Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Arbeidet ble finansiert av Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. Forfatterne er takknemlige til Chloé Provost og Caroline Bouchard for teknisk hjelp.

Alle metoder ble godkjent av Comité d'éthique de l'expérimentation animale av Recherche CIUSSS-NIM og er i samsvar med retningslinjer fra Canadian Council on Animal Care. Se materialtabellen for reagenser, utstyr og materialer som brukes i denne protokollen.
1. Kirurgi forberedelse
<ol><li>Fremstilling av ECoG- og EMG-elektroder<ol>
<li>For hvert dyr, lag tre ECoG-elektroder: Bruk loddejern, legg en liten dråpe blyfri lodde på skruehetten på en gulldekket skrue, og lodd en 4 mm lang gulltråd med diameter på 0,2 mm (ikke-isolert) på toppen av skruehetten ved hjelp av den blyfrie loddejernet (Figur 1A). Forbered 2 elektroder med gulltråden rett opp, og en med en 45° vinkel fra vertikalen.</li>
		<li>For hvert dyr, lag to EMG-elektroder: kutt en gulltråd med en diameter på 0,2 mm til en lengde på 1,5 cm og en annen til 2 cm. Bue begge ledningene for disse for å omfavne kurven på skallen opp til nakkemuskulaturen, og hold en rett ende som vil bli loddet til kontakten (Figur 1B).</li>
		<li>For hvert dyr, lag en kontakt: Bruk en 6-kanals kontakt (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metallpinner), og legg blyfri lodding til 5 av de 6 metallpinnene (utelater en midtstift; Figur 1C). Dekk toppen av kontakten med tape for å unngå søppel eller vanninfiltrasjon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilberedning av AAVs og sprøytepumpe<ol>
<li>Forbered testen AAV (her, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) og/eller kontrollen AAV (her, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) ved å fortynne lager AAV mix(er) (her, AAVer i en løsning av fosfatbufret saltvann som inneholder ikke-ionisk overflateaktivt middel [0,001%]) med steril saltvann for å oppnå ønsket viral titer (vanligvis 1012-13 genomkopier [GC]/ml) og det nødvendige volumet for antall mus som skal behandles. MERK: Et injisert volum på 1 μL per kortikale område per mus krever tilberedning av 2 μL.</li>
		<li>Fest en 10 μL sprøyte til en sprøytepumpe og fyll den med destillert vann.</li>
		<li>Fyll ett PE50-rør med ca. 60 cm lengde med destillert vann ved hjelp av en 1 ml sprøyte og en 21 G nål. Det er viktig å la 21G-kanylen og sprøyten være på plass etter påfylling. Koble PE50-røret til sprøytepumpen; la den 21 G kanylen/sprøyten ligge på den ene enden av PE50-røret, og koble den andre enden til 10 μL-sprøyten.</li>
		<li>Når røret er festet til 10 μL-sprøyten, fjern nålen i den andre enden, og skyv stempelet på 10 μL-sprøyten for å fylle gapet som er igjen av nålen med vann. MERK: Pass på at det ikke er noen luftboble, og at røret er helt fylt med vann.</li>
		<li>Monter en kanyle på 28 G i enden av røret der kanylen ble fjernet. Skyv vann inn i kanylen med 10 μL sprøyten for å fylle den helt. Fest kanylen tett til den stereotaktiske armen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse av dyr MERK: C57BL6/J mannlige og kvinnelige mus på ~ 12 uker ble tidligere tilpasset i minst 2 uker til boliger i individuelle bur og til en 12-timers lys: 12-timers mørk syklus med ad libitum mat og vann og tilgang til en trekube.<ol>
<li>Vei musene forsiktig, og injiser intraperitonealt en blanding av ketamin/xylazin (120/10 mg/kg) for anestesi. Vent ca 10 min på dyp anestesi.</li>
		<li>Barber håret fra baksiden av ørene til forsiden av hodet mellom øynene ved hjelp av en hårtrimmer. MERK: Vær svært forsiktig så du ikke kutter whiskers (beskytt whiskers med en finger under barbering) som whisker trimming vil endre sensoriske innganger og ECoG aktivitet35,36.</li>
		<li>Tilsett en sjenerøs dråpe oftalmisk salve på hvert øye for å forhindre dehydrering. Kontroller dybden av anestesi regelmessig under prosedyren ved å klemme en tå fra bakpoten. Gi musen 0,5-1,5% isofluran for å sikre dyp anestesi hvis en tå klype refleks vises.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intracortical AAV injeksjon med en sprøyte pumpe
MERK: Utfør alle følgende trinn med steriliserte instrumenter og i et rent miljø. Bruk 70% etanol til å vaske steriliserte instrumenter ytterligere og til å vaske elektroder tilberedt i avsnitt 1.1 samt ankerskruer (ikke-gulldekkede skruer) før operasjonen påben.
