Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Работа финансировалась Канадской исследовательской кафедрой молекулярной физиологии сна. Авторы благодарны Хлое Провост и Кэролайн Бушар за техническую помощь.

Авторам нечего раскрывать.

Этот протокол описывает точный и простой метод мониторинга активности ECoG и EMG во время манипулирования молекулярными мишенями с использованием AAV. Для адекватного сравнения между группами настоятельно рекомендуется всегда планировать хирургические процедуры (инъекция AAV и имплантация электродов) в один и тот же день для подопытных и контрольных животных и одновременно записывать их электрофизиологические сигналы. Для получения аналогичной вирусной экспрессии между искомым и контрольными животными желательно вводить один и тот же вирусный титр. В настоящем случае вирусный титр контрольного AAV был снижен до половины тестового AAV для обеспечения аналогичной вирусной экспрессии. Экспериментаторы должны быть очень осторожны с измерениями стереотаксических координат, чтобы обеспечить низкую изменчивость между животными в нацеливаниях на область мозга / кортикальный слой. Кроме того, учитывая, что глубина инъекции рассчитывается по поверхности черепа и что толщина черепа варьируется в зависимости от возраста и пола, размещение канюли всегда должно быть проверено с использованием постпротоколя гистологии или иммуногистохимии (например, рисунок 2),чтобы обеспечить адекватное позиционирование / глубину инъекции, и стереотаксические координаты должны быть скорректированы при необходимости. В течение 40-минутного впрыска AAV очень важно контролировать скорость впрыска, чтобы быстро обнаружить и исправить потенциальные проблемы, такие как засорение насоса. Некоторые экспериментальные этапы также имеют решающее значение для получения оптимальных электрофизиологических сигналов. Например, не переворачивайте во время имплантации электрода; винты должны торчать из черепа не менее чем на 2,5 мм, чтобы свести к минимуму повреждение коры головного мозга и образование глиального рубца. После этого также чрезвычайно важно: i) избегать нанесения цемента на конечности электродов, ii) обеспечить быструю пайку электродов к разъему и iii) убедиться, что между электродами нет контакта.
Процедура, представленная здесь для записи ECoG и EMG, чрезвычайно хорошо зарекомендовала себя, проста и широко используется для мониторинга бодрствования и сна у мышей2,11,13,34. Непрерывные записи ECoG и EMG могут выполняться в течение нескольких последовательных дней (и даже недель) и генерировать очень богатый набор данных, который можно использовать для выполнения нескольких линий анализа, включающих переменные, связанные с бодрствованием и количеством сна и архитектурой2,11,12 (например, время, проведенное в разных состояниях на светлый и темный периоды, количество эпизодов каждого состояния, 24-ч распределение сна), бодрствование и спектральное содержание сна34,41 (например, мощность в различных полосах частот [аналогично рисунку 3],бесмасштабная активность) и характеристики отдельных волн42,43,44 (например, амплитуда медленных волн и наклон). При использовании в сочетании с AAV-опосредованными молекулярными манипуляциями дополнительным преимуществом является избежание потенциальной компенсации развития, которая может произойти у трансгенных животных. С практикой вся процедура, включая 40-минутную инъекцию AAV, может быть выполнена примерно за 90 минут. Уровень смертности должен быть (очень) низким, так как операция является минимально инвазивной.
