Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Arbetet finansierades av Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. Författarna är tacksamma mot Chloé Provost och Caroline Bouchard för teknisk hjälp.

Alla metoder godkändes av Recherche CIUSSS-NIM och är förenliga med riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care. Se materialförteckningen för reagenser, utrustning och material som används i detta protokoll.
1. Förberedelse av kirurgi
<ol><li>Förberedelse av ECoG- och EMG-elektroder<ol>
<li>För varje djur, förbered tre ECoG-elektroder: använd ett lödkolv, placera en liten droppe blyfri lödning på skruvlocket på en guldtäckt skruv och löd en 4 mm lång guldtråd med diametern 0,2 mm (oisolerad) på toppen av skruvlocket med den blyfria lödaren (Figur 1A). Förbered 2 elektroder med guldtråden rakt upp och en med 45° vinkel från vertikalen.</li>
		<li>För varje djur, förbered två EMG-elektroder: skär en guldtråd med 0,2 mm diameter till en längd av 1,5 cm och en andra till 2 cm. Krök båda trådarna för att dessa ska omfamna skallens kurva upp till nackmusklerna och håll en rak ände som kommer att lödas till kontakten (Figur 1B).</li>
		<li>För varje djur, förbered en kontakt: använd en 6-kanalskontakt (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metallstift) och tillsätt blyfri lödning till 5 av de 6 metallstiften (utelämna en mittstift; Figur 1C). Täck toppen av kontakten med tejp för att undvika skräp eller vatteninfiltration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förberedelse av AAV och sprutpump<ol>
<li>Förbered testet AAV (här, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) och/eller kontroll AAV (här, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) genom att späda ut stocken AAV mix(er) (här, AAV i en lösning av fosfatbuffrad saltlösning som innehåller icke-joniskt tensider [0,001%]) med steril saltlösning för att erhålla önskad viral titer (i allmänhet 1012-13 genomkopior [GC]/ml) och den volym som krävs för att antalet möss ska behandlas. OBS: En injicerad volym på 1 μL per närområde per mus kräver beredning av 2 μL.</li>
		<li>Fäst en 10 μL spruta på en sprutpump och fyll den med destillerat vatten.</li>
		<li>Fyll ett PE50-rör med en längd av cirka 60 cm med destillerat vatten med en 1 ml spruta och en 21 G-nål. Viktigt är att lämna 21G-nålen och sprutan på plats efter fyllning. Anslut PE50-röret med sprutpumpen; lämna 21 G nål/spruta på ena änden av PE50-röret och anslut den andra änden till 10 μL-sprutan.</li>
		<li>När röret är fastsatt på 10 μL-sprutan, ta bort nålen i andra änden och tryck på kolven på 10 μL-sprutan för att fylla det tomrum som nålarna lämnat med vatten. OBS: Se till att det inte finns någon luftbubbla och att röret är helt fyllt med vatten.</li>
		<li>Installera en 28 G kanyl i slutet av röret där nålen togs bort. Tryck in vatten i kanylen med sprutan 10 μL för att fylla den helt. Fäst kanylen hårt på stereotaxiska armen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beredning av djur OBS: C57BL6/J han- och honmöss med ~12 veckors ålder var tidigare anpassade i minst 2 veckor till bostäder i enskilda burar och till en 12-h ljus: 12-h mörk cykel med ad libitum mat och vatten och tillgång till en träkub.<ol>
<li>Väg försiktigt mössen och injicera intraperitoneally en blandning av ketamin/xyzin (120/10 mg/kg) för anestesi. Vänta ca 10 min på djupbedövning.</li>
		<li>Raka håret från baksidan av öronen till framsidan av huvudet mellan ögonen med en hårtrimmer. OBS: Var mycket försiktig så att du inte skär whiskers (skydda morrhåren med ett finger under rakning) eftersom whisker trimning kommer att ändra sensoriska ingångar och ECoG aktivitet35,36.</li>
		<li>Tillsätt en generös droppe oftalmisk salva på varje öga för att förhindra uttorkning. Kontrollera anestesins djup regelbundet under proceduren genom att nypa en tå från bakpotten. Ge musen 0,5-1,5% isofluran för att säkerställa djupbedövning om en tå nyp reflex visas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intrakortornisk AAV-injektion med en sprutpump
OBS: Utför alla följande steg med steriliserade instrument och i en ren miljö. Använd 70% etanol för att ytterligare tvätta steriliserade instrument och för att tvätta elektroder som är beredda i avsnitt 1.1 samt ankarskruvar (icke-guldtäckta skruvar) innan du påbörjar operationen.