<ol><li>Fest forsiktig musens hode på det stereotaktiske apparatet med ørestenger. MERK: Pass på at hodet ikke beveger seg sidelengs.</li>
	<li>Trekk forsiktig dyrets tunge ut av munnen for å unngå kvelning, og fest musens nese med stereotaxic adapteren. MERK: Overvåk pusten ofte under prosedyren.</li>
	<li>Steriliser det barberte området av hodet med 70% etanol og ved å holde huden med en ekstra fin Graefe tang, kutt huden fra bunnen av ørene til øynene med vev saks. Bruk fire kirurgiske klemmer for å strekke huden og eksponere skallen (to på hver side av snittet; se figur 1D).</li>
	<li>Riper på skalleoverflaten med en skarp saksespiss: Samtidig som du unngår bein suturer, fjern periosteum og lag overlappende striper i to eller flere retninger. Fjern beinfragmentene, og tørk skallen med 70% etanol. MERK: Riper og striper vil bidra til å gjøre innspillingsmontasjen mer robust ved å forbedre sementens overholdelse til skallen (se nedenfor).</li>
	<li>Med kanylen festet til den stereotaktiske armen, identifiser plasseringen av bregmaen (dvs. skjæringspunktet mellom skallen coronal og sagittal suturer; Figur 1D) og lambda (dvs. skjæringspunktet mellom skallen sagittal sutur og en rett linje som forbinder venstre og høyre lambdoid sutur; Figur 1D), og noter deg de stereotaktiske koordinatene til hver av dem. Hvis forskjellen mellom z koordinater (vertikal akse) av bregma og lambda er større enn 0,3 mm, juster høyden på nesen ved hjelp av stereotaxic adapteren til z-posisjonen til bregma og lambda er justert.</li>
	<li>Merk kanylens posisjon på skallen med en penn ved disse koordinatene (motor cortex): 1,5 mm lateral høyre til midtlinje og 1,5 mm fremre til bregma. Gjennombor skallen forsiktig i kanylens posisjon med et 0,7 mm bor i en retning vinkelrett på skalleoverflaten (justert med den vertikale aksen). Vask den gjennomborede skallen med en steril bomullsspiss impregnert med en 10% providon-jodoppløsning.</li>
	<li>Legg kanylen med en 1 μL luftboble ved å trekke 10 μL sprøytestempel tilbake med 1 μL. Last testen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) eller kontrollen AAV (her AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) i kanylen som tidligere var lastet med luftboblen: Bland AAV ved å sakte pipette opp og ned, pipet 1,7 μL på en steril Petri-tallerken, og aspirer 1,5 μL av oppløsningen i kanylen ved å sakte trekke stempelet på 10 μL sprøyten. Merk posisjonen til luftboblen på PE50-røret for å tillate sporing av injeksjonen.</li>
	<li>Juster kanylen med hullet på skallen for kanylens vertikale posisjon for å nå den øvre kanten av skallen (dvs. skalleoverflate). Fra skalleoverflaten, senk kanylen sakte med 1,5 mm (for å nå 1,5 mm under skalleoverflaten og lag V av motor cortex). MERK: Vær veldig forsiktig så du ikke senker kanylen for mye for å unngå unødvendig lesjon i hjernevevet.</li>
	<li>Start sprøytepumpen for å injisere 1 μL AAV i løpet av 40 min (hastighet: 0,025 μL/min for å minimere vevsskade). Hold oversikt over injeksjonen på PE50-røret med bevegelse av luftboblen, og gjør justeringer om nødvendig.</li>
	<li>Etter at injeksjonen er fullført, la kanylen være på plass i 5 minutter for å sikre tilstrekkelig diffusjon og unngå tilbakestrømning. Løft deretter den stereotaktiske armen langsomt og forsiktig for å fjerne kanylen fra cortexen.</li>
</ol>3. ECoG/EMG elektrodeimplantasjon
<ol><li>Bruk rette Kelly-tang, skru sakte en ECoG-elektrode (med rett gulltråd) i den vertikale aksen (samme vinkel som hullet ble gjennomboret) i hullet der AAV ble injisert. La minst 2,5 mm av skruen være ute av skallen for å minimere skade på dura og hjernebark (dvs. for en omtrentlig dybde på 1,1 mm fra skalleoverflaten; Figur 1D).</li>
	<li>Merk posisjonen til den bakre ECoG-elektroden og referanseelektroden på skallen med en penn ved disse koordinatene: bakre elektrode (visuell cortex) 1,5 mm lateral høyre til midtlinje og 1,5 mm fremre til lambda, referanseelektrode (somatosensorisk cortex) 2,6 mm lateral rett til midtlinje og 0,7 mm bakre til bregma. Merk også posisjonen til tre vedlikeholdsskruer (fungerer som ankre mellom skallen og tannsementen for å størkne hodemontasje) på venstre halvkule uten spesifikke koordinater, men så fjernt som mulig fra hverandre og fra ECoG-elektrodene.</li>
	<li>Gjennombor skallen forsiktig i den markerte posisjonen til de andre elektrodene og ankerskruene med 0,7 mm boret. Pierce i en retning vinkelrett på skalleoverflaten for hver skrue (dvs. vertikal akse for bakre elektrode, men med en vinkel fra den vertikale aksen for andre steder). Vask den gjennomborede skallen med en 10% providon-jodoppløsning, og blokker hullene med små, rullede stykker delikate oppgaveviskere før du installerer skruene for å forhindre blødning og forurensning.</li>
	<li>Bruk de rette Kelly-tangene til å skru vedlikeholdsskruene på venstre halvkule og skru deretter de to siste elektrodene på høyre halvkule. Pass på at du skrur med samme vinkel som hullene var gjennomboret, og la minst 2,5 mm av hver skrue stå utenfor skallen (figur 1D). MERK: For å maksimere soliditeten til den endelige montasjen og kvaliteten på de elektrofysiologiske signalene, må du passe på at du ikke berører noen skrue når du installerer den neste.</li>