Одновременное использование записи ECoG/EMG и целевых манипуляций с AAV предлагает множество других преимуществ и применений. Например, точность стереотаксического таргетирования, при адекватном выполнении, очень высока и воспроизводима и полезна для определения конкретной роли данной области мозга (и/или типа клетки или молекулярного элемента в области) в регуляции сна или других физиологических процессов. Таким образом, несколько различных областей коры могут быть легко нацелены с использованием адаптаций текущего протокола. Кроме того, целевые манипуляции с использованием AAV могут быть направлены на кортиковую / подкорковую область, отличавшуюся от сайтов записи ECoG. В таких случаях отверстие заусенца для инъекции AAV может быть закрыто небольшим стеклянным покровным листом, закрепленным с помощью зубного цемента (или костного воска). Для повышения специфичности конструкция AAV часто включает в себя промотор, который позволяет целенаправленное инфицирование точного типа клеток14. Промотор CamKIIα был использован в настоящем протоколе для лечения возбуждающих пирамидальных клеток14,29,45моторной коры. Эта стратегия позволила инактивировать кофилин (с использованием кофилинаS3D)32,33 в возбуждающих нейронах моторной коры и наблюдать специфические для состояния изменения активности ECoG(рисунок 3). Для оценки эффективности инфекции /трансдукции будущие пользователи протокола могут объединить представленный протокол AAV-ECoG с протоколом совместного окрашивания иммунофлуоресценцией и использовать изображения с высоким увеличением для расчета количества клеток, показывающих двойную маркировку из общего числа клеток, показывающих одинарную маркировку мишени (здесь CaMKIIα-экспрессирующие нейроны). В недавнем исследовании метод AAV-ECoG, аналогичный описанной здесь, был использован для сверхэкспрессии хрупкого белка 1, связанного с синдромом умственной отсталости X (FXR1), во всех нейронах моторной коры с использованием AAV, содержащего промотор синапсина, и выявил влияние этой манипуляции на распределение состояния бдительности и спектральное содержание28. Эти результаты иллюстрируют, как манипулирование данной молекулой в целевой области мозга с использованием AAV может выявить роли в регуляции конкретных параметров бодрствования / сна.
Ограничением описанного протокола является небольшое поражение мозговой ткани, происходящее при размещении канюли перед выполнением инъекции AAV, которое также может сопровождаться воспалительной реакцией. Это может вызывать особую озабоченность при выполнении инъекций AAV в подкорковые области и всегда должно решаться с помощью адекватных элементов управления. Альтернативно, за текущим протоколом может последовать количественная оценка реактивного глиоза и/или активации микроглии (например, с использованием иммунофлуоресценции) для обеспечения аналогичных уровней в контрольной и тестовой группах и, следовательно, в показаниях ECoG. Второе ограничение связано с риском плохого соединения между электродом и разъемом, что может привести к непрерывному или иногда плохому электрофизиологическому сигналу. Прочно привинченные, спаянные и цементированные электроды сведут к минимуму возникновение этой проблемы. Третье ограничение связано с тем, что животные привязываются через монтаж головы во время записи, что может ограничить передвижение и другое поведение, по крайней мере, в некоторой степени, и иногда приводить к повреждению кабелей и потере сигнала. Наконец, представленный протокол больше подходит для взрослых мышей, учитывая, что размер черепа более молодых животных может вызвать трудности при установке изображенного монтажа головы, как описаноранее 2.
Комбинированная запись ECoG / EMG и AAV-опосредованная манипуляция точной мишенью также применимы к областям исследований, отличных от нейробиологии сна. Среди прочего, он может быть использован для изучения и манипулирования эпилептическими событиями на животных моделях судорог и является мощным инструментом для модуляции колебаний мозга, участвующих в кодировании и консолидации памяти46,47. Соответственно, потенциальные приложения, безусловно, охватывают области фундаментальных исследований в психиатрии и неврологии, включая нейродегенеративные заболевания. В дополнение к способности экспрессировать неактивную форму молекулы, AAV могут и использовались для сверхэкспрессии или понижения регуляции (например, малоинтерферирующей РНК, CRISPR / Cas9) или для спасения экспрессии молекулы в ко всего тела. Важно отметить, что двойная методология текущего протокола также применима к другим видам млекопитающих, таким как крысы и суточные грызуны, которые представляют собой интересные модели для понимания как сна, так и нейродегенерации48,49.