<ol><li>Fäst försiktigt musens huvud på stereotaxiska apparaten med öronstänger. OBS: Se till att huvudet inte rör sig i sammaled.</li>
	<li>Dra försiktigt djurets tunga ut ur munnen för att undvika kvävning och fixa musens näsa med stereotaxisk adapter. OBS: Övervaka andningen ofta under proceduren.</li>
	<li>Sterilisera huvudets rakade område med 70% etanol och genom att hålla huden med en extra fin Graefe-tång, skär huden från öronens botten till ögonnivån med vävnadssax. Använd fyra kirurgiska klämmor för att sträcka ut huden och exponera skallen (två på varje sida av snittet; se figur 1D).</li>
	<li>Skrapa skallytan med en skarp saxspets: samtidigt som du undviker bensuturer, ta bort periosteum och skapa överlappande streck i två eller flera riktningar. Ta bort benfragmenten och torka skallen med 70% etanol. OBS: Repor och ränder hjälper till att göra inspelningsmontage mer robust genom att förbättra cementens vidhäftning till skallen (se nedan).</li>
	<li>Med kanylen fastsatt på den stereotaxiska armen, identifiera knägmas placering (dvs. korsningen mellan skallen koronal och sagittal suturer; Figur 1D) och lambda (dvs. skärningspunkten mellan skallssäcken och en rak linje som förbinder vänster och höger lambdoid sutur; Figur 1D)och notera de stereotaxiska koordinaterna för var och en. Om skillnaden mellan z-koordinater (vertikal axel) för knäman och lambda är större än 0,3 mm, justera näsans höjd med hjälp av stereotaxic adaptern tills z-positionen för bregma och lambda är i linje.</li>
	<li>Markera kanylens läge på skallen med en penna vid dessa koordinater (motorbarken): 1,5 mm lateral höger till mittlinje och 1,5 mm främre till bregma. Genomborra försiktigt skallen i kanylens läge med en borrkrona på 0,7 mm i en riktning vinkelrätt mot skallytan (i linje med den vertikala axeln). Tvätta den genomborrade skallen med en steril bomullsspets impregnerad med en 10% providone-jodlösning.</li>
	<li>Ladda kanylen med en luftbubbla på 1 μL genom att dra tillbaka sputkolven på 10 μL med 1 μL. Ladda test AAV (här AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) eller kontroll AAV (här AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) i kanylen som tidigare laddats med luftbubblan: blanda AAV genom att långsamt leda upp och ner, pipet 1,7 μL på en steril Petri-skål och aspirera 1,5 μL av lösningen i kanylen genom att långsamt dra kolven på 10 μL-sprutan. Markera luftbubblans läge på PE50-röret så att injektionen kan spåras.</li>
	<li>Rikta in kanylen med hålet på skallen för kanylens vertikala läge för att nå skallens övre kant (dvs. skallytan). Från skallytan, sänk långsamt kanylen med 1,5 mm (för att nå 1,5 mm under skallytan och skikt V i motorbarken). OBS: Var mycket försiktig så att du inte sänker kanylen för mycket för att undvika onödig lesion i hjärnvävnaden.</li>
	<li>Starta sprutpumpen för att injicera 1 μL AAV under loppet av 40 min (hastighet: 0,025 μL/min för att minimera vävnadsskador). Håll koll på injektionen på PE50-röret med luftbubblans rörelse och gör justeringar vid behov.</li>
	<li>När injektionen är klar, lämna kanylen på plats i 5 minuter för att säkerställa tillräcklig diffusion och undvika återflöde. Lyft sedan långsamt och försiktigt den stereotaxiska armen för att ta bort kanylen från cortex.</li>
</ol>3. ECoG/EMG elektrodimplantation
<ol><li>Använd raka Kelly-tångar, skruva långsamt en ECoG-elektrod (med rak guldtråd) i den vertikala axeln (samma vinkel som hålet genomborrades) i hålet där AAV injicerades. Lämna minst 2,5 mm av skruven ur skallen för att minimera skador på duran och hjärnbarken (dvs. för ett ungefärligt djup av 1,1 mm från skallytan; Figur 1D).</li>
	<li>Markera positionen för den bakre ECoG-elektroden och referenselektroden på skallen med en penna vid dessa koordinater: bakre elektrod (visuell cortex) 1,5 mm lateral höger till mittlinje och 1, 5 mm främre till lambda, referenselektrod (somatosensorisk cortex) 2,6 mm lateral höger till mittlinjen och 0,7 mm bakre till bregma. Markera också positionen för tre underhållsskruvar (som fungerar som ankare mellan skallen och dentalcement för att stelna huvudmontage) på vänster halvklot utan några specifika koordinater, men så avlägsna som möjligt från varandra och från ECoG-elektroderna.</li>
	<li>Genomborra försiktigt skallen i de andra elektrodernas och ankarskruvens markerade läge med borrkroden på 0,7 mm. Genomborra i en riktning vinkelrätt mot skallytan för varje skruv (dvs. vertikal axel för den bakre elektroden men med en vinkel från den vertikala axeln för andra platser). Tvätta den genomborrade skallen med en 10% providone-jodlösning och blockera hålen med små, rullade bitar av känsliga uppgiftstorkare innan du installerar skruvarna för att förhindra blödning och förorening.</li>
	<li>Använd de raka Kelly-tångarna, skruva underhållsskruvarna på vänster halvklot och skruva sedan de två sista elektroderna på höger halvklot. Se till att skruva med samma vinkel som hålen genomborrades och att lämna minst 2,5 mm av varje skruv ur skallen (Figur 1D). OBS: För att maximera soliditeten i det slutliga montage och kvaliteten på de elektrofysiologiska signalerna, var försiktig så att du inte vidrör någon skruv när du installerar nästa.</li>
	<li>Placera några små droppar tandcement i mitten av det ringliknande utrymmet inuti skruvarna. Sätt in den böjda änden av en EMG-elektrod (beredd i steg 1.1.2) cirka 1-2 mm i nackmusklerna genom att hålla den böjda änden med Dumont #5 tång och lyfta huden över musklerna med extra fina Graefe-tångar. Placera sedan den böjda sidan och armbågen på elektroden i tandcementet; upprepa för den andra EMG-elektroden. OBS: Den raka änden av den längre EMG-elektroden bör riktas mot den främre ECoG-elektroden och den kortare EMG-elektroden med den bakre ECoG-elektroden. Se till att de två EMG-elektroderna inte vidrör varandra eller någon av skruvarna.</li>
