Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

El trabajo fue financiado por la Cátedra de Investigación de Canadá en Fisiología Molecular del Sueño. Los autores agradecen a Chloé Provost y Caroline Bouchard por su ayuda técnica.

Todos los métodos fueron aprobados por el Comité d'éthique de l'expérimentation animale de la Recherche CIUSSS-NIM y están de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado animal. Consulte la Tabla de materiales para los reactivos, equipos y materiales utilizados en este protocolo.
1. Preparación quirúrgica
<ol><li>Preparación de electrodos ECoG y EMG<ol>
<li>Para cada animal, prepare tres electrodos ECoG: usando un soldador, coloque una pequeña gota de soldadura sin plomo en la tapa de rosca de un tornillo cubierto de oro y suelde un alambre de oro de 4 mm de largo y 0,2 mm de diámetro (sin aislamiento) en la parte superior de la tapa de rosca usando la soldadura sin plomo (Figura 1A). Prepare 2 electrodos con el alambre de oro hacia arriba, y uno con un ángulo de 45 ° desde la vertical.</li>
		<li>Para cada animal, prepare dos electrodos EMG: corte un alambre de oro de 0,2 mm de diámetro a una longitud de 1,5 cm y un segundo a 2 cm. Curva ambos cables para que estos abracen la curva del cráneo hasta los músculos del cuello, manteniendo un extremo recto que se soldará al conector (Figura 1B).</li>
		<li>Para cada animal, prepare un conector: use un conector de 6 canales (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm de pines de metal) y agregue soldadura sin plomo a 5 de los 6 pines de metal (omitiendo un pin central; Figura 1C). Cubra la parte superior del conector con cinta adhesiva para evitar la basura o la infiltración de agua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de AAV y bomba de jeringa<ol>
<li>Preparar la prueba AAV (aquí, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinaS3D-HA) y/o el AAV de control (aquí, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) diluyendo la(s) mezcla(s) de AAV (aquí, AAV en una solución de solución salina tamponada con fosfato que contiene surfactante no iónico [0.001%]) con solución salina estéril para obtener el título viral deseado (generalmente 1012-13 copias del genoma [GC]/mL) y el volumen requerido para el número de ratones a tratar. NOTA: Un volumen inyectado de 1 μL por área cortical por ratón requiere la preparación de 2 μL.</li>
		<li>Fije una jeringa de 10 μL a una bomba de jeringa y llénelo con agua destilada.</li>
		<li>Llene un tubo de PE50 de aproximadamente 60 cm de longitud con agua destilada con una jeringa de 1 ml y una aguja de 21 G. Es importante destacar que deje la aguja y la jeringa 21G en su lugar después del llenado. Conecte el tubo PE50 con la bomba de jeringa; deje la aguja/jeringa de 21 G en un extremo del tubo PE50 y conecte el otro extremo a la jeringa de 10 μL.</li>
		<li>Una vez que el tubo esté fijado a la jeringa de 10 μL, retire la aguja en el otro extremo y empuje el pistón de la jeringa de 10 μL para llenar el espacio dejado por la aguja con agua. NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire y que el tubo esté completamente lleno de agua.</li>
		<li>Instale una cánula de 28 G en el extremo del tubo donde se extrayó la aguja. Empuje agua en la cánula con la jeringa de 10 μL para llenarla por completo. Fije la cánula firmemente al brazo estereotáxico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de animales NOTA: Los ratones machos y hembras C57BL6 / J de ~ 12 semanas de edad se adaptaron previamente durante al menos 2 semanas para alojarse en jaulas individuales y a un ciclo oscuro de luz de 12 horas: 12 horas con comida y agua ad libitum y acceso a un cubo de madera.<ol>
<li>Pesar cuidadosamente a los ratones e inyectar por vía intraperitoneal una mezcla de ketamina/xilazina (120/10 mg/kg) para la anestesia. Espere aproximadamente 10 minutos para la anestesia profunda.</li>
		<li>Afeitar el cabello desde la parte posterior de las orejas hasta la parte frontal de la cabeza entre los ojos con un recortador de cabello. NOTA: Tenga mucho cuidado de no cortar los bigotes (proteja los bigotes con un dedo durante el afeitado) ya que el recorte de bigotes modificará las entradas sensoriales y la actividad de ECoG35,36.</li>
		<li>Agregue una generosa gota de ungüento oftálmico en cada ojo para prevenir la deshidratación. Verifique la profundidad de la anestesia regularmente durante el procedimiento pellizcando un dedo del pie de la pata trasera. Proporcione al ratón 0.5-1.5% de isoflurano para garantizar una anestesia profunda si aparece un reflejo de pellizco en el dedo del dedo del día.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inyección intracortical de AAV con una bomba de jeringa
NOTA: Realice todos los pasos siguientes con instrumentos esterilizados y en un ambiente limpio. Use etanol al 70% para lavar aún más los instrumentos esterilizados y para lavar los electrodos preparados en la sección 1.1, así como los tornillos de anclaje (tornillos no cubiertos de oro) antes de comenzar la cirugía.