Электроэнцефалографические (или, как правило, электрокортикографические [ECoG] у грызунов) и электромиографические (ЭМГ) записи широко используются в исследованиях сна, а также в более широком смысле в неврологии, неврологии и психиатрии. В совокупности эти электрофизиологические сигналы позволяют идентифицировать состояния бдительности и последующую количественную оценку длительности состояния и спектрального состава, как у человека, так и у грызунов1,2,3,4. Такая количественная оценка была полезна для понимания того, как сон модифицируется при патологических состояниях, таких как нейродегенеративные заболевания и модели5,6,7 или путем генетической модификации8,9. Например, было показано, что нокаут (KO) различных генов, связанных с нейронной связью, изменяет продолжительность бодрствования и сна как умыши,так и у плодовой мухи10,11,12,13. Чтобы справиться с потенциальной компенсацией развития, возникающей в результате изучения нокаута всего тела у грызунов, и обеспечить более тонкий контроль генетических манипуляций, эффективным способом манипулирования экспрессией генов является использование аденоациациированных вирусов (AAV). Генетическая манипуляция, опосредованная AAV, может быть использована для понижения или повышения регуляции данной молекулярной мишени и ограничения манипуляции определенной клеточной популяцией с использованием различных типов промоторов14. AAV также широко используются в качестве метода доставки в кластеризованных регулярно чередуемых коротких палиндромных повторах (CRISPR)/Cas9 технологии15,16. Эти методологии позволяют улучшить временной и пространственный контроль генетических манипуляций, что, как правило, связано с экспрессией репортера, позволяющего количественно оценить зараженную область с использованием иммунофлуоресценции.
AAV также представляют собой основной вектор для специфических для типа клеток манипуляций нейронной активностью с помощью оптогенетики и хемогенетики17,18,19,которые широко использовались в последних исследованиях нейродегенеративных заболеваний, поведения, познания и сна20,21,22. В исследованиях сна применение оптогенетики для активации или ингибирования определенных областей мозга, таких как базальный передний мозг, гипоталамус и сублатеродорзальный тегментум, было полезно для определения их роли в контроле возбуждения, медленного сна (также известного как сон без быстрого движения глаз), парадоксального сна (или быстрого сна движения глаз) и катаплексии23, 24,25. Кроме того, манипуляции, опосредованные AAV, помогли прояснить важные регуляторные цепи сна и молекулы, способствующие неблагоприятным последствиям потери сна26,27,28. Например, одним из белков, который, как было показано, участвует в ухудшении памяти, вызванном лишениемсна,является кофилин29,30. Этот белок представляет собой нитевидный актин-разрывающий белок, который участвует в реорганизации актиновых нитей путем физического связывания с актином и содействия разборке нитей динамическим образом31. Было показано, что ингибирование активности кофилина с использованием AAV-опосредованного подхода предотвращает потерю позвоночника, а также синаптическую пластичность и дефицит памяти, вызванные лишением сна у мышей29. В совокупности эти исследования подчеркивают полезность и актуальность манипуляций, опосредованных AAV, для понимания регуляции сна и последствий лишения сна у грызунов.