	<li>Täck mössens ögon och applicera ljus i 3-5 minuter för att hjälpa cement stelnad. När EMG-elektroderna håller fast, täck basen på ECoG-elektroderna och basen på ankarskruvarna med dental cement för att bilda en kronformad kontur. Täck mössens ögon och applicera ljus i 3-5 minuter för att hjälpa cement stelnad. OBS: Applicera inte cement på ECoG- och EMG-elektrod extremiteterna (guldtråd som kommer att lödas till kontakten) eller på huden.</li>
	<li>Fyll mitten av montage med tidigare blandad akrylcement. Under cement stelning, ta bort de fyra kirurgiska klämmorna som håller huden (och tvätta dessa omedelbart med känsliga uppgiftstorkare). OBS: Applicera inte cement på ECoG- och EMG-elektrod extremiteterna (guldtråd som kommer att lödas till kontakten) eller på huden.</li>
	<li>Suturera huden baktill och framsidan av montage så att skallen inte exponeras (men undvik att sträcka huden för mycket) med en suturnål (13 mm 3/8 c) och syntetisk absorberbar monofilament.</li>
	<li>Håll kontakten ovanför montage med böjda tångar och rikta försiktigt in elektrodernas guldtråd med kopplingsstiften. Lödselektrod extremiteter till anslutningsstift med lödkolpjärnet. OBS: Undvik snabbt överhettning och skador på den kortikala vävnaden. Se till att varje elektrod har god kontakt med motsvarande kopplingsstift och att elektroderna inte är anslutna till varandra.</li>
	<li>Ta bort musen från stereotaxiska ramen. Täck det tomma utrymmet mellan kontakten och huvudet med tidigare blandat akrylcement genom att täcka alla anslutningar mellan elektroder och kopplingsstift. OBS: Undvik cementinfiltration inuti kontakten genom att hålla musen med kontakten ovanför huvudet (huvudet rakt inte lutande).</li>
	<li>Väg musen och placera den i en ren bur (helst utrustad med ett icke-maskat lock) på en värmedyna (individuellt hölje för att undvika skador på huvudmontage). Övervaka djuret regelbundet och administrera 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant vid uppvaknande och 12 timmar senare om djuret visar tecken på smärta (t.ex. onormal hållning, kisade ögon). OBS: Viktökning i förhållande till vikten före operationen bör inte överstiga 1,5 g.</li>
</ol>4. Inspelningar
<ol><li>Husmöss individuellt för att undvika skador på huvudmontage som ett resultat av ömsesidig grooming samt skador och förveckling av inspelningskablarna. Obs: För detta protokoll var möss inrymda med ad libitum tillgång till mat, vatten och en trä kub, och daglig övervakning genomfördes.</li>
	<li>Anslut mössen till inspelningskablarna 2 veckor efter operationen för anpassning till kabeldragningsförhållanden.</li>
	<li>Registrera ECoG/EMG-signaler i 24 timmar (eller längre/kortare beroende på forskningsfrågor). OBS: ECoG/EMG-signalinspelningen uppnåddes med hjälp av en kabel, en svängbar kontakt (för att möjliggöra rotation av kabeln), en 36-kanalig bärbar låda och en förstärkare, som var ansluten till en dator. Signaler provtas vid 256 Hz (eller mer beroende på forskningsfrågor) och registreras med kommersiell programvara (se materialförteckningen). För att säkerställa tillräckligt viralt uttryck bör experiment göras minst 3 veckor efter AAV- injektion, enligt beskrivningentidigare 29,37.</li>
	<li>Efter registrering, offra mössen genom livmoderhalscancer förskjutning (eller andra metoder beroende på immunostaining protokollet) och skörda hjärnan för immunstaining.</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll beskriver en exakt och enkel metod för att övervaka ECoG och EMG aktivitet under manipulering av molekylära mål med hjälp av AAV. För adekvat jämförelse mellan grupper rekommenderas det starkt att alltid planera kirurgiska ingrepp (AAV- injektion och elektrodimplantation) samma dag för test- och kontrolldjur och att registrera deras elektrofysiologiska signaler samtidigt. För att få liknande virusuttryck mellan test- och kontrolldjuren är det önskvärt att injicera samma virala titer. I förevarande fall hade viral titer av kontroll AAV minskats till hälften av testet AAV för att säkerställa liknande virala uttryck. Försöksarbetare bör vara mycket försiktiga med mätningar av stereotaxiska koordinater för att säkerställa låg variation mellan djur i hjärnans område/närskiktsinriktning. Med tanke på att injektionsdjupet beräknas från skallens yta och att skalltjockleken varierar med ålder och kön, bör dessutom kanylens placering alltid kontrolleras med hjälp av histologi efter protokollet eller immunohistokemi (t.ex. figur 2) för att säkerställa adekvat positionering/injektionsdjup, och stereotaxiska koordinater bör justeras vid behov. Under hela 40-minuters AAV-injektionen är det mycket viktigt att övervaka injektionshastigheten för att snabbt upptäcka och korrigera potentiella problem som pumpblockering. Vissa experimentella steg är också avgörande för att få optimala elektrofysiologiska signaler. Till exempel, överskruva inte under elektrodimplantation; skruvar bör sticka ut ur skallen med minst 2,5 mm för att minimera skador på hjärnbarken och bildandet av ett gliaärr. Efteråt är det också oerhört viktigt att i) undvika att applicera cement på elektrodernas extremiteter, ii) säkerställa en snabb lödning av elektroderna till kontakten, och iii) se till att det inte finns någon kontakt mellan elektroderna.