	<li>Legg noen små dråper tannsement i midten av det ringlignende rommet inne i skruene. Sett inn den buede enden av en EMG-elektrode (fremstilt i trinn 1.1.2) ca. 1-2 mm i nakkemusklene ved å holde den buede ekstremiteten ved hjelp av Dumont #5 tang og løfte huden over muskler med ekstra fine Graefe tang. Plasser deretter den buede siden og albuen på elektroden i tannsementen; gjenta for den andre EMG-elektroden. MERK: Den rette enden av den lengre EMG-elektroden skal være på linje med den fremre ECoG-elektroden og den kortere EMG-elektroden med den bakre ECoG-elektroden. Pass på at de to EMG-elektrodene ikke berører hverandre eller noen av skruene.</li>
	<li>Dekk musenes øyne, og påfør lys i 3-5 min for å bidra til sementstørkning. Når EMG-elektrodene holder godt fast, dekker du basen på ECoG-elektrodene og bunnen av ankerskruene med tannsement for å danne en kroneformet kontur. Dekk musenes øyne, og påfør lys i 3-5 min for å bidra til sementstørkning. MERK: Ikke påfør sement på ECoG- og EMG-elektrodeekstremitetene (gulltråd som vil bli loddet til kontakten) eller på huden.</li>
	<li>Fyll midten av montasjen med tidligere blandet akryl sement. Under sementstørkning fjerner du de fire kirurgiske klemmene som holder huden (og vasker disse umiddelbart med delikate oppgaveviskere). MERK: Ikke påfør sement på ECoG- og EMG-elektrodeekstremitetene (gulltråd som vil bli loddet til kontakten) eller på huden.</li>
	<li>Suturer huden på baksiden og forsiden av montasjen slik at skallen ikke blir utsatt (men unngå å strekke huden for mye) ved hjelp av en suturnål (13 mm 3/8 c) og syntetisk absorberbar monofilament.</li>
	<li>Hold kontakten over montasjen med buede tang, og juster forsiktig gullledningen til elektroder med kontaktpinnene. Loddeelektrode ekstremiteter til kontaktpinner med loddejernet. MERK: Fortsett raskt for å unngå overoppheting og skade på kortikale vev. Pass på at hver elektrode har god kontakt med den tilsvarende kontaktstiften, og at elektrodene ikke er koblet til hverandre.</li>
	<li>Fjern musen fra den stereotaktiske rammen. Dekk det tomme rommet mellom kontakten og hodet med tidligere blandet akrylsement ved å dekke alle tilkoblinger mellom elektroder og kontaktpinner. MERK: Unngå sementinfiltrasjon inne i kontakten ved å holde musen med kontakten over hodet (hodet rett ikke lener seg).</li>
	<li>Vei musen og legg den i et rent bur (helst utstyrt med et ikke-maskert lokk) på en varmepute (individuelt hus for å unngå skade på hodemontasjen). Overvåk dyret regelmessig, og administrer 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant ved oppvåkning, og 12 timer senere hvis dyret viser tegn på smerte (f.eks. unormal holdning, mysede øyne). MERK: Vektøkning i forhold til pre-kirurgi vekt bør ikke overstige 1,5 g.</li>
</ol>4. Opptak
<ol><li>Husmus individuelt for å unngå skade på hodemontasjen som følge av gjensidig grooming samt skade og innvikling av opptakskablene. MERK: I denne protokollen ble mus plassert med ad libitum tilgang til mat, vann og en trekube, og daglig overvåking ble utført.</li>
	<li>Koble musene til opptakskabler 2 uker etter operasjonen for tilpasning til kabler.</li>
	<li>Registrer ECoG/EMG-signaler i 24 timer (eller lengre/kortere, avhengig av forskningsspørsmål). MERK: ECoG/EMG-signalopptak ble utført ved hjelp av en kabel, en dreibar kontakt (for å tillate rotasjon av kabelen), en 36-kanals bærbar boks og en forsterker, som var koblet til en datamaskin. Signaler prøves på 256 Hz (eller mer avhengig av forskningsspørsmål) og registreres med kommersiell programvare (se materialtabellen). For å sikre tilstrekkelig viralt uttrykk, bør eksperimenter gjøres minst 3 uker etter AAV-injeksjon, som beskrevet tidligere29,37.</li>
	<li>Etter opptak, ofre musene ved cervical dislokasjon (eller andre metoder avhengig av immunoppfatningsprotokollen), og høst hjernen for immunstaining.</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver en presis og grei metode for å overvåke ECoG- og EMG-aktivitet under manipulering av molekylære mål ved hjelp av AAVer. For tilstrekkelig sammenligning mellom grupper anbefales det på det sterkeste å alltid planlegge kirurgiske prosedyrer (AAV-injeksjon og elektrodeimplantasjon) samme dag for test- og kontrolldyr, og å registrere deres elektrofysiologiske signaler samtidig. For å oppnå lignende viralt uttrykk mellom test- og kontrolldyrene, er det ønskelig å injisere samme virale titer. I dette tilfellet hadde viral titer av kontroll AAV blitt redusert til halvparten av testen AAV for å sikre lignende viral uttrykk. Eksperimenter bør være svært forsiktige med målinger av stereotaksiske koordinater for å sikre lav variasjon mellom dyr i hjerneområdet / kortikale lagmålretting. I tillegg, gitt at injeksjonsdybden beregnes fra skalleoverflaten, og at skalletykkelsen varierer med alder og kjønn, bør plasseringen av kanylen alltid verifiseres ved hjelp av postprotokoll histologi eller immunhiistokjemi (f.eks. figur 2) for å sikre tilstrekkelig posisjonering / injeksjonsdybde, og de stereotakaxiske koordinatene bør justeres om nødvendig. Gjennom 40-minutters AAV-injeksjonen er det svært viktig å overvåke injeksjonshastigheten for raskt å oppdage og korrigere potensielle problemer som pumpeblokkering. Noen eksperimentelle trinn er også avgjørende for å oppnå optimale elektrofysiologiske signaler. For eksempel, ikke overscrew under elektrodeimplantasjon; skruer skal stikke ut av skallen med minst 2,5 mm for å minimere skade på hjernebarken og dannelsen av et glial arr. Etterpå er det også enormt viktig for i) unngå å påføre sement på elektrodenes ekstremiteter, ii) sikre en rask lodding av elektrodene til kontakten, og iii) sørg for at det ikke er kontakt mellom elektrodene.