<ol><li>Fije cuidadosamente la cabeza del mouse en el aparato estereotáxico con barras para los oídos. NOTA: Asegúrese de que la cabeza no se mueva lateralmente.</li>
	<li>Tire suavemente de la lengua del animal fuera de la boca para evitar la asfixia y fije la nariz del mouse con el adaptador estereotáxico. NOTA: Controle la respiración con frecuencia durante el procedimiento.</li>
	<li>Esterilizar la zona afeitada de la cabeza con etanol al 70% y sujetando la piel con unas torceps Graefe extra finas, cortar la piel desde la base de las orejas hasta el nivel de los ojos con tijeras de tejido. Use cuatro pinzas quirúrgicas para estirar la piel y exponer el cráneo (dos a cada lado de la incisión; ver Figura 1D).</li>
	<li>Rasca la superficie del cráneo con una punta de tijera afilada: mientras evitas las suturas óseas, retira el periostio y crea rayas superpuestas en dos o más direcciones. Retire los fragmentos de hueso y seque el cráneo con etanol al 70%. NOTA: El rascado y el rayado ayudarán a que el montaje de grabación sea más robusto al mejorar la adherencia del cemento al cráneo (ver más abajo).</li>
	<li>Con la cánula fijada al brazo estereotáxico, identifique la ubicación del bregma (es decir, la intersección entre las suturas coronales y sagitales del cráneo; Figura 1D) y lambda (es decir, la intersección entre la sutura sagital del cráneo y una línea recta que conecta la sutura lambdoide izquierda y derecha; Figura 1D), y anote las coordenadas estereotáxicas de cada uno. Si la diferencia entre las coordenadas z (eje vertical) del bregma y lambda es mayor de 0,3 mm, ajuste la altura de la nariz utilizando el adaptador estereotáxico hasta que la posición z de bregma y lambda esté alineada.</li>
	<li>Marque la posición de la cánula en el cráneo con una pluma en estas coordenadas (corteza motora): 1,5 mm lateral derecho a línea media y 1,5 mm anterior a bregma. Perfore cuidadosamente el cráneo en la posición de la cánula con una broca de 0,7 mm en una dirección perpendicular a la superficie del cráneo (alineada con el eje vertical). Lave el cráneo perforado con una punta de algodón estéril impregnada con una solución de providona yodada al 10%.</li>
	<li>Cargue la cánula con una burbuja de aire de 1 μL tirando del pistón de la jeringa de 10 μL hacia atrás en 1 μL. Cargue el AAV de prueba (aquí AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) o el AAV de control (aquí AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) en la cánula previamente cargada con la burbuja de aire: mezcle el AAV canalizando lentamente hacia arriba y hacia abajo, pipetee 1.7 μL en una placa de Petri estéril y aspire 1.5 μL de la solución en la cánula tirando lentamente del pistón de la jeringa de 10 μL. Marque la posición de la burbuja de aire en el tubo PE50 para permitir el seguimiento de la inyección.</li>
	<li>Alinee la cánula con el orificio en el cráneo para que la posición vertical de la cánula llegue al borde superior del cráneo (es decir, la superficie del cráneo). Desde la superficie del cráneo, baje lentamente la cánula en 1,5 mm (para alcanzar 1,5 mm por debajo de la superficie del cráneo y la capa V de la corteza motora). NOTA: Tenga mucho cuidado de no bajar demasiado la cánula para evitar lesiones innecesarias del tejido cerebral.</li>
	<li>Inicie la bomba de la jeringa para inyectar 1 μL de AAV en el transcurso de 40 min (velocidad: 0.025 μL / min para minimizar el daño tisular). Realice un seguimiento de la inyección en el tubo PE50 con el movimiento de la burbuja de aire y realice ajustes si es necesario.</li>
	<li>Después de completar la inyección, deje la cánula en su lugar durante 5 minutos para garantizar una difusión suficiente y evitar el reflujo. Luego, levante lenta y cuidadosamente el brazo estereotáxico para eliminar la cánula de la corteza.</li>
</ol>3. Implantación de electrodos ECoG/EMG
<ol><li>Usando fórceps Kelly rectos, atornille lentamente un electrodo ECoG (con alambre de oro recto) en el eje vertical (el mismo ángulo en que se perforó el orificio) en el orificio donde se inyectó el AAV. Deje al menos 2,5 mm del tornillo fuera del cráneo para minimizar el daño a la duramadre y la corteza cerebral (es decir, para una profundidad aproximada de 1,1 mm desde la superficie del cráneo; Figura 1D).</li>
	<li>Marque la posición del electrodo ECoG posterior y el electrodo de referencia en el cráneo con una pluma en estas coordenadas: electrodo posterior (corteza visual) 1,5 mm lateral derecho a línea media y 1,5 mm anterior a lambda, electrodo de referencia (corteza somatosensorial) 2,6 mm lateral derecho a línea media y 0,7 mm posterior a bregma. Además, marque la posición de tres tornillos de mantenimiento (que actúan como anclajes entre el cráneo y el cemento dental para solidificar el montaje de la cabeza) en el hemisferio izquierdo sin coordenadas específicas, pero lo más distantes posible entre sí y de los electrodos ECoG.</li>
	<li>Perfore cuidadosamente el cráneo en la posición marcada de los otros electrodos y ancle los tornillos con la broca de 0,7 mm. Perforar en una dirección perpendicular a la superficie del cráneo para cada tornillo (es decir, eje vertical para el electrodo posterior pero con un ángulo desde el eje vertical para otros sitios). Lave el cráneo perforado con una solución de providoneyodo al 10% y bloquee los orificios con piezas pequeñas y enrolladas de limpiaparabrisas de tareas delicadas antes de instalar los tornillos para evitar el sangrado y la contaminación.</li>
	<li>Usando las pórceps Kelly rectas, atornille los tornillos de mantenimiento en el hemisferio izquierdo y luego atornille los dos últimos electrodos en el hemisferio derecho. Asegúrese de atornillar con el mismo ángulo en el que se perforaron los orificios y dejar al menos 2,5 mm de cada tornillo fuera del cráneo (Figura 1D). NOTA: Para maximizar la solidez del montaje final y la calidad de las señales electrofisiológicas, tenga cuidado de no tocar ningún tornillo al instalar el siguiente.</li>