Förfarandet som presenteras här för ECoG- och EMG-inspelning är extremt väletablerat, enkelt och används ofta för att övervaka vakenhet och sömn hos möss2,11,13,34. Kontinuerliga ECoG- och EMG-inspelningar kan utföras under flera på varandra följande dagar (och till och med veckor) och generera en mycket rik datauppsättning som kan användas för att utföra flera analyslinjer som omfattar variabler relaterade till vakenhet och sömnmängd ocharkitektur 2,11,12 (t.ex. tid som spenderas i olika tillstånd per ljusa och mörka perioder, antal episoder av varje stat, 24-h fördelning av sömn), vakenhet och sömnspektralainnehåll 34,41 (t.ex. effekt i olika frekvensband [liknande figur 3], skalfri aktivitet) och egenskaper hos enskildavågor 42,43,44 (t.ex. långsam våg amplitud och lutning). När det används i kombination med AAV-medierade molekylära manipuleringar är en ytterligare fördel att undvika potentiell utvecklingskompensation som kan uppstå hos transgena djur. Med övning kan hela proceduren, inklusive 40-minuters AAV-injektion, utföras på cirka 90 minuter. Dödligheten bör vara (mycket) låg eftersom operationen är minimalt invasiv.
Samtidig användning av ECoG / EMG-inspelning och riktad manipulation med AAV erbjuder en mängd andra fördelar och applikationer. Till exempel är precisionen i stereotaxisk inriktning, när den utförs på ett adekvat sätt, mycket hög och reproducerbar och är användbar för att bestämma den specifika rollen för en viss hjärnregion (och/eller en celltyp eller ett molekylärt element inom regionen) vid reglering av sömn eller andra fysiologiska processer. Flera olika närområden kan därför enkelt riktas med hjälp av anpassningar av det nuvarande protokollet. Dessutom kan målmanipulationer med hjälp av AAV riktas till ett när-/subkortikalt område som skiljer sig från ECoG-inspelningsplatserna. I sådana fall kan gradhålet för AAV-injektion täckas av ett litet glaslock fixerat med dental cement (eller benvax). För förbättrad specificitet innehåller AAV-konstruktionen ofta en promotor som möjliggör riktad infektion av en exakt celltyp14. En CamKIIα promotor användes i det nuvarande protokollet för att specifikt rikta excitatoriska pyramidalaceller 14,29,45av motor cortex. Denna strategi har möjliggjort inaktivering av cofilin (med hjälp av cofilinS3D)32,33 i excitatoriska nervceller i motorbarken och observation av tillståndsspecifika förändringar i ECoG-aktivitet ( Figur3). För att bedöma infektion/transduktion effektivitet, framtida protokoll användare kan kombinera det presenterade AAV-ECoG protokollet med en av co-staining av immunofluorescence, och använda hög förstoring bilder för att beräkna antalet celler som visar dubbelmärkning av det totala antalet celler som visar en märkning av målet (här CaMKIIα-uttrycker nervceller). I en ny studie användes en AAV-ECoG-metod som liknar den som beskrivs här för att överuttrycka bräckligt X utvecklingsstörningssyndromrelaterat protein 1 (FXR1) i alla nervceller i motorbarken med hjälp av en AAV som innehåller en synapsinpromotor och visade en effekt av denna manipulation på vaksamhetstillståndfördelning och spektralinnehåll28. Dessa resultat illustrerar hur manipulera en viss molekyl i en målhjärnregion med hjälp av AAV kan avslöja roller i regleringen av specifika vakenhet / sömn parametrar.
En begränsning av det beskrivna protokollet är den lilla lesion av hjärnvävnad som uppstår med kanyl placering innan utföra AAV injektion, som också kan åtföljas av ett inflammatoriskt svar. Detta kan vara särskilt oroande när du utför AAV injektion i subkortikala områden och bör alltid hanteras med hjälp av lämpliga kontroller. Alternativt kan det nuvarande protokollet följas av kvantifiering av reaktiv gliosis och/eller mikroglial aktivering (t.ex. med hjälp av immunofluorescens) för att säkerställa liknande nivåer i kontroll- och testgrupper och därmed på ECoG-avläsningen. En andra begränsning gäller risken för dålig anslutning mellan en elektrod och kontakten, vilket kan resultera i en kontinuerligt eller ibland dålig elektrofysiologisk signal. Fast skruvade, lödda och cementerade elektroder minimerar förekomsten av detta problem. En tredje begränsning är relaterad till djur som tjudrars via huvudmontage under inspelningen, vilket kan begränsa rörelse och andra beteenden, åtminstone i viss utsträckning, och ibland resultera i kabelskador och signalförlust. Slutligen är det presenterade protokollet mer lämpligt för vuxna möss, med tanke på att skallstorleken hos yngre djur kan orsaka svårigheter att installera det avbildade huvudmontaget, som beskrivits tidigare2.
Kombinerad ECoG/EMG-inspelning och AAV-medierad manipulering av ett exakt mål är också tillämpligt på andra forskningsområden än sömnens neurovetenskap. Bland annat kan det användas för att studera och manipulera epileptiska händelser i djurmodeller av anfall och är ett kraftfullt verktyg för att modulera hjärnoscillationer som är involverade i minneskodning och konsolidering46,47. Följaktligen omfattar potentiella tillämpningar verkligen områdena grundforskning inom psykiatri och neurologi, inklusive neurodegenerativa sjukdomar. Förutom förmågan att uttrycka en inaktiv form av en molekyl kan och har AAV använts för att överuttrycka eller nedreglera (t.ex. små störande RNA, CRISPR/Cas9) eller för att rädda uttrycket av en molekyl i en helkropps KO. Viktigt är att den dubbla metoden i det nuvarande protokollet också är tillämplig på andra däggdjursarter som råttor och dagliga gnagare som representerar intressanta modeller för att förstå både sömn och neurodegeneration48,49.