Здесь описан протокол, который сочетает имплантацию электродов ECoG и EMG с манипуляцией функцией кофилина в области коры головного мозга мышей дикого типа (WT) с использованием AAV. Точнее, в моторную кору вводится AAV (серотип 9), экспрессирующий кодировую последовательность фосфомиметической формы мышиного кофилина (cofilinS3D),делающий его неактивным32,33. Электрод ECoG имплантируется непосредственно в место инъекции для обеспечения регистрации синхронизированной кортикальной активности инфицированных клеток. Запись ECoG/EMG проводится в течение 24 ч в ненарушенном состоянии через три недели после операции, чтобы обеспечить восстановление, адаптацию и экспрессиюS3D с высоким содержанием кофилина. Затем запись используется для идентификации состояний бдительности и спектрального анализа ECoG, как описано в предыдущих исследованиях11,34. Эта методология может конкретно показать, как кортикальный кофилин модулирует сигналы ECoG бодрствования и сна у мышей. Эта комбинация электрофизиологических записей и генетических манипуляций, опосредованных AAV, особенно актуальна для исследования роли различных молекулярных элементов в конкретных функциях мозга и может быть применена к кортикальной (и подкорковой) области (областям) мозга, представляющим интерес у WT и генетически модифицированных мышей обоих полов и даже других видов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Использование электрокортикографических (ECoG) записей у грызунов имеет отношение к исследованиям сна и изучению широкого спектра неврологических состояний. Аденоассоциациированные вирусы (AAV) все чаще используются для улучшения понимания мозговых цепей и их функций. AAV-опосредованное манипулирование конкретными клеточными популяциями и / или точными молекулярными компонентами было чрезвычайно полезным для выявления новых регуляторных цепей / молекул сна и ключевых белков, способствующих неблагоприятным последствиям потери сна. Например, ингибирование активности нителезного актин-разрывающего белка кофилина с использованием AAV предотвращает ухудшение памяти, вызванное лишением сна. Здесь описан протокол, который сочетает в себе манипуляции функцией кофилина в области коры головного мозга с записью активности ECoG, чтобы изучить, модулирует ли кортикальный кофилин сигналы ECoG бодрствования и сна. Инъекция AAV выполняется во время той же хирургической процедуры, что и имплантация ECoG и электромиографических (EMG) электродов у взрослых самцов и самок мышей. Мышей обезболивают, а их головы бреют. После чистки кожи и разреза определяют стереотаксические координаты моторной коры, и в этом месте прокалывают череп. Канюля, предварительно заполненная AAV-экспрессирующим кофилиномS3D,неактивной формой кофилина, медленно позиционируется в кортикальной ткани. После инфузии AAV покрытые золотом винты (электроды ECoG) прокручиваются через череп и цементируются к черепу золотыми проводами, вставленными в мышцы шеи (электроды ЭМГ). Животным предоставляется три недели для восстановления и обеспечения достаточной экспрессии кофилинаS3D. Инфицированная область и тип клеток проверяются с помощью иммуногистохимии, а ECoG анализируется с использованием визуальной идентификации состояний бдительности и спектрального анализа. Таким образом, этот комбинированный методологический подход позволяет исследуть точный вклад молекулярных компонентов, регулирующих морфологию нейронов и связность, в регуляцию синхронизированной активности коры головного мозга во время бодрствования и сна.

После электрофизиологических записей иммунофлуоресценция используется для определения области, инфицированной инъекцией AAV, и для проверки экспрессии кофилинаS3D (рисунок 2). Иммуноокрашивание может быть выполнено с использованием методики, аналогичной той, что была описанаранее 29,37,38,39. AAV экспрессирует неактивную форму кофилина, слитую с гемагглютинином (HA)-Tag (кофилинS3D-HA),которая обнаруживается иммунофлуоресценцией с использованием антитела против ГК и вторичного антитела (Alexa Fluor 488). Инфицированные возбуждающие нейроны (здесь, нацеленные на кальций/кальмодулин-зависимую протеинкиназу II альфа [CamKIIα] промотор, контролирующий экспрессию трансгена, содержащегося в AAV) окрашивают антителом против ГК. На успешную инфекцию указывает окрашивание нейронов в моторной коре, окружающей место инъекции(рисунок 2A,B). В этом репрезентативном примере кора головного мозга другого полушария не показала какого-либо заметного окрашивания. Тем не менее, учитывая, что возбуждающие нейроны могут проецироваться на отдаленные области мозга, окрашивание в контралатеральном полушарии не обязательно является признаком неудачной инъекции. Более высокое увеличение инфицированной области показало окрашивание клеточных тел и проекций, подтверждая, что были инфицированы только специфические клетки целевой области коры(рисунок 2C).