	<li>Coloque unas pequeñas gotas de cemento dental en el centro del espacio en forma de anillo dentro de los tornillos. Inserte el extremo curvo de un electrodo EMG (preparado en el paso 1.1.2) aproximadamente 1-2 mm en los músculos del cuello sosteniendo la extremidad curva con fórceps de #5 Dumont y levantando la piel por encima de los músculos con fórceps Graefe extrafijas. Luego, coloque el lado curvo y el codo del electrodo en el cemento dental; repita para el segundo electrodo EMG. NOTA: El extremo recto del electrodo EMG más largo debe estar alineado con el electrodo ECoG anterior y el del electrodo EMG más corto con el electrodo ECoG posterior. Asegúrese de que los dos electrodos EMG no se toquen entre sí ni con ninguno de los tornillos.</li>
	<li>Cubra los ojos de los ratones y aplique luz durante 3-5 minutos para ayudar a la solidificación del cemento. Una vez que los electrodos EMG se sujeten firmemente, cubra la base de los electrodos ECoG y la base de los tornillos de anclaje con cemento dental para formar un contorno en forma de corona. Cubra los ojos de los ratones y aplique luz durante 3-5 minutos para ayudar a la solidificación del cemento. NOTA: No aplique cemento en las extremidades de los electrodos ECoG y EMG (alambre de oro que se soldará al conector) o en la piel.</li>
	<li>Rellena el centro del montaje con cemento acrílico previamente mezclado. Durante la solidificación del cemento, retire las cuatro abrazaderas quirúrgicas que sujetan la piel (y lávelas inmediatamente con limpiaparabrisas de tareas delicadas). NOTA: No aplique cemento en las extremidades de los electrodos ECoG y EMG (alambre de oro que se soldará al conector) o en la piel.</li>
	<li>Sutura la piel en la parte posterior y frontal del montaje para que el cráneo no quede expuesto (pero evita estirar demasiado la piel) utilizando una aguja de sutura (13 mm 3/8 c) y monofilamento absorbible sintético.</li>
	<li>Sostenga el conector sobre el montaje con pinzas curvas y alinee cuidadosamente el cable dorado de los electrodos con los pines del conector. Extremidades del electrodo de soldadura a los pines del conector con el soldador. NOTA: Proceda rápidamente para evitar el sobrecalentamiento y el daño al tejido cortical. Asegúrese de que cada electrodo haga un buen contacto con el pin conector correspondiente y que los electrodos no estén conectados entre sí.</li>
	<li>Retire el ratón del marco estereotáxico. Cubra el espacio vacío entre el conector y el cabezal con cemento acrílico previamente mezclado cubriendo todas las conexiones entre los electrodos y los pines del conector. NOTA: Evite la infiltración de cemento dentro del conector sosteniendo el mouse con el conector sobre la cabeza (cabeza recta no inclinada).</li>
	<li>Pesa el ratón y colóquelo en una jaula limpia (preferiblemente equipada con una tapa sin malla) sobre una almohadilla térmica (carcasa individual para evitar daños en el montaje de la cabeza). Controle al animal regularmente y administre 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea al despertar, y 12 h más tarde si el animal muestra signos de dolor (por ejemplo, postura anormal, ojos entrecerrados). NOTA: El aumento de peso en relación con el peso previo a la cirugía no debe exceder los 1,5 g.</li>
</ol>4. Grabaciones
<ol><li>Los ratones domésticos individualmente para evitar daños en el montaje de la cabeza como resultado del aseo mutuo, así como daños y enredos de los cables de grabación. NOTA: Para este protocolo, los ratones fueron alojados con acceso ad libitum a alimentos, agua y un cubo de madera, y se realizó un monitoreo diario.</li>
	<li>Conecte los ratones a los cables de grabación 2 semanas después de la cirugía para la adaptación a las condiciones de cableado.</li>
	<li>Registre señales ECoG/EMG durante 24 horas (o más/menos, dependiendo de las preguntas de investigación). NOTA: La grabación de la señal ECoG / EMG se realizó utilizando un cable, un conector giratorio (para permitir la rotación del cable), una caja portátil de 36 canales y un amplificador, que se conectó a una computadora. Las señales se muestrean a 256 Hz (o más dependiendo de las preguntas de investigación) y se registran con software comercial (consulte la Tabla de materiales). Para garantizar una expresión viral suficiente, los experimentos deben realizarse al menos 3 semanas después de la inyección de AAV, como se describió anteriormente29,37.</li>
	<li>Después del registro, sacrifique a los ratones por dislocación cervical (u otros métodos dependiendo del protocolo de inmunotinción) y recolecte el cerebro para la inmunotinción.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método preciso y directo para monitorear la actividad de ECoG y EMG durante la manipulación de objetivos moleculares utilizando AAV. Para una comparación adecuada entre grupos, se recomienda planificar siempre los procedimientos quirúrgicos (inyección de AAV e implantación de electrodos) el mismo día para los animales de prueba y control, y registrar sus señales electrofisiológicas simultáneamente. Para obtener una expresión viral similar entre los animales de prueba y los de control, es deseable inyectar el mismo título viral. En el presente caso, el título viral de AAV de control se había reducido a la mitad del AAV de prueba para garantizar una expresión viral similar. Los experimentadores deben tener mucho cuidado con las mediciones de coordenadas estereotáxicas para garantizar una baja variabilidad entre animales en el área del cerebro / orientación de la capa cortical. Además, dado que la profundidad de la inyección se calcula a partir de la superficie del cráneo, y que el grosor del cráneo varía con la edad y el sexo, la colocación de la cánula siempre debe verificarse utilizando histología post-protocolo o inmunohistoquímica (por ejemplo, Figura 2)para garantizar un posicionamiento / profundidad de inyección adecuados, y las coordenadas estereotáxicas deben ajustarse si es necesario. A lo largo de la inyección AAV de 40 minutos, es muy importante controlar la velocidad de inyección para detectar y corregir rápidamente posibles problemas, como el bloqueo de la bomba. Algunos pasos experimentales también son cruciales para obtener señales electrofisiológicas óptimas. Por ejemplo, no se desenrosque en exceso durante la implantación de electrodos; los tornillos deben sobresaler del cráneo en al menos 2,5 mm para minimizar el daño a la corteza cerebral y la formación de una cicatriz glial. Después, también es tremendamente importante i) evitar la aplicación de cemento en las extremidades de los electrodos, ii) asegurar una soldadura rápida de los electrodos al conector, y iii) asegurarse de que no haya contacto entre los electrodos.