Elektroencefalografiska (eller i allmänhet elektrokortikografiska [ECoG] hos gnagare) och elektromyografiska (EMG) inspelningar används i stor utsträckning i sömnforskning samt mer allmänt inom neurovetenskap, neurologi och psykiatri. I kombination möjliggör dessa elektrofysiologiska signaler identifiering av vaksamhetstillstånd och efterföljande kvantifiering av tillståndstid och spektralsammansättning, både hos människor och gnagare1,2,3,4. Sådan kvantifiering har varit användbar för att förstå hur sömn modifieras i patologiska tillstånd som neurodegenerativa sjukdomar och modellerna5,6,7 ellergenom genetisk modifiering8,9. Till exempel visades knockout (KO) av olika gener kopplade till neuronal kommunikation ändra varaktigheten av vakenhet och sömn i både musen ochfruktflugan 10,11,12,13. För att hantera potentiell utvecklingskompensation som härrör från studier av helkropps KO hos gnagare och för att möjliggöra en finare kontroll av genetisk manipulering är ett effektivt sätt att manipulera genuttryck att använda adeno-associerade virus (AAV). En AAV-medierad genetisk manipulation kan användas för att ned- eller uppreglera ett givet molekylärt mål och för att begränsa manipuleringen till en specifik cellpopulation med hjälp av olika typer avpromotors 14. AAV används också i stor utsträckning som leveransmetod i de klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR)/Cas9-teknik15,16. Dessa metoder möjliggör bättre tidsmässiga och rumsliga kontroll av genetisk manipulation, som i allmänhet är associerad med uttrycket av en reporter tillåter kvantifiering av det infekterade området med hjälp av immunofluorescens.
AAV representerar också huvudvektorn för celltypspecifika manipuleringar av neuronal aktivitet via optogenetik och kemogenetik17,18,19, som har använts i stor utsträckning i ny forskning om neurodegenerativa sjukdomar, beteende, kognition och sömn20,21,22. I sömnforskning har tillämpningen av optogenetik för aktivering eller hämning av vissa hjärnregioner, såsom basalt förhjärna, hypotalamus och sublaterodorsaltegmentum, varit användbar för att bestämma deras roller i kontrollen av upphetsning, långsam vågsömn (även känd som icke-snabb ögonrörelsesömn), paradoxal sömn (eller snabb ögonrörelsesömn) och kataplexi23, 24,25. Dessutom har AAV-medierade manipuleringar hjälpt till att belysa viktiga sömnreglerande kretsar och molekyler som bidrar till de negativa effekterna av sömnförlust26,27,28. Till exempel är ett protein som visat sig vara inblandat i sömnbrist-inducerad minnesförsämring cofilin29,30. Detta protein är ett filamentöst aktinsnedskiljande protein som deltar i omorganiseringen av aktinfilament genom att fysiskt binda till aktin och främja demonteringen av glödtrådarna på ett dynamiskt sätt31. Hämma kofilinaktivitet med hjälp av en AAV-medierad metod visade sig förhindra ryggradsförlust samt synaptisk plasticitet och minnesunderskott inducerade av sömnbrist hos möss29. Sammantaget betonar dessa studier nyttan och relevansen av AAV-medierade manipuleringar för att förstå sömnreglering och konsekvenserna av sömnbrist hos gnagare.
Här beskrivs ett protokoll som kombinerar ECoG och EMG elektrod implantation och inspelning med manipulering av cofilin funktion i en hjärnbark område av vilda typer (WT) möss med hjälp av en AAV. Mer exakt injiceras en AAV (serotyp 9) som uttrycker kodningssekvensen av en fosfomimetisk form av muskofilin (cofilinS3D),vilket gör den inaktiv32,33, i motorbarken (M1 och M2). En ECoG-elektrod implanteras direkt på injektionsstället för att säkerställa registrering av de infekterade cellernas synkroniserade kortikala aktivitet. ECoG/EMG-registreringen utförs i 24 timmar under ostörda förhållanden tre veckor efter operationen för att möjliggöra återhämtning, anpassning och hög cofilinS3D-uttryck. Registreringen används sedan för identifiering av vaksamhetsstater och ECoG-spektralanalys, enligt beskrivningen i tidigarestudier 11,34. Denna metodik kan specifikt avslöja hur när cofilin modulerar vakenhet och sömn ECoG signaler hos möss. Denna kombination av elektrofysiologiska inspelningar och AAV-medierad genetisk manipulation är särskilt relevant för att undersöka olika molekylära elements roller i specifika hjärnfunktioner och kan tillämpas på när (och subkortikala) hjärnområde av intresse för WT och genetiskt modifierade möss av båda könen och till och med andra arter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Användningen av elektrokortektiska (ECoG) inspelningar hos gnagare är relevant för sömnforskning och för studier av ett brett spektrum av neurologiska tillstånd. Adeno-associerade virus (AAV) används alltmer för att förbättra förståelsen för hjärnkretsar och deras funktioner. AAV-medierad manipulering av specifika cellpopulationer och/eller exakta molekylära komponenter har varit oerhört användbar för att identifiera nya sömnreglerande kretsar/molekyler och viktiga proteiner som bidrar till de negativa effekterna av sömnförlust. Till exempel förhindrar hämmande aktivitet hos filamentösa aktin-avskiljande protein cofilin med hjälp av AAV sömnbrist-inducerad minnesförsämring. Här beskrivs ett protokoll som kombinerar manipulering av cofilin funktion i ett hjärnbark område med registrering av ECoG verksamhet för att undersöka om när cofilin modulerar vakenhet och sömn ECoG signaler. AAV injektion utförs under samma kirurgiska ingrepp som implantation av ECoG och elektromyographic (EMG) elektroder i vuxna manliga och kvinnliga möss. Möss bedövas och deras huvuden rakas. Efter hudrengöring och snitt bestäms stereotaxiska koordinater för motorbarken, och skallen genomborras på denna plats. En kanyl förfylld med en AAV som uttrycker cofilinS3D, en inaktiv form av cofilin, placeras långsamt i den närvävnaden. Efter AAV-infusion skruvas guldtäckta skruvar (ECoG-elektroder) genom skallen och cementeras till skallen med guldtrådar insatta i nackmusklerna (EMG-elektroder). Djuren får tre veckor på sig att återhämta sig och för att säkerställa ett tillräckligt uttryck för cofilinS3D. Det infekterade området och celltypen verifieras med immunohistokemi, och ECoG analyseras med hjälp av visuell identifiering av vaksamhet tillstånd och spektral analys. Sammanfattningsvis tillåter detta kombinerade metodologiska tillvägagångssätt undersökningen av det exakta bidraget från molekylära komponenter som reglerar neuronal morfologi och anslutning till reglering av synkroniserad hjärnbarkaktivitet under vakenhet och sömn.