Совместное окрашивание маркерами возбуждающих нейронов (например, везикулярным транспортером глутамата 1, CaMKIIα) также может быть выполнено для проверки типоспецифичности клеток. Альтернативно, совместное окрашивание маркерами тормозных нейронов или астроцитов может быть выполнено в случае, если эти клетки нацелены с использованием различных промотеров. Совместное окрашивание кофилинаS3D-HAи CaMKIIα также проводилось у того же животного для области, более постороннее места инъекции, которая все еще показывала окрашивание анти-ГК в моторной коре(рисунок 2D). На изображении области с более высоким увеличением показаны клетки, четко экспрессивающие кофилинS3D-HA(Alexa Fluor 488, рисунок 2E)и CaMKIIα (Alexa Fluor 568, рисунок 2F). Суперпозиция окрашивания кофилиномS3D-HAи CaMKIIα показывает, что большинство (если не все) клеток, окрашенных для кофилинаS3D-HA,также положительны для CaMKIIα(рисунок 2G). Это наблюдение подтверждает специфичность инфекции для возбуждающих нейронов.
Для оценки влияния манипуляций с кофилином на активность ECoG используются сигналы ECoG и EMG для выполнения визуальной идентификации состояний бдительности (бодрствование, медленный сон, парадоксальный сон). Делается это на 4-х эпохах из-за быстрой смены состояния бдительности у мыши2,а здесь, для полноценной 24-х ч записи. Стандартные анализы включают вычисление архитектуры сна и переменных спектрального анализа, как проводилось ранее для различных наборов данных11,12,13,28,34. В частности, спектральный анализ ECoG сигнала различных состояний будет индексировать состав и качество состояния. Чтобы устранить различия, которые могли возникнуть, например, из разных глубин электродов, данные спектрального анализа могут быть выражены относительно общей мощности всех состояний данного животного(рисунок 3А). Учитывая очень низкую относительную амплитуду активности ECoG на более высоких частотах, спектры относительной мощности для бодрствования, медленного сна и парадоксального сна были преобразованы для более адекватной визуализации и одновременного сравнения активности на низких и высоких частотах. Данный анализ указывает на специфические для состояния различия в спектральной активности в условиях инактивации кофилина(рисунок 3В). Точнее, эти предварительные результаты, объединяющие самцов и самок мышей, указывают на то, что инактивация кофилина значительно увеличивает спектральную мощность на быстрых частотах (14-30 Гц) во время бодрствования и на медленных частотах (1-4 Гц) во время парадоксального сна, оставляя активность ECoG во время медленного сна в основном незатронутой. Кроме того, инактивация кофилина, по-видимому, увеличивает вариабельность активности ECoG между мышами (особенно заметно из полос ошибок для бодрствования на рисунке 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Рисунок 1:Подготовка монтажных компонентов ECoG/EMG и репрезентативный пример размещения электродов ECoG. (A)Электрод ECoG: золотая проволока длиной 4 мм, диаметром 0,2 мм (неизолированная) сплавлена на головке позолоченный винт (диаметр головки 1,9 мм, основной диаметр резьбы 1,14 мм, общая длина 3,6 мм) с использованием бессвинцового припоя. (B)Электроды ЭМГ: два золотых провода (1,5 и 2 см) изогнуты, чтобы охватить изгиб черепа до мышцы шеи, а другой конец держится прямо, чтобы быть припаянным к разъему. (C)6-канальный разъем: бессвинцовый припой добавляется к 5 из 6 металлических контактов (исключая один посередине) разъема (5 мм x 8 мм x 8 мм + 3 мм металлические контакты). Верхняя часть разъема покрыта лентой, чтобы избежать проникновения мусора / воды. (D)Пример позиционирования трех поддерживающие винты на черепе левого полушария и трех электродов ECoG (включая электрод отсчета) на правом полушарии. Точные стереотаксические координаты электродов ECoG указаны на шагах 2.6 и 3.2 и рассчитаны в соответствии с местоположением брегмы и лямбды (которые обозначены желтыми точками). Сокращения: ECoG = электрокортикографическая; ЭМГ = электромиографическая. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Рисунок 2:Репрезентативное иммуноокрашивание для определения AAV-инфицированной области и типа клеток. (A)Схематическое изображение, показывающее место инъекции коронального среза, представленное на панели B. Положение составляет 1,1 мм к брегме, а канюля (показана красным цветом) была нацелена на слои V правой первичной моторной коры (M1). Представление изменено из Franklin and Paxinos40. (B)Иммуноокрашивание ГК для обнаружения экспрессии кофилинаS3D-HAв нейронах, показанное для коронального среза полного мозга, расположенного примерно на 1,1 мм перед брегмой. Зараженная область в основном локализуется в слоях V и VI (инфрагранулярные слои) правой первичной и вторичной двигательной коры (М1 и М2). Шкала бара = 500 мкм. Квадрат представляет собой площадь, показанную в C. (C) Более высокое увеличение инфицированной области, показывающее окрашивание инфицированных клеток и подтверждающее экспрессию кофилинаS3D-HAв более глубоких слоях моторной коры. Шкала bar = 100 мкм.(D)Коиммуноразражание ГК и CaMKIIα для оценки типоспецифичности клеток, показанных для коронального среза правого полушария, расположенного примерно на 0,5 мм к брегме и, следовательно, позадней части места инъекции (та же мышь, что и на панелях B и C). Зараженная область локализуется в двигательной коре (М1 и в основном М2). Шкала бара = 500 мкм. Квадрат представляет собой площадь, показанную в E, F и G. (E)Более высокое увеличение инфицированной области, показывающее окрашивание инфицированных клеток и подтверждающее экспрессию кофилинаS3D-HA. Шкала бара = 100 мкм. (F) Более высокое увеличение инфицированной области, показывающее окрашивание CaMKIIα-положительных клеток. Шкала бара = 100 мкм.(G)Более высокое увеличение инфицированной области показывает ко-маркировку кофилинаS3D-HAи CaMKIIα, подтверждая, что инфицированные клетки являются CaMKIIα-положительными. Шкала бара = 100 мкм. Сокращения: AAV = аденоациированный вирус; M1 = первичная моторная кора; M2 = вторичная моторная кора; CPu = хвостатое путамен (полосатое тело); LV = боковой желудочек; HA= гемагглютинин; CamKIIα = кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II альфа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Рисунок 3:Репрезентативные спектры мощности для бодрствования, медленного сна и парадоксального сна, полученные после вирусных манипуляций с функцией кофилина. Самцов (n = 5 на группу) и самок (n= 2 на группу) мышей, вводимых с AAV 9-CaMKIIα0.4-кофилиномS3D-HA(вирусный титр 2,58 ×10 13 ГК/мл) или с контрольным AAV (AAV 9-CaMKIIα0.4-eGFP 1,25 × 1013 ГК/мл; половина титра теста для контроля усиленного сигнала этого контрольного AAV) в слое V моторной коры регистрировали в течение 24 ч, а электрокортикографический сигнал подвергали спектральному анализу (быстрое преобразование Фурье для расчета спектральной мощности от 0,5 до 30 Гц с разрешением 0,25 Гц). (A)Спектры мощности во время трех состояний бдительности, выраженные относительно общей мощности всех состояний. (B)Относительная мощность спектров логарифмической трансформации для более адекватного представления групповых различий на более высоких частотах. Подавление активности кофилина в моторной коре с помощью AAV 9-CaMKIIα0.4-кофилинаS3D-HAзначительно повышает электрокортикографическую активность в бета-диапазоне (14-30 Гц) во время бодрствования и в дельта-диапазоне (1-4 Гц) во время парадоксального сна по сравнению с контрольными инъекциями (красные линии над осями x указывают на Mann-Whitney U-testна частотный диапазон мощности p < 0,05). Сокращения: AAV = аденоассоциированный вирус GC = копии генома; HA= гемагглютинин; CamKIIα = кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II альфа; eGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

В данной статье описан протокол манипуляции молекулярными мишенями в коре головного мозга с использованием аденоассоциированных вирусов и для мониторинга последствий этой манипуляции во время бодрствования и сна с помощью электрокортикографических записей.