El procedimiento presentado aquí para el registro de ECoG y EMG está extremadamente bien establecido, es simple y se usa ampliamente para monitorear la vigilia y el sueño en ratones2,11,13,34. Las grabaciones continuas de ECoG y EMG se pueden realizar durante varios días consecutivos (e incluso semanas) y generan un conjunto de datos muy rico que se puede utilizar para realizar varias líneas de análisis que comprenden variables relacionadas con la vigilia y la cantidad de sueño y la arquitectura2,11, 12 (por ejemplo, el tiempo pasado en diferentes estados por períodos de luz y oscuridad, el número de episodios de cada estado, Distribución del sueño las 24 horas), vigilia y contenido espectral del sueño34,41 (por ejemplo, potencia en diferentes bandas de frecuencia [similar a la Figura 3],actividad libre de escala), y características de las ondas individuales42,43,44 (por ejemplo, amplitud y pendiente de onda lenta). Cuando se usa en combinación con manipulaciones moleculares mediadas por AAV, una ventaja adicional es evitar la posible compensación del desarrollo que puede ocurrir en animales transgénicos. Con la práctica, todo el procedimiento, incluida la inyección de AAV de 40 minutos, se puede realizar en aproximadamente 90 minutos. La tasa de mortalidad debe ser (muy) baja ya que la cirugía es mínimamente invasiva.
El uso simultáneo de la grabación ECoG /EMG y la manipulación dirigida con AAV ofrece una variedad de otras ventajas y aplicaciones. Por ejemplo, la precisión de la orientación estereotáxica, cuando se realiza adecuadamente, es muy alta y replicable y es útil para determinar el papel específico de una región cerebral dada (y / o un tipo de célula o un elemento molecular dentro de la región) en la regulación del sueño u otros procesos fisiológicos. Por lo tanto, varias áreas corticales diferentes pueden ser fácilmente dirigidas utilizando adaptaciones del protocolo actual. Además, las manipulaciones de objetivos utilizando AAV podrían dirigirse a un área cortical / subcortical diferente de los sitios de grabación ECoG. En tales casos, el orificio de rebabas para la inyección de AAV podría estar cubierto por una pequeña cubierta de vidrio fijada con cemento dental (o cera ósea). Para una mayor especificidad, la construcción AAV a menudo incluye un promotor que permite la infección dirigida de una célula precisa tipo14. Se utilizó un promotor CamKIIα en el presente protocolo para dirigirse específicamente a las células piramidales excitatorias14,29,45de la corteza motora. Esta estrategia ha permitido la inactivación de la cofilina (utilizando cofilinaS3D)32,33 en las neuronas excitadoras de la corteza motora y la observación de cambios específicos del estado en la actividad de ECoG(Figura 3). Para evaluar la eficacia de la infección/transducción, los futuros usuarios del protocolo podrían combinar el protocolo AAV-ECoG presentado con uno de tinción por inmunofluorescencia, y utilizar imágenes de alta ampliación para calcular el número de células que muestran doble etiquetado del número total de células que muestran un solo etiquetado del objetivo (aquí, neuronas que expresan CaMKIIα). En un estudio reciente, se utilizó un método AAV-ECoG similar al descrito aquí para sobreexpresar la proteína 1 relacionada con el síndrome de retraso mental X frágil (FXR1) en todas las neuronas de la corteza motora utilizando un AAV que contiene un promotor de sinapsina y reveló un efecto de esta manipulación en la distribución del estado de vigilancia y el contenido espectral28. Estos hallazgos ilustran cómo la manipulación de una molécula dada en una región del cerebro objetivo utilizando AAV puede revelar roles en la regulación de parámetros específicos de vigilia / sueño.
Una limitación del protocolo descrito es la pequeña lesión del tejido cerebral que se produce con la colocación de la cánula antes de realizar la inyección de AAV, que también podría ir acompañada de una respuesta inflamatoria. Esto podría ser de particular preocupación cuando se realiza la inyección de AAV en áreas subcorticales y siempre debe abordarse mediante el uso de controles adecuados. Alternativamente, el protocolo actual podría ser seguido por la cuantificación de la gliosis reactiva y / o de la activación microglial (por ejemplo, utilizando inmunofluorescencia) para garantizar niveles similares en los grupos de control y prueba y, por lo tanto, en la lectura de ECoG. Una segunda limitación se refiere al riesgo de una mala conexión entre un electrodo y el conector, lo que podría dar lugar a una señal electrofisiológica continua u ocasionalmente mala. Los electrodos sólidamente atornillados, soldados y cementados minimizarán la incidencia de este problema. Una tercera limitación está relacionada con los animales atados a través del montaje de la cabeza durante la grabación, lo que podría limitar la locomoción y otros comportamientos, al menos hasta cierto punto, y ocasionalmente provocar daños en el cableado y pérdida de señal. Finalmente, el protocolo presentado es más adecuado para ratones adultos, dado que el tamaño del cráneo de los animales más jóvenes puede causar dificultades en la instalación del montaje de la cabeza representado, como se describió anteriormente2.
La grabación combinada de ECoG / EMG y la manipulación mediada por AAV de un objetivo preciso también es aplicable a campos de investigación distintos de la neurociencia del sueño. Entre otros, podría utilizarse para estudiar y manipular eventos epilépticos en modelos animales de convulsiones y es una poderosa herramienta para modular las oscilaciones cerebrales involucradas en la codificación y consolidación de la memoria46,47. En consecuencia, las aplicaciones potenciales ciertamente abarcan los campos de la investigación fundamental en psiquiatría y neurología, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Además de la capacidad de expresar una forma inactiva de una molécula, los AAV pueden y se han utilizado para sobreexpresar o regular a la baja (por ejemplo, ARN de interferencia pequeña, CRISPR / Cas9) o para rescatar la expresión de una molécula en un KO de cuerpo completo. Es importante destacar que la metodología dual del protocolo actual también es aplicable a otras especies de mamíferos como ratas y roedores diurnos que representan modelos interesantes para comprender tanto el sueño como la neurodegeneración48,49.