Efter elektrofysiologiska inspelningar används immunofluorescens för att definiera det område som infekterats av AAV- injektionen och för att validera uttrycket av cofilinS3D (figur 2). Immunostaining kan utföras med en metod som liknar vad som har beskrivits tidigare29,37,38,39. AAV uttrycker en inaktiv form av cofilin smält med en hemagglutinin (HA)-Tag (cofilinS3D-HA), som detekteras av immunofluorescens med hjälp av en anti-HA antikroppar och en sekundär antikropp (Alexa Fluor 488). De infekterade excitatoriska nervcellerna (här, riktade mot en kalcium/calmodulin-beroende proteinkinas II alfa [CamKIIα] promotor som styr uttrycket av transgenen i AAV) är färgade med anti-HA antikroppar. En lyckad infektion indikeras av färgningen av nervcellerna i motorbarken som omger injektionsstället (Figur 2A,B). I detta representativa exempel visade hjärnbarken på den andra halvklotet inte någon märkbar färgning. Ändå, med tanke på att excitatoriska nervceller kan projicera till avlägsna hjärnområden, färgning i kontralateral halvklotet är inte nödvändigtvis en indikation på misslyckad injektion. Högre förstoring av det infekterade området visade färgning av cellkroppar och projektioner, vilket bekräftar att endast specifika celler i det riktade närområdet var smittade (figur 2C).
Samfärgning med markörer för excitatoriska nervceller (t.ex. fordonsglutamattransportör 1, CaMKIIα) kan också utföras för att validera celltypsspecifikitet. Alternativt kan samfärgning med markörer av hämmande nervceller eller astrocyter utföras om dessa celler är riktade med olika promotors. Samfärgning av cofilinS3D-HA och CaMKIIα utfördes också i samma djur för ett område som är mer bakre till injektionsstället som fortfarande visade anti-HA-färgning i motorbarken (Figur 2D). Områdets högre förstoringsbild visar celler som tydligt uttrycker cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, figur 2E)och CaMKIIα (Alexa Fluor 568, figur 2F). Superpositionen av cofilinS3D-HA och CaMKIIα färgning visar att de flesta (om inte alla) celler som färgats för cofilinS3D-HA också är positiva för CaMKIIα (Figur 2G). Denna observation stöder infektionens specificitet för excitatoriska nervceller.
För att bedöma effekten av cofilinmanipulation på ECoG-aktivitet används ECoG- och EMG-signaler för att utföra en visuell identifiering av vaksamhets tillstånd (vakenhet, långsam vågsömn, paradoxal sömn). Detta görs på 4-s epoker på grund av den snabba förändringen i vaksamhetstillstånd imusen 2, och här, för en fullständig 24-h inspelning. Standardanalyser inkluderar beräkning av sömnarkitektur och spektralanalysvariabler, som tidigare utförts för olikadatamängder 11,12,13,28,34. I synnerhet kommer spektralanalysen av ECoG-signalen från de olika staterna att indexera tillståndets sammansättning och kvalitet. För att avlägsna skillnader som kan uppstå, till exempel från olika djup hos elektroderna, kan spektralanalysdata uttryckas i förhållande till den totala kraften hos alla tillstånd hos ett visst djur (figur 3A). Med tanke på den mycket låga relativa amplituden av ECoG-aktivitet i högre frekvenser, relativ effektspektra för vakenhet, långsam vågsömn och paradoxal sömn har loggtransformerats för att mer adekvat visualisera och samtidigt jämföra aktiviteten i låga och höga frekvenser. Denna analys visar på tillståndsspecifika skillnader i spektralaktivitet under förhållanden med inaktivering av samfilin(figur 3B). Mer exakt påpekar dessa preliminära resultat som kombinerar manliga och kvinnliga möss att inaktivering av cofilin avsevärt ökar spektralkraften i snabba frekvenser (14-30 Hz) under vakenhet och i långsamma frekvenser (1-4 Hz) under paradoxal sömn, samtidigt som ECoG-aktivitet under långsam vågsömn huvudsakligen inte påverkas. Dessutom verkar inaktiveringen av samfilin öka variationen mellan musen i ECoG-aktiviteten (särskilt märkbar från felstaplar för vakenhet i figur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Figur 1: Förberedelse av ECoG/EMG-montagekomponenter och representativt exempel på ECoG-elektrodplacering. a)En ECoG-elektrod: en 4 mm lång guldtråd med diametern 0,2 mm (oisolerad) smälts på huvudet på en guldtäckt skruv (1,9 mm huvuddiameter, 1,14 mm gänga med större diameter, 3,6 mm total längd) med blyfri lödning. (B) EMG-elektroder: två guldtrådar (1,5 och 2 cm) är böjda för att omfamna skallens kurva upp till nackmuskeln, och den andra änden hålls rak för att lödas till kontakten. (C) En 6-kanalig kontakt: blyfri lödning