale activiteit aan onder omstandigheden van cofiline-inactivatie (Figuur 3B). Meer precies, deze voorlopige bevindingen die mannelijke en vrouwelijke muizen combineren, wijzen erop dat cofiline-inactivatie het spectrale vermogen in snelle frequenties (14-30 Hz) tijdens wakkerheid en in langzame frequenties (1-4 Hz) tijdens paradoxale slaap aanzienlijk verhoogt, terwijl ECoG-activiteit tijdens langzame golfslaap voornamelijk onaangetast blijft. Bovendien lijkt cofiline-inactivatie de variabiliteit tussen de muis in ECoG-activiteit te vergroten (met name merkbaar aan foutbalken voor wakkerheid in figuur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Figuur 1: Voorbereiding van ECoG/EMG montage componenten en representatief voorbeeld van ECoG elektrode plaatsing. (A) Een ECoG-elektrode: een 4 mm lange, 0,2 mm diameter gouden draad (niet geïsoleerd) wordt gesmolten op de kop van een met goud bedekte schroef (1,9 mm kopdiameter, 1,14 mm draaddiameter, 3,6 mm totale lengte) met behulp van loodvrij soldeer. (B) EMG-elektroden: twee gouden draden (1,5 en 2 cm) zijn gebogen om de kromming van de schedel tot aan de nekspier te omarmen en het andere uiteinde wordt recht gehouden om aan de connector te worden gesoldeerd. (C) Een 6-kanaals connector: loodvrij soldeer wordt toegevoegd aan 5 van de 6 metalen pinnen (weglaten in het midden) van de connector (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metalen pinnen). De bovenkant van de connector is bedekt met tape om zwerfvuil/waterinfiltratie te voorkomen. (D) Voorbeeld van de positionering van de drie onderhoudsschroeven op de schedel van de linkerhersenhelft en van de drie ECoG-elektroden (inclusief referentie-elektrode) op de rechterhersenhelft. De precieze stereotaxic-coördinaten van de ECoG-elektroden zijn aangegeven in stap 2.6 en 3.2 en zijn berekend op basis van de locatie van de bregma en lambda (die worden aangegeven door de gele stippen). Afkortingen: ECoG = elektrocorticografisch; EMG = elektromyografisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve immunostaining om het met AAV geïnfecteerde gebied en celtype te definiëren. (A) Schematische weergave met de injectieplaats van het in paneel B gepresenteerde coronale segment. De positie is 1,1 mm voor de bregma en de canule (rood weergegeven) was gericht op lagen V van de rechter primaire motorische cortex (M1). Representatie gewijzigd van Franklin en Paxinos40. (B) Immunostaining van HA om cofilineS3D-HA expressie te detecteren in neuronen getoond voor een coronale plak van de volledige hersenen gelegen ongeveer 1,1 mm vooraan aan de bregma. Het geïnfecteerde gebied lokaliseert voornamelijk naar lagen V en VI (infragranulaire lagen) van de juiste primaire en secundaire motorische cortices (M1 en M2). Schaalbalk = 500 μm. Het vierkant vertegenwoordigt het gebied weergegeven in C. (C) Hogere vergroting van het geïnfecteerde gebied met kleuring van geïnfecteerde cellen en bevestigende expressie van cofilineS3D-HA in diepere lagen van de motorische cortex. Schaalbalk = 100 μm. (D) Co-immunostaining van HA en CaMKIIα om de specificiteit van het celtype te beoordelen die wordt aangetoond voor een coronale plak van de rechterhersenhelft die zich ongeveer 0,5 mm voor bregma bevindt en daarom achter op de injectieplaats (dezelfde muis als in panelen B en C). Het geïnfecteerde gebied lokaliseert naar motorische cortices (M1 en voornamelijk M2). Schaalbalk = 500 μm. Het vierkant vertegenwoordigt het gebied weergegeven in E, F en G. (E) Hogere vergroting van het geïnfecteerde gebied met kleuring van geïnfecteerde cellen en bevestigende expressie van cofilineS3D-HA. Schaalbalk = 100 μm. (F) Hogere vergroting van het geïnfecteerde gebied met kleuring van CaMKIIα-positieve cellen. Schaalbalk = 100 μm. (G) Hogere vergroting van het geïnfecteerde gebied met co-labeling van cofilineS3D-HA en CaMKIIα, wat bevestigt dat geïnfecteerde cellen CaMKIIα-positief zijn. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus; M1 = primaire motorische cortex; M2 = secundaire motorische cortex; CPu = caudate putamen (striatum); LV = laterale ventrikel; HA= hemagglutinine; CamKIIα = calcium/calmodulin-afhankelijk eiwit kinase II alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve vermogensspectra voor wakkerheid, langzame golfslaap en paradoxale slaap verkregen na virale manipulatie van de cofilinfunctie. Mannelijke (n = 5 per groep) en vrouwelijke (n = 2 per groep) muizen geïnjecteerd met AAV9-CaMKIIα0.4-cofilineS3D-HA (virale titer 2,58 ×10 13 GC/ml) of met een controle-AAV (AAV9-CaMKIIα0,4-eGFP 1,25 ×10 13 GC/ml; de helft van de testtiter om te controleren voor het verbeterde signaal van deze controle-AAV) in laag V van de motorische cortex werd gedurende 24 uur geregistreerd; en het elektrocorticografische signaal werd onderworpen aan spectrale analyse (snelle Fourier Transform om spectrale kracht tussen 0,5 en 30 Hz te berekenen met een resolutie van 0,25 Hz). (A) Vermogensspectra tijdens de drie waakzaamheidstoestanden uitgedrukt ten opzichte van het totale vermogen van alle staten. (B) Relatieve vermogensspectra log-getransformeerd om meer adequaat weer te geven groepsverschillen in hogere frequenties. De onderdrukking van cofilineactiviteit in de motorische cortex met behulp van AAV9-CaMKIIα0.4-cofilineS3D-HA verhoogt de elektrocorticografische activiteit in het bètabereik (14-30 Hz) tijdens wakkerheid aanzienlijk, en in het deltabereik (1-4 Hz) tijdens paradoxale slaap in vergelijking met controle-injecties (rode lijnen boven x assen geven Mann-Whitney U-test aan op frequentiebandvermogen p < 0,0). Afkortingen: AAV = adeno-geassocieerd virus GC = genoomkopieën; HA= hemagglutinine; CamKIIα = calcium/calmodulin-afhankelijk eiwit kinase II alfa; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Dit artikel beschrijft een protocol voor de manipulatie van moleculaire doelen in de hersenschors met behulp van adeno-geassocieerde virussen en voor het monitoren van de effecten van deze manipulatie tijdens wakkerheid en slaap met behulp van elektrocorticografische opnames.

Elektrocorticografische opname van hersenschorsgebieden gemanipuleerd met behulp van een Adeno-geassocieerd virus gericht op cofilin bij muizen

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Dit protocol kan worden gebruikt om de rol van specifieke individuele moleculaire doelen in de regulering van elektrocorticografische activiteit tijdens verschillende Vigiline staten te identificeren. Een van de voordelen van het gebruik van adeno-geassocieerd virus is de mogelijkheid om precies gericht op een bepaald hersengebied en een specifiek celtype. Het protocol wordt gedemonstreerd door Julien Dufort-Gervais, een onderzoeksmedewerker van mijn team.Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op teenknijpreflex in een verdoofde muis van 12 weken oud, gebruikt u een haartrimmer om het haar van de achterkant van de oren naar de voorkant van het hoofd tussen de ogen te scheren. Voeg een royale druppel oogzalf toe aan elk oog om uitdroging te voorkomen en gebruik de oorstangen om het hoofd van de muis voorzichtig op een stereotaxisch apparaat te bevestigen. Trek de tong voorzichtig uit de mond om verstikking te voorkomen.Bevestig de neus van de muis aan het apparaat en gebruik 70% ethanol om de blootgestelde huid op het hoofd te steriliseren. Houd de huid vast met een extra fijne Graefe-tang, gebruik een tissueschaar om de huid van de basis van de oren tot het niveau van de ogen te snijden en plaats twee chirurgische klemmen aan elke kant van de incisie om de huid te strekken en de schedel bloot te stellen. Vermijd hersen hechtingen, gebruik een schaar tip om het schedeloppervlak te krassen om het periosteum te verwijderen en om overlappende strepen in twee of meer richtingen te creëren.Gebruik 70% ethanol om de botfragmenten te verwijderen en de schedel te desinfecteren. Met een eerder voorbereide canule bevestigd aan de stereotaxic arm, identificeer de locatie van de bregma en lambda en noteer de stereotaxic coördinaten van elk. Gebruik de stereotaxic arm en een pen om de positie van de canule op de schedel te markeren 1,5 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 1,5 millimeter voor de bregma.Prik met een boor van 0,7 millimeter voorzichtig de schedel op de gemarkeerde positie loodrecht op het schedeloppervlak en lijn af met de verticale as en was de schedel met een steriele katoenen punt gedrenkt in een 10% betadine povidonjodiumoplossing en trek vervolgens de zuiger van een spuit van 10 microliter in met één microliter om de canule te laden met een luchtbel van één microliter. Meng vervolgens het AAV-mengsel van belang met langzame pipetten en voeg 1,7 microliter van het mengsel toe aan een steriele petrischaal. Gebruik deze spuit om 1,5 microliter van de oplossing in de canule te laden en de positie van de luchtbel op de aangesloten PE50-buis te markeren.Lijn de canule verticaal uit met het gat in de schedel, zodat de canule de bovenrand van het bot bereikt en de