Los registros electroencefalográficos (o generalmente electrocorticográficos [ECoG] en roedores) y electromiográficos (EMG) se utilizan ampliamente en la investigación del sueño, así como más ampliamente en neurociencia, neurología y psiquiatría. En combinación, estas señales electrofisiológicas permiten la identificación de estados de vigilancia y la posterior cuantificación de la duración del estado y la composición espectral, tanto en humanos como en roedores1,2,3,4. Dicha cuantificación ha sido útil para entender cómo se modifica el sueño en condiciones patológicas como las enfermedades neurodegenerativas y los modelos5,6,7 o por modificación genética8,9. Por ejemplo, se demostró que el knockout (KO) de diferentes genes vinculados a la comunicación neuronal cambia la duración de la vigilia y el sueño tanto en el ratón como en la mosca de la fruta10,11,12,13. Para abordar la posible compensación del desarrollo que surge del estudio del KO de cuerpo completo en roedores y para permitir un control más fino de la manipulación genética, una forma eficiente de manipular la expresión génica es usar virus adenoasociados (AAV). Una manipulación genética mediada por AAV se puede utilizar para regular hacia abajo o hacia arriba un objetivo molecular dado y para restringir la manipulación a una población celular específica utilizando diferentes tipos de promotores14. Los AAV también se utilizan ampliamente como método de administración en la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas915,16. Estas metodologías permiten un mejor control temporal y espacial de la manipulación genética, que generalmente se asocia con la expresión de un reportero que permite cuantificar el área infectada mediante inmunofluorescencia.
Los AAV también representan el principal vector para las manipulaciones específicas del tipo celular de la actividad neuronal a través de la optogenética y la quimiogenética17,18,19,que han sido ampliamente utilizadas en investigaciones recientes sobre enfermedades neurodegenerativas, comportamiento, cognición y sueño20,21,22. En la investigación del sueño, la aplicación de optogenética para la activación o inhibición de ciertas regiones cerebrales, como el cerebro anterior basal, el hipotálamo y el tegmento sublaterodorsal, ha sido útil para determinar sus funciones en el control de la excitación, el sueño de ondas lentas (también conocido como sueño de movimiento ocular no rápido), el sueño paradójico (o sueño de movimiento ocular rápido) y la cataplejía23, 24,25. Además, las manipulaciones mediadas por AAV han ayudado a dilucidar importantes circuitos reguladores del sueño y moléculas que contribuyen a los efectos adversos de la pérdida de sueño26,27,28. Por ejemplo, una proteína que ha demostrado estar implicada en el deterioro de la memoria inducido por la privación del sueño es la cofilina29,30. Esta proteína es una proteína filamentosa que parte la actina y que participa en la reorganización de los filamentos de actina uniéndose físicamente a la actina y promoviendo el desmontaje de los filamentos de forma dinámica31. Se demostró que la inhibición de la actividad de la cofilina mediante un enfoque mediado por AAV previene la pérdida de la columna vertebral, así como la plasticidad sináptica y los déficits de memoria inducidos por la privación del sueño en ratones29. Colectivamente, estos estudios enfatizan la utilidad y relevancia de las manipulaciones mediadas por AAV para comprender la regulación del sueño y las consecuencias de la privación del sueño en roedores.
Aquí, se describe un protocolo que combina la implantación y el registro de electrodos ECoG y EMG con la manipulación de la función de cofilina en un área de la corteza cerebral de ratones de tipo salvaje (WT) utilizando un AAV. Más precisamente, un AAV (serotipo 9) que expresa la secuencia codificante de una forma fosfomimética de la cofilina de ratón (cofilinaS3D),haciéndola inactiva32,33, se inyecta en la corteza motora (M1 y M2). Un electrodo ECoG se implanta directamente en el sitio de inyección para garantizar el registro de la actividad cortical sincronizada de las células infectadas. El registro de ECoG / EMG se realiza durante 24 horas en condiciones no perturbadas tres semanas después de la cirugía para permitir la recuperación, la adaptación y la alta expresión de cofilinaS3D. El registro se utiliza entonces para la identificación de estados de vigilancia y análisis espectral ECoG, como se describe en estudios previos11,34. Esta metodología puede revelar específicamente cómo la cofilina cortical modula la vigilia y las señales ECoG del sueño en ratones. Esta combinación de registros electrofisiológicos y manipulación genética mediada por AAV es particularmente relevante para investigar el papel de varios elementos moleculares en funciones cerebrales específicas y podría aplicarse a áreas cerebrales corticales (y subcorticales) de interés en WT y ratones genéticamente modificados de ambos sexos e incluso otras especies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

El uso de registros electrocorticográficos (ECoG) en roedores es relevante para la investigación del sueño y para el estudio de una amplia gama de afecciones neurológicas. Los virus adenoasociados (AAV) se utilizan cada vez más para mejorar la comprensión de los circuitos cerebrales y sus funciones. La manipulación mediada por AAV de poblaciones celulares específicas y / o de componentes moleculares precisos ha sido tremendamente útil para identificar nuevos circuitos / moléculas reguladoras del sueño y proteínas clave que contribuyen a los efectos adversos de la pérdida de sueño. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de la proteína filamentosa que separa la actina cofilina utilizando AAV previene el deterioro de la memoria inducido por la privación del sueño. Aquí, se describe un protocolo que combina la manipulación de la función de la cofilina en un área de la corteza cerebral con el registro de la actividad de ECoG para examinar si la cofilina cortical modula las señales de ECoG de vigilia y sueño. La inyección de AAV se realiza durante el mismo procedimiento quirúrgico que la implantación de electrodos ECoG y electromiográficos (EMG) en ratones machos y hembras adultos. Los ratones son anestesiados y sus cabezas están afeitadas. Después de la limpieza de la piel y la incisión, se determinan las coordenadas estereotáxicas de la corteza motora y se perfora el cráneo en esta ubicación. Una cánula precargada con un AAV que expresa cofilinaS3D,una forma inactiva de cofilina, se coloca lentamente en el tejido cortical. Después de la infusión de AAV, los tornillos cubiertos de oro (electrodos ECoG) se atornillan a través del cráneo y se cementan al cráneo con cables de oro insertados en los músculos del cuello (electrodos EMG). A los animales se les permite tres semanas para recuperarse y para garantizar una expresión suficiente de cofilinaS3D. El área infectada y el tipo de célula se verifican mediante inmunohistoquímica, y el ECoG se analiza mediante la identificación visual de los estados de vigilancia y el análisis espectral. En resumen, este enfoque metodológico combinado permite investigar la contribución precisa de los componentes moleculares que regulan la morfología neuronal y la conectividad a la regulación de la actividad sincronizada de la corteza cerebral durante la vigilia y el sueño.