Prosedyren som presenteres her for ECoG- og EMG-opptak er ekstremt godt etablert, enkel og mye brukt til å overvåke våkenhet og søvn hos mus2,11,13,34. Kontinuerlige ECoG- og EMG-opptak kan utføres i flere påfølgende dager (og til og med uker) og generere et veldig rikt datasett som kan brukes til å utføre flere analyselinjer som består av variabler relatert til våkenhet og søvnmengde og arkitektur2,11,12 (f.eks. tid brukt i forskjellige tilstander per lys og mørke perioder, antall episoder av hver stat, 24-timers fordeling av søvn), våkenhet og søvnspektralinnhold34,41 (f.eks. kraft i forskjellige frekvensbånd [lik figur 3], skalafri aktivitet) og egenskaper ved individuelle bølger42,43,44 (f.eks. langsom amplitude og helling). Når det brukes i kombinasjon med AAV-medierte molekylære manipulasjoner, er en ekstra fordel å unngå potensiell utviklingskompensasjon som kan oppstå hos transgene dyr. Med praksis kan hele prosedyren, inkludert 40-min AAV-injeksjon, utføres på ca. 90 min. Dødeligheten bør være (svært) lav, da operasjonen er minimalt invasiv.
Samtidig bruk av ECoG / EMG-opptak og målrettet manipulering med AAV tilbyr en rekke andre fordeler og applikasjoner. For eksempel er presisjonen til stereotaxisk målretting, når den er tilstrekkelig utført, veldig høy og replikerbar og er nyttig for å bestemme den spesifikke rollen til en gitt hjerneregion (og / eller en celletype eller et molekylært element i regionen) i reguleringen av søvn eller andre fysiologiske prosesser. Flere forskjellige kortikale områder kan dermed enkelt målrettes ved hjelp av tilpasninger av den nåværende protokollen. Videre kan målmanipulasjoner ved hjelp av AAVer rettes til et kortikale / subkortiske område som er forskjellig fra ECoG-opptaksstedene. I slike tilfeller kan burrhullet for AAV-injeksjon dekkes av et lite glassdeksler festet ved hjelp av tannsement (eller benvoks). For økt spesifisitet inkluderer AAV-konstruksjonen ofte en promotor som tillater målrettet infeksjon av en presis celletype14. En CamKIIα-promotor ble brukt i den nåværende protokollen for å spesifikt målrette eksitatoriske pyramideceller14,29,45av motor cortex. Denne strategien har gjort det mulig å inaktivere cofilin (ved hjelp av cofilinS3D)32,33 i eksitatoriske nevroner av motor cortex og observasjon av tilstandsspesifikke endringer i ECoG-aktivitet ( figur3). For å vurdere infeksjons-/transduksjonseffekt, kan fremtidige protokollbrukere kombinere den presenterte AAV-ECoG-protokollen med en av co-farging ved immunfluorescens, og bruke bilder med høy forstørrelse til å beregne antall celler som viser dobbeltmerking av det totale antallet celler som viser enkeltmerking av målet (her, CaMKIIα-uttrykkende nevroner). I en nylig studie ble en AAV-ECoG-metode som ligner den som er beskrevet her, brukt til å overekspressere skjøre X mental retardasjonssyndromrelatert protein 1 (FXR1) i alle nevroner av motor cortex ved hjelp av en AAV som inneholder en synapsinpromotor og avslørte en effekt av denne manipulasjonen på årvåkenhetstilstandsdistribusjon og spektralt innhold28. Disse funnene illustrerer hvordan manipulering av et gitt molekyl i en målhjerneregion ved hjelp av AAVer kan avdekke roller i reguleringen av spesifikke våkenhets-/søvnparametere.
En begrensning av den beskrevne protokollen er den lille lesjonen av hjernevev som oppstår med kanyleplassering før du utfører AAV-injeksjonen, som også kan ledsages av en inflammatorisk respons. Dette kan være spesielt bekymringsfullt når du utfører AAV-injeksjon i subkortiske områder og bør alltid håndteres ved hjelp av tilstrekkelige kontroller. Alternativt kan den nåværende protokollen etterfølges av kvantifisering av reaktiv gliose og/eller mikroglial aktivering (f.eks. ved bruk av immunfluorescens) for å sikre lignende nivåer i kontroll- og testgrupper og derfor på ECoG-avlesningen. En annen begrensning er knyttet til risikoen for dårlig forbindelse mellom en elektrode og kontakten, noe som kan føre til et kontinuerlig eller noen ganger dårlig elektrofysiologisk signal. Solid skrudd, loddet og sementert elektroder vil minimere forekomsten av dette problemet. En tredje begrensning er relatert til dyr som blir bundet via hodemontasjen under innspillingen, noe som kan begrense bevegelse og annen oppførsel, i det minste til en viss grad, og av og til føre til kablingsskader og signaltap. Til slutt er den presenterte protokollen mer egnet for voksne mus, gitt at skallens størrelse på yngre dyr kan forårsake vanskeligheter med å installere den avbildet hodemontasjen, som beskrevet tidligere2.
Kombinert ECoG/EMG-opptak og AAV-mediert manipulering av et presist mål gjelder også for andre forskningsfelt enn søvnens nevrovitenskap. Blant annet kan den brukes til å studere og manipulere epileptiske hendelser i dyremodeller av anfall og er et kraftig verktøy for å modulere hjernesvingninger involvert i minnekoding ogkonsolidering 46,47. Følgelig omfatter potensielle applikasjoner absolutt feltene grunnleggende forskning innen psykiatri og nevrologi, inkludert nevrodegenerative sykdommer. I tillegg til kapasiteten til å uttrykke en inaktiv form for et molekyl, kan og har AAVs blitt brukt til å overekspressere eller nedregulere (f.eks. små forstyrrende RNA, CRISPR / Cas9) eller for å redde uttrykket av et molekyl i en fullkropps KO. Det er viktig at den doble metodikken i den nåværende protokollen også gjelder for andre pattedyrarter som rotter og daglige gnagere som representerer interessante modeller for å forstå både søvn og nevrodegenerasjon48,49.