Электрокортикографическая запись областей коры головного мозга, манипулируемых с использованием аденоассоциированного вируса, нацеленного на кофилин у мышей

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Этот протокол может быть использован для выявления роли конкретных отдельных молекулярных мишеней в регуляции электрокортикографической активности при различных вигилиновых состояниях. Среди преимуществ использования аденоациированного вируса — способность точно нацеливаться на данную область мозга и определенный тип клеток. Демонстрировать протокол будет Жюльен Дюфор-Жерве, научный сотрудник моей команды.После подтверждения отсутствия реакции на рефлекс защемления ног у анестезируемой 12-недельной мыши, используйте триммер для волос, чтобы сбрить волосы от задней части ушей до передней части головы между глазами. Добавьте щедрую каплю офтальмологической мази на каждый глаз, чтобы предотвратить обезвоживание, и используйте ушные вкладыши, чтобы аккуратно закрепить головку мыши на стереотаксическом аппарате. Осторожно вытяните язык изо рта, чтобы избежать удушья.Закрепите нос мыши к аппарату и используйте 70% этанол для стерилизации открытой кожи на голове. Удерживая кожу сверхтонкими щипцами Graefe, используйте тканевые ножницы, чтобы разрезать кожу от основания ушей до уровня глаз и поместите два хирургических зажима на каждую сторону разреза, чтобы растянуть кожу и обнажить череп. Избегая мозговых швов, используйте наконечник ножниц, чтобы поцарапать поверхность черепа, чтобы удалить надкостницу и создать перекрывающиеся полосы в двух или более направлениях.Используйте 70% этанол для удаления фрагментов костей и дезинфекции черепа. С помощью предварительно подготовленной канюли, прикрепленной к стереотаксическому плечу, определите местоположение брегмы и лямбды и запишите стереотаксические координаты каждого из них. Используйте стереотаксическую руку и ручку, чтобы отметить положение канюли на черепе 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра с передней стороны до брегмы.Используя 0,7-миллиметровое сверло, аккуратно проткните череп в отмеченном положении перпендикулярно поверхности черепа и выровняйте вертикальную ось и промойте череп стерильным хлопковым наконечником, пропитанным 10%-ным раствором бетадина повидона йода, затем втягивайте поршень 10-микролитрового шприца на один микролитр, чтобы загрузить канюлю одним микролитром воздушного пузыря. Затем смешайте интересующую смесь AAV с медленным пипетированием и добавьте 1,7 микролитра смеси в стерильную чашку Петри. С помощью этого шприца загрузите 1,5 микролитра раствора в канюлю и отметьте положение пузырька воздуха на подключенной трубке PE50.Вертикально выровняйте канюлю с отверстием в черепе так, чтобы канюля достигла верхнего края кости и отметьте Z-координату поверхности черепа. Медленно опустите канюлю, пока кончик не достигнет 1,5 миллиметра ниже поверхности черепа и пятого слоя моторной коры и запустите шприцевую насос со скоростью потока 0,025 микролитра в минуту, чтобы доставить один микролитр AAV в течение 40 минут. Используйте воздушный пузырь в трубке для отслеживания впрыска, внося необходимые коррективы.Когда весь объем вируса будет доставлен, оставьте канюлю на месте в течение пяти минут, чтобы обеспечить достаточную диффузию и избежать обратного потока, прежде чем медленно и осторожно поднимать стереотаксическую руку, чтобы удалить канюлю из коры. Для имплантации электрода используйте прямые щипцы Келли, чтобы медленно вкрутить один электрокортикографический электрод с прямой золотой проволокой в вертикальную ось отверстия, в которое был введен AAV, оставив не менее 2,5 миллиметров винта за пределами черепа, чтобы свести к минимуму повреждение твердой мозговой оболочки и коры головного мозга. Используйте перо для обозначения положения опорного электрода 2,6 мм поперечно справа от средней линии и 0,7 миллиметра с задней стороны до брегмы и положения заднего электрокардиографического электрода на 1,5 миллиметра латерально справа от средней линии и 1,5 миллиметра к передней части к лямбде и положения трех шнеков обслуживания на левом полушарии без конкретных координат, но как можно более удаленными друг от друга и от электрокортикографических электродов.