Después de los registros electrofisiológicos, la inmunofluorescencia se utiliza para definir el área infectada por la inyección de AAV y para validar la expresión de cofilinaS3D (Figura 2). La inmunotinción se puede realizar utilizando una metodología similar a la descrita anteriormente29,37,38,39. El AAV expresa una forma inactiva de cofilina fusionada con una etiqueta de hemaglutinina (HA) (cofilinaS3D-HA), que se detecta por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-HA y un anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488). Las neuronas excitatorias infectadas (aquí, dirigidas con un promotor de la proteína quinasa II alfa [CamKIIα]dependiente de calcio / calmodulina que controla la expresión del transgén contenido en el AAV) se tiñen con el anticuerpo anti-HA. Una infección exitosa está indicada por la tinción de las neuronas en la corteza motora que rodea el sitio de inyección (Figura 2A,B). En este ejemplo representativo, la corteza cerebral del otro hemisferio no mostró ninguna tinción notable. Sin embargo, dado que las neuronas excitatorias pueden proyectarse a áreas cerebrales distantes, la tinción en el hemisferio contralateral no es necesariamente una indicación de inyección fallida. Un mayor aumento del área infectada mostró tinción de cuerpos celulares y proyecciones, confirmando que solo células específicas del área cortical objetivo estaban infectadas(Figura 2C).
La tinción con marcadores de neuronas excitadoras (por ejemplo, transportador de glutamato vesicular 1, CaMKIIα) también se puede realizar para validar la especificidad del tipo de célula. Alternativamente, se puede realizar una tinción con marcadores de neuronas o astrocitos inhibidores en caso de que estas células se dirijan utilizando diferentes promotores. La co-tinción de cofilinaS3D-HAy CaMKIIα también se realizó en el mismo animal para un área más posterior al sitio de inyección que todavía mostraba tinción anti-HA en la corteza motora(Figura 2D). La imagen de mayor aumento del área muestra células que expresan claramente cofilinaS3D-HA (Alexa Fluor 488, Figura 2E)y CaMKIIα (Alexa Fluor 568, Figura 2F). La superposición de la tinción de cofilinaS3D-HA y CaMKIIα revela que la mayoría (si no todas) las células teñidas para cofilinaS3D-HA también son positivas para CaMKIIα(Figura 2G). Esta observación apoya la especificidad de la infección para las neuronas excitadoras.
Para evaluar el impacto de la manipulación de la cofilina en la actividad de ECoG, las señales ECoG y EMG se utilizan para realizar una identificación visual de los estados de vigilia (vigilia, sueño de ondas lentas, sueño paradójico). Esto se hace en épocas 4-s debido al rápido cambio en el estado de vigilancia en elratón 2, y aquí, para una grabación completa de 24 horas. Los análisis estándar incluyen el cálculo de la arquitectura del sueño y las variables de análisis espectral, como se realizó anteriormente para diferentes conjuntos de datos11,12, 13,28,34. En particular, el análisis espectral de la señal ECoG de los diferentes estados indexará la composición y la calidad del estado. Para eliminar las diferencias que podrían surgir, por ejemplo, de diferentes profundidades de los electrodos, los datos de análisis espectral se pueden expresar en relación con la potencia total de todos los estados de un animal dado(Figura 3A). Dada la muy baja amplitud relativa de la actividad de ECoG en frecuencias más altas, los espectros de potencia relativa para la vigilia, el sueño de onda lenta y el sueño paradójico se han transformado para visualizar y comparar simultáneamente la actividad en frecuencias bajas y altas. Este análisis indica diferencias específicas del estado en la actividad espectral en condiciones de inactivación de la cofilina (Figura 3B). Más precisamente, estos hallazgos preliminares que combinan ratones machos y hembras señalan que la inactivación de cofilina aumenta significativamente la potencia espectral en frecuencias rápidas (14-30 Hz) durante la vigilia y en frecuencias lentas (1-4 Hz) durante el sueño paradójico, mientras que la actividad de ECoG durante el sueño de onda lenta no se ve afectada principalmente. Además, la inactivación de la cofilina parece aumentar la variabilidad entre ratones en la actividad de ECoG (particularmente notable en las barras de error para la vigilia en la Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de componentes de montaje ECoG/EMG y ejemplo representativo de colocación de electrodos ECoG. (A) Un electrodo ECoG: un alambre de oro de 4 mm de largo y 0,2 mm de diámetro (sin aislamiento) se fusiona en la cabeza de un tornillo cubierto de oro (diámetro de cabeza de 1,9 mm, diámetro principal de rosca de 1,14 mm, longitud total de 3,6 mm) utilizando soldadura sin plomo. (B) Electrodos EMG: dos cables de oro (1,5 y 2 cm) se curvan para abrazar la curva del cráneo hasta el músculo del cuello, y el otro extremo se mantiene recto para ser soldado al conector. (C) Un conector de 6 canales: se agrega soldadura