Elektroencefalografiske (eller generelt elektrokortikografiske [ECoG] hos gnagere) og elektromyografiske (EMG) opptak brukes mye i søvnforskning så vel som mer generelt innen nevrovitenskap, nevrologi og psykiatri. I kombinasjon tillater disse elektrofysiologiske signalene identifisering av årvåkenhetstilstander og den påfølgende kvantifiseringen av tilstandsvarighet og spektralsammensetning, både hos mennesker og gnagere1,2,3,4. Slike kvantifisering har vært nyttig for å forstå hvordan søvn er modifisert i patologiske forhold som nevrodegenerative sykdommer og modeller5,6,7 eller ved genetisk modifikasjon8,9. For eksempel ble knockout (KO) av forskjellige gener knyttet til nevronkommunikasjon vist å endre varigheten av våkenhet og søvn i både musen og fruktfluen10,11,12,13. For å takle potensiell utviklingskompensasjon som følge av studiet av fullkropps KO hos gnagere og for å muliggjøre en finere kontroll av genetisk manipulasjon, er en effektiv måte å manipulere genuttrykk på å bruke adeno-assosierte virus (AAVer). En AAV-mediert genetisk manipulasjon kan brukes til å ned- eller oppregulere et gitt molekylært mål og for å begrense manipulasjonen til en bestemt cellepopulasjon ved hjelp av forskjellige typer promotorer14. AAVer brukes også mye som leveringsmetode i de klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-teknologi15,16. Disse metodene tillater bedre tidsmessig og romlig kontroll av genetisk manipulasjon, som generelt er forbundet med uttrykket av en reporter som tillater kvantifisering av det infiserte området ved hjelp av immunfluorescens.
AAVer representerer også hovedvektoren for celletypespesifikke manipulasjoner av nevronaktivitet via optogenetikk og kjemogenetikk17,18,19, som har blitt mye brukt i nyere forskning på nevrodegenerative sykdommer, oppførsel, kognisjon og søvn20,21,22. I søvnforskning har anvendelsen av optogenetikk for aktivering eller hemming av visse hjerneregioner, for eksempel basal forebrain, hypothalamus og sublaterodorsal tegmentum, vært nyttig for å bestemme sine roller i kontrollen av opphisselse, langsom søvn (også kjent som ikke-rask øyebevegelses søvn), paradoksal søvn (eller rask øyebevegelsessøvn) og katapleksi23, 24,25. Videre har AAV-medierte manipulasjoner bidratt til å belyse viktige søvnregulatoriske kretser og molekyler som bidrar til de negative effektene av søvntap26,27,28. For eksempel er ett protein som viser seg å være implisert i søvnmangelindusert hukommelsessvikt cofilin29,30. Dette proteinet er et filamentøst aktin-severing protein som deltar i omorganisering av aktinfilamenter ved fysisk binding til aktin og fremme demontering av filamentene på en dynamisk måte31. Hemming av cofilinaktivitet ved hjelp av en AAV-mediert tilnærming ble vist å forhindre ryggtap samt synaptisk plastisitet og minneunderskudd forårsaket av søvnmangel hos mus29. Samlet legger disse studiene vekt på nytten og relevansen av AAV-medierte manipulasjoner for å forstå søvnregulering og konsekvensene av søvnmangel hos gnagere.
Her beskrives en protokoll som kombinerer ECoG- og EMG-elektrodeimplantasjon og opptak med manipulering av cofilinfunksjon i et hjernebarkområde av villtype (WT) mus ved hjelp av en AAV. Nærmere bestemt injiseres en AAV (serotype 9) som uttrykker kodingssekvensen av en fosfomimetisk form av muskofilin (cofilinS3D), noe som gjør den inaktiv32,33, i motor cortex (M1 og M2). En ECoG-elektrode implanteres direkte på injeksjonsstedet for å sikre opptak av den synkroniserte kortikale aktiviteten til de infiserte cellene. ECoG/ EMG-opptaket utføres i 24 timer under uforstyrrede forhold tre uker etter operasjonen for å muliggjøre utvinning, tilpasning og høyt cofilinS3D-uttrykk. Opptaket brukes deretter til identifisering av årvåkenhetstilstander og ECoG spektralanalyse, som beskrevet i tidligere studier11,34. Denne metoden kan spesifikt avsløre hvordan kortikale cofilin modulerer våkenhet og søvn ECoG-signaler hos mus. Denne kombinasjonen av elektrofysiologiske opptak og AAV-mediert genetisk manipulasjon er spesielt relevant for å undersøke rollene til ulike molekylære elementer i spesifikke hjernefunksjoner og kan brukes på kortikale (og subkortiske) hjerneområder av interesse for WT og genetisk modifiserte mus av både kjønn og til og med andre arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Bruken av elektrokortikografiske (ECoG) opptak hos gnagere er relevant for søvnforskning og for studiet av et bredt spekter av nevrologiske forhold. Adeno-assosierte virus (AAVer) brukes i økende grad til å forbedre forståelsen av hjernekretser og deres funksjoner. Den AAV-medierte manipuleringen av spesifikke cellepopulasjoner og/eller presise molekylære komponenter har vært enormt nyttig for å identifisere nye søvnregulatoriske kretser/molekyler og nøkkelproteiner som bidrar til de negative effektene av søvntap. For eksempel forhindrer hemming av aktiviteten til den filamentøse aktin-severing protein cofilin ved hjelp av AAV søvnmangelindusert hukommelsessvikt. Her beskrives en protokoll som kombinerer manipulering av cofilinfunksjon i et hjernebarkområde med registrering av ECoG-aktivitet for å undersøke om kortikale cofilin modulerer våkenhet og søvn ECoG-signaler. AAV-injeksjon utføres under samme kirurgiske prosedyre som implantasjon av ECoG og elektromyografiske (EMG) elektroder hos voksne mannlige og kvinnelige mus. Mus er bedøvet, og hodene deres er barbert. Etter hudrengjøring og snitt bestemmes stereotaxiske koordinater av motor cortex, og skallen er gjennomboret på dette stedet. En kanyle forhåndsfylt med en AAV som uttrykker cofilinS3D, en inaktiv form for cofilin, er sakte plassert i kortikale vev. Etter AAV-infusjon skrues gulldekkede skruer (ECoG-elektroder) gjennom skallen og sementeres til skallen med gulltråder satt inn i nakkemuskulaturen (EMG-elektroder). Dyrene får tre uker til å gjenopprette og sikre tilstrekkelig uttrykk for cofilinS3D. Det infiserte området og celletypen verifiseres ved hjelp av immunhiistokjemi, og ECoG analyseres ved hjelp av visuell identifisering av årvåkenhetstilstander og spektralanalyse. Oppsummert tillater denne kombinerte metodologiske tilnærmingen undersøkelse av det nøyaktige bidraget av molekylære komponenter som regulerer nevronal morfologi og tilkobling til regulering av synkronisert hjernebarkaktivitet under våkenhet og søvn.