tillsätts till 5 av de 6 metallstiften (om man utelämnar en i mitten) på kontakten (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metallstift). Toppen av kontakten är täckt med tejp för att undvika skräp / vatteninfiltration. D)Exempel på placering av de tre underhållsskruvarna på skallen på vänster halvklot och av de tre ECoG-elektroderna (inklusive en referenselektrod) på höger halvklot. De exakta stereotaxiska koordinaterna för ECoG-elektroderna anges i steg 2.6 och 3.2 och har beräknats beroende på placeringen av knägma och lambda (som indikeras av de gula prickarna). Förkortningar: ECoG = elektrocorticographic; EMG = elektromyografisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Figur 2: Representativ immunostaining för att definiera det AAV-infekterade området och celltypen. (A) Schematisk representation som visar injektionsstället för koronalskivan som presenteras i panel B. Positionen är 1,1 mm främre till bregman, och kanylen (visas i rött) riktades mot lager V av rätt primärmotorbark (M1). Representation modifierad från Franklin och Paxinos40. (B) Immunostaining av HA för att upptäcka cofilinS3D-HAuttryck i nervceller visas för en korona skiva av hela hjärnan ligger cirka 1,1 mm främre till bregma. Det infekterade området lokaliserar huvudsakligen till lager V och VI (infragranära lager) av rätt primära och sekundära motor cortices (M1 och M2). Skalstång = 500 μm. Fyrkanten representerar det område som visas i C. (C) Högre förstoring av det infekterade området som visar färgning av infekterade celler och bekräftar uttryck av cofilinS3D-HA i djupare lager av motorbarken. Skala stång = 100 μm. (D) Co-immunostaining av HA och CaMKIIα för att bedöma celltyp-specificitet som visas för en korona skiva av den högra halvklotet ligger cirka 0,5 mm främre till bregma och därför bakre till injektionsstället (samma mus som i panelerna B och C). Det infekterade området lokaliserar till motor cortices (M1 och främst M2). Skalstång = 500 μm. Fyrkanten representerar det område som visas i E, F och G. (E) Högre förstoring av det infekterade området som visar färgning av infekterade celler och bekräftar uttryck för cofilinS3D-HA. Skalstång = 100 μm. (F) Högre förstoring av det infekterade området som visar färgning av CaMKIIα-positiva celler. Skala stång = 100 μm. (G) Högre förstoring av det infekterade området visar sammärkning av cofilinS3D-HA och CaMKIIα, bekräftar att infekterade celler är CaMKIIα-positiva. Skalstång = 100 μm. Förkortningar: AAV = adeno-associerat virus; M1 = primär motorisk cortex; M2 = sekundär motorisk cortex; CPu = caudat putamen (striatum); LV = lateral ventrikel; HA= hemagglutinin; CamKIIα = kalcium/kalmodulinberoende proteinkinas II alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Figur 3: Representativt maktspektra för vakenhet, långsam vågsömn och paradoxal sömn som erhållits efter viral manipulering av cofilinfunktion. Hane (n = 5 per grupp) och honmöss (n = 2 per grupp) injicerade med AAV9-CaMKIIα0,4-cofilinS3D-HA (viral titer 2,58 × 1013 GC/ml) eller med kontroll AAV (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1.25 × 1013 GC/mL; hälften av testtitern att styra för den förbättrade signalen för denna kontroll AAV) i lager V av motorbarken registrerades i 24 timmar, och den elektrocorticographic signalen utsattes för spektral analys (snabb Fourier Transform för att beräkna spektral effekt mellan 0,5 och 30 Hz med en 0,25-Hz upplösning). A)Maktspektra under de tre vaksamhetsstaterna uttryckt i förhållande till alla staters totala makt. B)Relativ effektspektraloggtransformerad för att på ett mer adekvat sätt representera gruppskillnader i högre frekvenser. Undertryckandet av cofilinaktivitet i motorbarken med hjälp av AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA ökar elektrokortikologisk aktivitet avsevärt i betaområdet (14-30 Hz) under vakenhet, och i deltaområdet (1-4 Hz) under paradoxal sömn i jämförelse med kontrollinjektioner (röda linjer ovanför x axlar indikerar Mann-Whitney U-testpå frekvensbandseffekt p < 0,05). Förkortningar: AAV = adeno-associerade virus GC = genomkopior; HA= hemagglutinin; CamKIIα = kalcium/kalmodulinberoende proteinkinas II alfa; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Denna artikel beskriver ett protokoll för manipulering av molekylära mål i hjärnbarken med hjälp av adeno-associerade virus och för övervakning av effekterna av denna manipulation under vakenhet och sömn med hjälp av elektrocorticographic inspelningar.