sin plomo a 5 de los 6 pines metálicos (omitiendo uno en el medio) del conector (5 mm x 8 mm x 8 mm + pines metálicos de 3 mm). La parte superior del conector está cubierta con cinta adhesiva para evitar la infiltración de basura / agua. (D) Ejemplo de la colocación de los tres tornillos de mantenimiento en el cráneo del hemisferio izquierdo y de los tres electrodos ECoG (incluido un electrodo de referencia) en el hemisferio derecho. Las coordenadas estereotáxicas precisas de los electrodos ECoG se indican en los pasos 2.6 y 3.2 y se han calculado de acuerdo con la ubicación de la bregma y la lambda (que se indican mediante los puntos amarillos). Abreviaturas: ECoG = electrocorticográfico; EMG = electromiográfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Figura 2: Inmunotinción representativa para definir el área y el tipo de célula infectados con AAV. (A) Representación esquemática que muestra el lugar de inyección de la rebanada coronal presentada en el panel B. La posición es 1,1 mm anterior a la bregma, y la cánula (que se muestra en rojo) se dirigió a las capas V de la corteza motora primaria derecha (M1). Representación modificada de Franklin y Paxinos40. (B) Inmunotinción de HA para detectar la expresión de cofilinaS3D-HAen neuronas mostradas para una porción coronal del cerebro completo ubicada aproximadamente 1,1 mm antes del bregma. El área infectada se localiza principalmente en las capas V y VI (capas infragranulares) de las cortezas motoras primarias y secundarias derechas (M1 y M2). Barra de escala = 500 μm. El cuadrado representa el área que se muestra en C. (C) Mayor aumento del área infectada que muestra tinción de células infectadas y confirma la expresión de cofilinaS3D-HA en capas más profundas de la corteza motora. Barra de escala = 100 μm. (D) Coinmunotinción de HA y CaMKIIα para evaluar la especificidad del tipo celular mostrada para una porción coronal del hemisferio derecho ubicada aproximadamente 0,5 mm antes de bregma y, por lo tanto, posterior al sitio de inyección (mismo ratón que en los paneles B y C). El área infectada se localiza en cortezas motoras (M1 y principalmente M2). Barra de escala = 500 μm. El cuadrado representa el área que se muestra en E, F y G. (E) Mayor aumento del área infectada que muestra tinción de células infectadas y confirma la expresión de cofilinaS3D-HA. Barra de escala = 100 μm. (F) Mayor aumento del área infectada que muestra tinción de células CaMKIIα-positivas. Barra de escala = 100 μm. (G) Mayor aumento del área infectada que muestra co-etiquetado de cofilinaS3D-HAy CaMKIIα, confirmando que las células infectadas son CaMKIIα-positivas. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: AAV = virus adenoaso asociado; M1 = corteza motora primaria; M2 = corteza motora secundaria; CPu = putamen caudado (estriado); VI = ventrículo lateral; HA= hemaglutinina; CamKIIα = proteína quinasa II alfa dependiente de calcio/calmodulina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Figura 3:Espectros de potencia representativos para la vigilia, el sueño de onda lenta y el sueño paradójico obtenido después de la manipulación viral de la función de la cofilina. Los ratones machos (n = 5 por grupo) y hembra (n = 2 por grupo) inyectados con AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinaS3D-HA (título viral 2.58 × 1013 GC / mL) o con un AAV de control (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1.25 × 1013 GC / mL; la mitad del título de prueba para controlar la señal mejorada de este AAV de control) en la capa V de la corteza motora se registraron durante 24 h, y la señal electrocorticográfica fue sometida a análisis espectral (transformada rápida de Fourier para calcular la potencia espectral entre 0,5 y 30 Hz con una resolución de 0,25 Hz). (A) Espectros de potencia durante los tres estados de vigilancia expresados en relación con el poder total de todos los estados. (B) Espectros de potencia relativa transformados en logaríts para representar más adecuadamente las diferencias de grupo en frecuencias más altas. La supresión de la actividad de la cofilina en la corteza motora utilizando AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinaS3D-HA aumenta significativamente la actividad electrocorticográfica en el rango beta (14-30 Hz) durante la vigilia, y en el rango delta (1-4 Hz) durante el sueño paradójico en comparación con las inyecciones de control (las líneas rojas por encima de los ejes x indican Mann-Whitney U-prueba en la potencia de la banda de frecuencia p < 0.05). Abreviaturas: AAV = virus adenoaso asociado GC = copias del genoma; HA= hemaglutinina; CamKIIα = proteína quinasa II alfa dependiente de calcio/calmodulina; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Este artículo describe un protocolo para la manipulación de dianas moleculares en la corteza cerebral utilizando virus adenoaso asociados y para monitorear los efectos de esta manipulación durante la vigilia y el sueño utilizando registros electrocorticográficos.