Etter elektrofysiologiske registreringer brukes immunfluorescens til å definere området som er infisert av AAV-injeksjonen og for å validere uttrykket av cofilinS3D (figur 2). Immunostaining kan utføres ved hjelp av en metodikk som ligner på det som tidligere er beskrevet29,37,38,39. AAV uttrykker en inaktiv form for cofilin smeltet sammen med en hemagglutinin (HA)-Tag (cofilinS3D-HA),som oppdages ved immunfluorescens ved hjelp av et anti-HA-antistoff og et sekundært antistoff (Alexa Fluor 488). De infiserte eksitatoriske nevronene (her, målrettet med et kalsium / calmodulin-avhengig protein kinase II alfa [CamKIIα] promotor som kontrollerer uttrykket av transgene som finnes i AAV) er farget med anti-HA-antistoffet. En vellykket infeksjon er indikert ved farging av nevronene i motor cortex rundt injeksjonsstedet (Figur 2A, B). I dette representative eksemplet viste hjernebarken på den andre halvkule ingen merkbar farging. Likevel, gitt at eksitatoriske nevroner kan projisere til fjerne hjerneområder, er farging i den kontralaterale halvkule ikke nødvendigvis en indikasjon på mislykket injeksjon. Høyere forstørrelse av det infiserte området viste farging av cellelegemer og projeksjoner, noe som bekreftet at bare spesifikke celler i det målrettede kortikale området ble smittet (Figur 2C).
Samtidig farging med markører av eksitatoriske nevroner (f.eks. vesikulær glutamattransportør 1, CaMKIIα) kan også utføres for å validere celletypespesifikkitet. Alternativt kan co-farging med markører av hemmende nevroner eller astrocytter utføres i tilfelle disse cellene er målrettet ved hjelp av forskjellige promotorer. Samtidig farging av cofilinS3D-HA og CaMKIIα ble også utført i samme dyr for et område som var mer bakre for injeksjonsstedet som fortsatt viste anti-HA-flekker i motor cortex (Figur 2D). Det høyere forstørrelsesbildet av området viser celler som tydelig uttrykker cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figur 2E) og CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figur 2F). Superposisjonen av cofilinS3D-HA-og CaMKIIα-fargingen viser at de fleste (om ikke alle) celler som er farget for cofilinS3D-HA, også er positive for CaMKIIα (Figur 2G). Denne observasjonen støtter infeksjonens spesifisitet for eksitatoriske nevroner.
For å vurdere effekten av cofilinmanipulering på ECoG-aktivitet, brukes ECoG- og EMG-signaler til å utføre en visuell identifisering av årvåkenhetstilstander (våkenhet, langsom bølgesøvn, paradoksal søvn). Dette gjøres på 4-s epoker på grunn av den raske endringen i årvåkenhetstilstand i musen2, og her, for en full 24-timers innspilling. Standardanalyser inkluderer beregning av søvnarkitektur og spektralanalysevariabler, som tidligere utført for forskjellige datasett11,12,13,28,34. Spesielt vil spektralanalyse av ECoG-signalet til de ulike statene indeksere tilstandssammensetning og kvalitet. For å fjerne forskjeller som kan oppstå, for eksempel fra forskjellige dybder av elektrodene, kan spektralanalysedata uttrykkes i forhold til den totale kraften til alle tilstander av et gitt dyr (Figur 3A). Gitt den svært lave relative amplituden av ECoG-aktivitet i høyere frekvenser, har relativ kraftspektra for våkenhet, langsom bølgesøvn og paradoksal søvn blitt logg-transformert for å visualisere og samtidig sammenligne aktiviteten i lave og høye frekvenser. Denne analysen indikerer tilstandsspesifikke forskjeller i spektralaktivitet under betingelser for kofilininaktivering (Figur 3B). Nærmere bestemt påpeker disse foreløpige funnene som kombinerer mannlige og kvinnelige mus at cofilininaktivering øker spektralkraften betydelig i raske frekvenser (14-30 Hz) under våkenhet og i langsomme frekvenser (1-4 Hz) under paradoksal søvn, mens du forlater ECoG-aktivitet under langsom søvn hovedsakelig upåvirket. I tillegg synes cofilin inaktivering å øke variasjonen mellom mus i ECoG-aktivitet (spesielt merkbar fra feilfelt for våkenhet i figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Figur 1: Klargjøring av ECoG/EMG montasjekomponenter og representativt eksempel på ECoG-elektrodeplassering. (A) En ECoG-elektrode: En 4 mm lang gulltråd med diameter på 0,2 mm (ikke-isolert) smeltes sammen på hodet til en gulldekket skrue (1,9 mm hodediameter, 1,14 mm tråd stor diameter, 3,6 mm total lengde) ved hjelp av blyfri lodding. (B) EMG-elektroder: To gullledninger (1,5 og 2 cm) er buede for å omfavne kurven på skallen opp til nakkemuskelen, og den andre enden holdes rett for å