Используйте дрель, чтобы аккуратно проткнуть череп перпендикулярно поверхности черепа в отмеченных положениях других электродов и винтов и промыть проколотый череп 10%-ным раствором повидона йода. Заблокируйте отверстия небольшими свернутыми кусочками деликатной задачи протрите перед установкой винтов, чтобы предотвратить кровотечение и загрязнение, и используйте прямые щипцы Келли, чтобы вставить винты в отверстия сверла под тем же углом, под которым были пробиты отверстия. Поместите несколько небольших капель зубного цемента в центр кольцеобразного пространства внутри винтов и используйте сверхтонкие щипцы Graefe, чтобы поднять кожу над мышцами шеи.Используя щипцы Дюмона номер пять, удерживайте изогнутую конечность одного электромиографического электрода и вставляйте его примерно на один-два миллиметра в мышцы. Поместите изогнутую сторону и точку складывания электрода в зубной цемент и вставьте второй электромиографический электрод таким же образом. После покрытия глаз животного нанесите свет на три-пять минут, чтобы затвердеть цемент и используйте дополнительный зубной цемент для покрытия основания электрокортикографических электродов и анкерных винтов для формирования короновидного контура.После нанесения еще трех-пяти минут света заполните центр монтажа акриловым цементом и снимите хирургические зажимы. Используйте синтетический рассасывающиеся монофиламентные швы, чтобы закрыть кожу спереди и сзади монтажа, чтобы череп не подвергался воздействию, и используйте изогнутые щипцы, чтобы удерживать разъем над монтажом, чтобы аккуратно выровнять золотые провода электродов с контактами разъема, а затем быстро припаять каждую оконечность электрода к одному соответствующему контакту разъема. После снятия мыши с рамы закройте пустое пространство между разъемом и головкой акриловым цементом.А после взвешивания поместите мышь в чистую клетку с несетчатой крышкой на грелке. Через две недели после операции подключите мышей к регистрируемым кабелям и, по крайней мере, через неделю записывайте электрокортикографические и электромиографические сигналы в течение 24 часов или более. Успешная инфекция подтверждается окрашиванием ГК нейронов в моторной коре, окружающей место инъекции, что указывает на наличие кофилина S3D HA. Совместное окрашивание с возбуждающим нейронным маркером CaMKII alpha указывает на четкую кофилиновую кофилин S3D HA и CaMKII альфа-коэкспрессию при высоком увеличении.Логарифмические преобразованные относительные спектры мощности для бодрствования, медленного волнового сна и парадоксального сна показывают специфические для состояния различия в спектральной активности при инактивации кофилина. Комбинация электрокортикографической записи и AAV-опосредований манипуляций точными молекулярными мишенями также применима к нескольким областям мозга и к другим подполям нейробиологии, таким как исследования эпилепсии или памяти в дополнение ко сну.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Функциональной визуализации из слуховой коры у взрослых кошек с использованием высокого поля МРТ

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Визуализация и живой изображений Олигодендроциты органелл в Organotypic мозга фрагментов с помощью аденоассоциированный вирус и конфокальная микроскопия

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...