Z-coördinaat van het schedeloppervlak markeert. Laat de canule langzaam zakken totdat de punt 1,5 millimeter onder het schedeloppervlak bereikt en laag vijf van de motorische cortex en start de spuitpomp met een debiet van 0,025 microliter per minuut om gedurende 40 minuten één microliter AAV te leveren. Gebruik de luchtbel in de buis om de injectie te volgen en eventueel bij te stellen.Wanneer het volledige virusvolume is afgeleverd, laat u de canule vijf minuten op zijn plaats om een voldoende diffusie te garanderen en terugstroming te voorkomen voordat u de stereotaxic-arm langzaam en voorzichtig optilt om de canule uit de cortex te verwijderen. Gebruik voor elektrodeimplantatie een rechte Kelly-tang om langzaam een elektrocorticografische elektrode met een rechte gouddraad in de verticale as van het gat waarin de AAV werd geïnjecteerd te schroeven, waardoor ten minste 2,5 millimeter schroef buiten de schedel achterblijft om de schade aan de dura en de hersenschors te minimaliseren. Gebruik een pen om de positie van de referentieelektrode te markeren 2,6 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 0,7 millimeter posterior naar bregma en de positie van de achterste elektrocardiografische elektrode op 1,5 millimeter zijdelings rechts naar de middellijn en 1,5 millimeter voor op lambda en de posities van drie onderhoudsschroeven op de linkerhersenhelft zonder specifieke coördinaten, maar zo ver mogelijk van elkaar en van de elektrocorticografische elektroden.Gebruik de boor om de schedel voorzichtig loodrecht op het schedeloppervlak te doorboren op de gemarkeerde posities van de andere elektroden en schroeven en was de doorboorde schedel met een 10% povidone jodiumoplossing. Blokkeer de gaten met kleine gerolde stukjes delicate taakveeg voordat u de schroeven installeert om bloedingen en verontreiniging te voorkomen en gebruik rechte Kelly-tangen om de schroeven in de boorgaten te steken onder dezelfde hoek als de gaten zijn doorboord. Plaats een paar kleine druppels tandcement in het midden van de ringachtige ruimte in de schroeven en gebruik extra fijne Graefe-tang om de huid boven de nekspieren op te tillen.Houd met dumont nummer vijf tang het gebogen uiteinde van één elektromyografische elektrode vast en steek deze ongeveer één tot twee millimeter in de spieren. Plaats de gebogen zijde en het vouwpunt van de elektrode in het tandcement en plaats de tweede elektromyografische elektrode op dezelfde manier. Nadat u de ogen van het dier hebt bedekt, brengt u drie tot vijf minuten licht aan om het cement te stollen en gebruikt u extra tandcement om de basis van de elektrocorticografische elektroden en de ankerschroeven te bedekken om een kroonvormige contour te vormen.Na het aanbrengen van nog drie tot vijf minuten licht, vult u het midden van de montage met acrylcement en verwijdert u de chirurgische klemmen. Gebruik een synthetische absorbeerbare monofilament hechtdraad om de huid aan de voor- en achterkant van de montage te sluiten, zodat de schedel niet wordt blootgesteld en gebruik gebogen tang om de connector boven de montage te houden om de gouden draden van de elektroden zorgvuldig uit te lijnen met de connectorpennen en soldeer vervolgens snel elke elektrode-extremiteit tot een enkele overeenkomstige connectorpen. Nadat u de muis uit het frame hebt verwijderd, bedekt u de lege ruimte tussen de connector en de kop met het acrylcement.En plaats de muis na het wegen in een schone kooi met een deksel zonder mazen op een warmtekussen. Sluit de muizen twee weken na de operatie aan op opnamekabels en noteer ten minste een week later de elektrocorticografische en elektromyografische signalen gedurende 24 uur of langer. Een succesvolle infectie wordt bevestigd door HA-kleuring van de neuronen in de motorische cortex rond de injectieplaats, wat wijst op de aanwezigheid van cofiline S3D HA. Co-kleuring met de excitatory neuron marker CaMKII alpha duidt op heldere cofiline S3D HA en CaMKII alpha co-expressie onder hoge vergroting.Log getransformeerde relatieve macht spectra voor wakkerheid, langzame golf slaap, en paradoxale slaap tonen staat-specifieke verschillen in spectrale activiteit onder cofiline inactivatie. De combinatie van elektrocorticografische opname en AAV-gemedieerde manipulatie van precieze moleculaire doelen is ook van toepassing op meerdere hersengebieden en op andere neurowetenschappelijke deelgebieden zoals onderzoek naar epilepsie of geheugen naast slaap.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...