Elektrokortatisk inspelning av hjärnbarkområden manipulerade med hjälp av ett Adeno-associerat virus som riktar sig mot cofilin hos möss

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Detta protokoll kan användas för att identifiera rollen av specifika enskilda molekylära mål i regleringen av elektrocorticographic aktivitet under olika Vigilin stater. Bland fördelarna med att använda adeno-associerade virus är förmågan att exakt rikta in sig på en viss hjärnregion och en specifik celltyp. Julien Dufort-Gervais, en forskare från mitt team, demonstrerar protokollet.Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nyp reflex i en bedövad 12 veckor gammal mus, använd en hårtrimmer för att raka håret från baksidan av öronen till framsidan av huvudet mellan ögonen. Tillsätt en generös droppe oftalmisk salva till varje öga för att förhindra uttorkning och använd öronstängerna för att försiktigt fixera musens huvud på en stereotaxisk apparat. Dra försiktigt ut tungan ur munnen för att undvika kvävning.Fäst musens näsa på apparaten och använd 70 % etanol för att sterilisera den exponerade huden på huvudet. Håll huden med extra fina Graefe-tångar, använd vävnadssax för att skära huden från öronens botten till ögonnivån och placera två kirurgiska klämmor på varje sida av snittet för att sträcka huden och exponera skallen. Undvik hjärnsuturer, använd en saxspets för att skrapa skallytan för att ta bort periosteum och för att skapa överlappande streck i två eller flera riktningar.Använd 70% etanol för att ta bort benfragmenten och desinficera skallen. Med en tidigare förberedd kanyl fastsatt på stereotaxiska armen, identifiera platsen för bregma och lambda och notera de stereotaxiska koordinaterna för var och en. Använd den stereotaxiska armen och en penna för att markera kanylens position på skallen 1,5 millimeter lateralt ända till mittlinjen och 1,5 millimeter främre bregman.Använd en borrkrona på 0,7 millimeter, genomborra försiktigt skallen i den markerade positionen vinkelrätt mot skallytan och rikta in den vertikala axeln och tvätta skallen med en steril bomullsspets indränkt i en 10%betadinbavidonejodlösning och dra sedan tillbaka kolven på en 10 mikroliter spruta med en mikroliter för att ladda kanylen med en en mikroliter luftbubbla. Blanda sedan AAV-blandningen av intresse med långsam pipetting och tillsätt 1,7 mikroliter av blandningen till en steril Petri-maträtt. Använd denna spruta för att ladda 1,5 mikroliter av lösningen i kanylen och markera luftbubblans läge på det anslutna PE50-röret.Vertikalt rikta kanylen mot hålet i skallen så att kanylen når benets övre kant och markera Z-koordinaten för skallytan. Sänk långsamt kanylen tills spetsen når 1,5 millimeter under skallytan och skikta fem av motorbarken och starta sprutpumpen med en 0,025 mikroliter per minut flöde för att leverera en mikroliter AAV under 40 minuter. Använd luftbubblan i röret för att spåra injektionen och gör eventuella justeringar vid behov.När hela virusvolymen har levererats, lämna kanylen på plats i fem minuter för att säkerställa en tillräcklig diffusion och för att undvika återflöde innan du långsamt och försiktigt lyfter den stereotaxiska armen för att ta bort kanylen från cortex. För elektrodimplantation, använd raka Kelly-tångar för att långsamt skruva en elektrokortatisk elektrod med en rak guldtråd i den vertikala axeln i hålet där AAV injicerades, vilket lämnade minst 2,5 millimeter skruv utanför skallen för att minimera skadorna på duran och hjärnbarken. Använd en penna för att markera referenselektrodens läge 2,6 millimeter lateralt höger till mittlinjen och 0,7 millimeter bakre till knägma och positionen för den bakre elektrokardigrafiska elektroden vid 1,5 millimeters lateral höger till mittlinjen och 1,5 millimeter främre lambda och positionerna för tre underhållsskruvar på vänster halvklot utan några specifika koordinater. men så avlägset som möjligt från varandra och från de elektrokortektroder.Använd borren för att försiktigt genomborra skallen vinkelrätt mot skallytan vid de markerade positionerna hos de andra elektroderna och skruvarna och tvätta den genomborrade skallen med en 10%povidone jodlösning. Blockera hålen med små rullade bitar av delikat aktivitetsservett innan du installerar skruvarna för att förhindra blödning och förorening och använd raka Kelly-tångar för att sätta in skruvarna i borrhålen i samma vinkel som hålen genomborrades. Placera några små droppar tandcement i mitten av det ringliknande utrymmet inuti skruvarna och använd extra fina Graefe-tångar för att lyfta huden ovanför nackmusklerna.Använd Dumont nummer fem tång, håll den böjda änden av en elektromyografisk elektrod och sätt in den ungefär en till två millimeter i musklerna. Placera elektrodens böjda sida och vikpunkt i tandcementet och sätt in den andra elektromyografiska elektroden på samma sätt. Efter att ha täckt djurets ögon, applicera ljus i tre till fem minuter för att stelna cementet och använd ytterligare dental cement för att täcka basen av de elektrokortektroder och ankarskruvarna för att bilda en kronformad kontur.Efter att ha applicerat tre till fem minuter ljus, fyll mitten av montage med akrylcement och ta bort de kirurgiska klämmorna. Använd en syntetisk absorberbar monofilament sutur för att stänga huden fram och bak i montage så att skallen inte exponeras och använd böjda tångar för att hålla kontakten ovanför montage för att försiktigt rikta elektrodernas guldtrådar mot kopplingsstiften och sedan snabbt löda varje elektrod extremitet till en enda motsvarande kopplingsstift. När du har tagit bort musen från ramen, täck det tomma utrymmet mellan kontakten och huvudet med akrylcementet.Och efter vägning, placera musen i en ren bur med ett icke-maskat lock på en värmeplatta. Två veckor efter operationen, anslut mössen till inspelningskablar och minst en vecka senare, spela in elektrokortikografiska och elektromyografiska signaler i 24 timmar eller mer. En framgångsrik infektion bekräftas av HA färgning av nervcellerna inom motor cortex som omger injektionsstället, vilket indikerar förekomsten av cofilin S3D HA. Co-staining med excitatoriska neuron markör CaMKII alfa indikerar klar cofilin S3D HA och CaMKII alfa co-uttryck under hög förstoring.Log transformerade relativa kraftspektra för vakenhet, långsam våg sömn och paradoxal sömn visar tillståndsspecifika skillnader i spektral aktivitet under cofilin inaktivering. Kombinationen av elektrocorticographic inspelning och AAV-medierad manipulation av exakta molekylära mål är också tillämplig på flera hjärnregioner och andra neurovetenskapliga delområden såsom forskning om epilepsi eller minne förutom sömn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionell avbildning av hörselbarken hos vuxna katter med hjälp av hög-fält fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder och Tips för intravenös administrering av Adeno-associerade Virus till råttor och utvärdering av centrala nervsystemet transduktion

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkta intratekal injektion av rekombinant Adeno-associerade virus i vuxna möss

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...