loddes til kontakten. (C) En 6-kanals kontakt: Blyfri lodding legges til 5 av de 6 metallpinnene (utelater en i midten) på kontakten (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metallpinner). Toppen av kontakten er dekket med tape for å unngå kull/vanninfiltrasjon. (D) Eksempel på plassering av de tre vedlikeholdsskruene på skallen på venstre halvkule og av de tre ECoG-elektrodene (inkludert en referanseelektrode) på høyre halvkule. De nøyaktige stereotaksiske koordinatene til ECoG-elektrodene er angitt i trinn 2.6 og 3.2 og er beregnet i henhold til plasseringen av bregma og lambda (som er indikert av de gule prikkene). Forkortelser: ECoG = elektrokortografisk; EMG = elektromyografisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Figur 2: Representativ immunoppnåelse for å definere det AAV-infiserte området og celletypen. (A) Skjematisk representasjon som viser injeksjonsstedet til koronalstykket presentert i panel B. Posisjonen er 1,1 mm fremre til bregmaen, og kanylen (vist i rødt) var rettet mot lag V av høyre primære motor cortex (M1). Representasjon endret fra Franklin og Paxinos40. (B) Immunostaining av HA for å oppdage cofilinS3D-HA-uttrykkhos nevroner vist for en koronalskive av hele hjernen som ligger ca. 1,1 mm fremre til bregmaen. Det infiserte området lokaliserer hovedsakelig til lag V og VI (infrarøde lag) av høyre primære og sekundære motorkortikaler (M1 og M2). Skalastang = 500 μm. Firkanten representerer området vist i C. (C) Høyere forstørrelse av det infiserte området som viser farging av infiserte celler og bekrefter uttrykk for cofilinS3D-HAi dypere lag av motor cortex. Skalastang = 100 μm. (D) Samtidig immunisering av HA og CaMKIIα for å vurdere celletypespesifikkitet vist for en koronalskive på høyre halvkule som ligger ca. 0,5 mm fremre til bregma og derfor bakre til injeksjonsstedet (samme mus som i panel B og C). Det infiserte området lokaliserer til motorkortikaler (M1 og hovedsakelig M2). Skalastang = 500 μm. Firkanten representerer området som vises i E, F og G. (E) Høyere forstørrelse av det infiserte området som viser farging av infiserte celler og bekrefter uttrykk for cofilinS3D-HA. Skalastang = 100 μm. (F) Høyere forstørrelse av det infiserte området som viser farging av CaMKIIα-positive celler. Skalastang = 100 μm. (G) Høyere forstørrelse av det infiserte området som viser komerking av cofilinS3D-HA og CaMKIIα, som bekrefter at infiserte celler er CaMKIIα-positive. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; M1 = primær motor cortex; M2 = sekundær motor cortex; CPu = caudate putamen (striatum); LV = lateral ventrikel; HA = hemagglutinin; CamKIIα = kalsium/calmodulin-avhengig protein kinase II alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Figur 3: Representativ kraftspektra for våkenhet, langsom bølgesøvn og paradoksal søvn oppnådd etter viral manipulering av cofilinfunksjon. Hann (n = 5 per gruppe) og hunn (n = 2 per gruppe) mus injisert med AAV9-CaMKIIα0,4-cofilinS3D-HA(viral titer 2,58 × 1013 GC/ml) eller med kontroll AAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1,25 ×10 13 GC/ml; halvparten av testtitren for å kontrollere for det forbedrede signalet til denne kontrollen AAV) i lag V av motor cortex ble registrert i 24 timer, og det elektrokortikografiske signalet ble utsatt for spektralanalyse (rask Fourier Transform for å beregne spektralkraft mellom 0,5 og 30 Hz med en oppløsning på 0,25 Hz). (A) Strømspektra under de tre årvåkenhetstilstandene uttrykt i forhold til total kraft i alle stater. (B) Relativ strømspektralogg forvandlet til mer tilstrekkelig representerer gruppeforskjeller i høyere frekvenser. Undertrykkelsen av cofilinaktivitet i motor cortex ved hjelp av AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA øker elektrokortikografisk aktivitet i betaområdet (14-30 Hz) under våkenhet, og i deltaområdet (1-4 Hz) under paradoksal søvn sammenlignet med kontrollinjeksjoner (røde linjer over x akser indikerer Mann-Whitney U-test på frekvensbåndseffekt p < 0,05). Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus GC = genomkopier; HA = hemagglutinin; CamKIIα = kalsium/calmodulin-avhengig protein kinase II alfa; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Denne artikkelen beskriver en protokoll for manipulering av molekylære mål i hjernebarken ved hjelp av adeno-tilknyttede virus og for å overvåke effekten av denne manipulasjonen under våkenhet og søvn ved hjelp av elektrokortikografiske opptak.