Registro electrocorticográfico de áreas de la corteza cerebral manipuladas con un virus adenoaso asociado dirigido a la cofilina en ratones

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Este protocolo se puede utilizar para identificar el papel de dianas moleculares individuales específicas en la regulación de la actividad electrocorticográfica durante diferentes estados de Vigilin. Entre los beneficios del uso del virus adeno-asociado está la capacidad de dirigirse con precisión a una región determinada del cerebro y a un tipo de célula específico. Demostrando el protocolo estará Julien Dufort-Gervais, un investigador asociado de mi equipo.Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo de pellizco del dedo del dedo del día en un ratón anestesiado de 12 semanas de edad, use un recortador de cabello para afeitar el cabello desde la parte posterior de las orejas hasta la parte frontal de la cabeza entre los ojos. Agregue una generosa gota de ungüento oftálmico a cada ojo para prevenir la deshidratación y use las barras para los oídos para fijar cuidadosamente la cabeza del mouse en un aparato estereotáxico. Saque suavemente la lengua de la boca para evitar la asfixia.Fije la nariz del ratón al aparato y use etanol al 70% para esterilizar la piel expuesta en la cabeza. Sostenga la piel con pinzas Graefe extrafinas, use tijeras de tejido para cortar la piel desde la base de las orejas hasta el nivel de los ojos y coloque dos pinzas quirúrgicas a cada lado de la incisión para estirar la piel y exponer el cráneo. Evitando las suturas cerebrales, use una punta de tijera para rascar la superficie del cráneo para eliminar el periostio y crear rayas superpuestas en dos o más direcciones.Use etanol al 70% para eliminar los fragmentos óseos y desinfectar el cráneo. Con una cánula previamente preparada fijada al brazo estereotáxico, identifique la ubicación del bregma y la lambda y anote las coordenadas estereotáxicas de cada uno. Use el brazo estereotáxico y un bolígrafo para marcar la posición de la cánula en el cráneo 1,5 milímetros lateral derecho a la línea media y 1,5 milímetros anterior al bregma.Usando una broca de 0,7 milímetros, perfore cuidadosamente el cráneo en la posición marcada perpendicular a la superficie del cráneo y alineado con el eje vertical y lave el cráneo con una punta de algodón estéril empapada en una solución de yodo povidona de betadina al 10%, luego retraiga el émbolo de una jeringa de 10 microlitros con un microlitro para cargar la cánula con una burbuja de aire de un microlitro. A continuación, mezcle la mezcla AAV de interés con pipeteo lento y agregue 1.7 microlitros de la mezcla a una placa de Petri estéril. Utilice esta jeringa para cargar 1,5 microlitros de la solución en la cánula y marque la posición de la burbuja de aire en el tubo PE50 conectado.Alinee verticalmente la cánula con el orificio en el cráneo de tal manera que la cánula llegue al borde superior del hueso y marque la coordenada Z de la superficie del cráneo. Baje lentamente la cánula hasta que la punta alcance 1,5 milímetros por debajo de la superficie del cráneo y la capa cinco de la corteza motora y encienda la bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 0,025 microlitros por minuto para administrar un microlitro de AAV durante 40 minutos. Use la burbuja de aire en el tubo para rastrear la inyección, haciendo los ajustes necesarios.Cuando se haya entregado todo el volumen del virus, deje la cánula en su lugar durante cinco minutos para garantizar una difusión suficiente y evitar el reflujo antes de levantar lenta y cuidadosamente el brazo estereotáxico para eliminar la cánula de la corteza. Para la implantación de electrodos, use fórceps Kelly rectos para atornillar lentamente un electrodo electrocorticográfico con un cable de oro recto en el eje vertical del orificio en el que se inyectó el AAV, dejando al menos 2,5 milímetros de tornillo fuera del cráneo para minimizar el daño a la duramadre y la corteza cerebral. Utilice un bolígrafo para marcar la posición del electrodo de referencia 2,6 milímetros lateral derecho a la línea media y 0,7 milímetros posterior a bregma y la posición del electrodo electrocardiográfico posterior a 1,5 milímetros lateral derecho a la línea media y 1,5 milímetros anterior a lambda y las posiciones de tres tornillos de mantenimiento en el hemisferio izquierdo sin coordenadas específicas, pero lo más distantes posible entre sí y de los electrodos electrocorticográficos.Use el taladro para perforar cuidadosamente el cráneo perpendicular a la superficie del cráneo en las posiciones marcadas de los otros electrodos y tornillos y lave el cráneo perforado con una solución de yodo de povidona al 10%. Bloquee los orificios con pequeñas piezas enrolladas de delicada limpieza de tareas antes de instalar los tornillos para evitar sangrado y contaminación y use forzadores Kelly rectos para insertar los tornillos en los orificios de perforación en el mismo ángulo en que se perforaron los agujeros. Coloque unas pequeñas gotas de cemento dental en el centro del espacio en forma de anillo dentro de los tornillos y use forrceps Graefe extrafinas para levantar la piel por encima de los músculos del cuello.Usando las cinco torceps de Dumont, sostenga la extremidad curva de un electrodo electromiográfico e insértela aproximadamente uno o dos milímetros en los músculos. Coloque el lado curvo y el punto de plegado del electrodo en el cemento dental e inserte el segundo electrodo electromiográfico de la misma manera. Después de cubrir los ojos del animal, aplique luz durante tres a cinco minutos para solidificar el cemento y use cemento dental adicional para cubrir la base de los electrodos electrocorticográficos y los tornillos de anclaje para formar un contorno en forma de corona.Después de aplicar de tres a cinco minutos más de luz, llene el centro del montaje con cemento acrílico y retire las abrazaderas quirúrgicas. Use una sutura de monofilamento absorbible sintética para cerrar la piel en la parte delantera y posterior del montaje para que el cráneo no quede expuesto y use pinzas curvas para sostener el conector por encima del montaje para alinear cuidadosamente los cables dorados de los electrodos con los pines del conector, luego suda rápidamente cada extremidad del electrodo a un solo pin de conector correspondiente. Después de retirar el ratón del marco, cubra el espacio vacío entre el conector y el cabezal con el cemento acrílico.Y después de pesar, coloque el mouse en una jaula limpia con una tapa sin malla en una almohadilla térmica. Dos semanas después de la cirugía, conecte los ratones a los cables de grabación y, al menos una semana después, registre las señales electrocorticográficas y electromiográficas durante 24 horas o más. Una infección exitosa se confirma por tinción de HA de las neuronas dentro de la corteza motora que rodea el sitio de inyección, lo que indica la presencia de cofilina S3D HA. La co-tinción con el marcador de neurona excitatoria CaMKII alfa indica cofilina clara S3D HA y Co-expresión alfa CaMKII bajo alto aumento.Los espectros de potencia relativa transformados en log para la vigilia, el sueño de onda lenta y el sueño paradójico muestran diferencias específicas del estado en la actividad espectral bajo inactivación de cofilina. La combinación de registro electrocorticográfico y manipulación mediada por AAV de objetivos moleculares precisos también es aplicable a múltiples regiones del cerebro y a otros subcampos de la neurociencia, como la investigación sobre la epilepsia o la memoria, además del sueño.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

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Investigación

Neurociencias

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

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Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

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