Elektrokortikografisk opptak av hjernebarkområder manipulert ved hjelp av et adeno-assosiert virus rettet mot cofilin hos mus

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Denne protokollen kan brukes til å identifisere rollen til spesifikke individuelle molekylære mål i reguleringen av elektrokortikografisk aktivitet under forskjellige Vigilin-tilstander. Blant fordelene ved å bruke adeno-assosiert virus er evnen til å målrette nøyaktig mot en gitt hjerneregion og en bestemt celletype. Julien Dufort-Gervais, en forskningsmedarbeider fra teamet mitt, demonstrerer protokollen.Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme refleks i en bedøvet 12 uker gammel mus, bruk en hårtrimmer for å barbere håret fra baksiden av ørene til forsiden av hodet mellom øynene. Legg til en sjenerøs dråpe oftalmisk salve til hvert øye for å forhindre dehydrering og bruk ørestengene til å feste musens hode forsiktig på et stereotaxisk apparat. Trekk tungen forsiktig ut av munnen for å unngå kvelning.Fest musens nese til apparatet og bruk 70% etanol for å sterilisere den eksponerte huden på hodet. Hold huden med ekstra fine Graefe tang, bruk vev saks for å kutte huden fra bunnen av ørene til nivået av øynene og plassere to kirurgiske klemmer på hver side av snittet for å strekke huden og for å eksponere skallen. Unngå hjernesuging, bruk en saksespiss for å skrape skalleoverflaten for å fjerne periosteumet og for å lage overlappende striper i to eller flere retninger.Bruk 70% etanol for å fjerne beinfragmentene og desinfisere skallen. Med en tidligere forberedt kanyle festet til den stereotaktiske armen, identifiser plasseringen av bregma og lambda og noter stereotaxiske koordinater for hver. Bruk den stereotaktiske armen og en penn for å markere kanylens posisjon på skallen 1,5 millimeter lateral rett til midtlinjen og 1,5 millimeter fremre til bregmaen.Bruk en 0,7 millimeter bor, gjennombor skallen forsiktig i den markerte posisjonen vinkelrett på skalleoverflaten og på linje med den vertikale aksen og vask skallen med en steril bomullsspiss gjennomvåt i en 10% betadine povidon jodoppløsning, og trekk deretter stempelet til en 10 mikrolitersprøyte med en mikroliter for å laste kanylen med en mikroliter luftboble. Bland deretter AAV-blandingen av interesse med langsom pipettering og tilsett 1,7 mikroliter av blandingen til en steril Petri-tallerken. Bruk denne sprøyten til å laste 1,5 mikroliter av oppløsningen inn i kanylen og markere posisjonen til luftboblen på det tilkoblede PE50-røret.Juster kanylen vertikalt med hullet i skallen slik at kanylen når den øvre kanten av beinet og markerer Z-koordinaten til skalleoverflaten. Senk kanylen langsomt til spissen når 1,5 millimeter under skalleoverflaten og lag fem av motor cortex og start sprøytepumpen med en 0,025 mikroliter per minutt strømningshastighet for å levere en mikroliter AAV over 40 minutter. Bruk luftboblen i røret til å spore injeksjonen, og gjør eventuelle justeringer etter behov.Når hele volumet av virus er levert, la kanylen være på plass i fem minutter for å sikre tilstrekkelig diffusjon og for å unngå tilbakestrømning før du sakte og forsiktig løfter den stereotaxiske armen for å fjerne kanylen fra cortex. For elektrodeimplantasjon, bruk rette Kelly-tang for sakte å skru en elektrokortikografisk elektrode med en rett gulltråd inn i den vertikale aksen i hullet der AAV ble injisert, og la minst 2,5 millimeter skrue utenfor skallen for å minimere skaden på dura og hjernebarken. Bruk en penn til å markere posisjonen til referanseelektroden 2,6 millimeter lateral høyre til midtlinjen og 0,7 millimeter bakre til bregma og posisjonen til den bakre elektrokardiografiske elektroden ved 1,5 millimeter lateral høyre til midtlinjen og 1,5 millimeter fremre til lambda og posisjonene til tre vedlikeholdsskruer på venstre halvkule uten spesifikke koordinater, så fjernt som mulig fra hverandre og fra de elektrokortikografiske elektrodene.Bruk boret til å gjennombore skallen forsiktig vinkelrett på skalleoverflaten i de markerte posisjonene til de andre elektrodene og skruene og vask den gjennomborede skallen med en 10% povidon jodoppløsning. Blokker hullene med små valsede biter av delikat oppgaveserviett før du installerer skruene for å forhindre blødning og forurensning, og bruk rette Kelly-tang for å sette skruene inn i borehullene i samme vinkel som hullene ble gjennomboret. Legg noen små dråper tannsement i midten av det ringlignende rommet inne i skruene og bruk ekstra fine Graefe tang for å løfte huden over nakkemuskulaturen.Bruk Dumont nummer fem tang, hold den buede ekstremiteten til en elektromyografisk elektrode og sett den omtrent en til to millimeter inn i musklene. Plasser elektrodens buede side og foldepunkt inn i tannsementen og sett inn den andre elektromyografiske elektroden på samme måte. Etter å ha dekket dyrets øyne, bruk lys i tre til fem minutter for å størkne sementen og bruk ekstra tannsement for å dekke bunnen av de elektrokortikografiske elektrodene og ankerskruene for å danne en kroneformet kontur.Etter å ha påført tre til fem minutter med lys, fyll midten av montasjen med akryl sement og fjern de kirurgiske klemmene. Bruk en syntetisk absorberbar monofilament sutur for å lukke huden foran og bak på montasjen slik at skallen ikke blir eksponert og bruk buede tang for å holde kontakten over montasjen for å justere gullledningene på elektrodene forsiktig med kontaktpinnene, og lodd deretter raskt hver elektrode ekstremitet til en enkelt tilsvarende kontaktpinne. Etter å ha fjernet musen fra rammen, dekk det tomme rommet mellom kontakten og hodet med akrylsementen.Og etter veiing, plasser musen i et rent bur med et ikke-maskert lokk på en varmepute. To uker etter operasjonen kobler du musene til opptakskabler og minst en uke senere registrerer du elektrokortikografiske og elektromyografiske signaler i 24 timer eller mer. En vellykket infeksjon bekreftes av HA-farging av nevronene i motor cortex rundt injeksjonsstedet, noe som indikerer tilstedeværelsen av cofilin S3D HA. Samtidig farging med den eksitatoriske nevronmarkøren CaMKII alfa indikerer klar cofilin S3D HA og CaMKII alfa co-uttrykk under høy forstørrelse.Logg transformert relativ kraftspektra for våkenhet, langsom bølgesøvn og paradoksal søvn viser tilstandsspesifikke forskjeller i spektralaktivitet under cofilin-inaktivering. Kombinasjonen av elektrokortikografisk opptak og AAV-mediert manipulering av presise molekylære mål gjelder også for flere hjerneregioner og andre nevrovitenskapelige underfelt som forskning på epilepsi eller minne i tillegg til søvn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte intratekal injeksjon av rekombinant Adeno-assosiert virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...