Name: electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice
Uploaded: 2021-02-21T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Çalışma, Kanada Uyku Moleküler Fizyolojisi Araştırma Başkanı tarafından finanse edildi. Yazarlar chloé Provost ve Caroline Bouchard'a teknik yardım için minnettarlar.

Tüm yöntemler Recherche CIUSSS-NIM'nin Comité d'éthique de l'expérimentation animale tarafından onaylanmıştır ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygundur. Bu protokolde kullanılan reaktifler, ekipmanlar ve malzemeler için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Ameliyat hazırlığı
<ol><li>ECoG ve EMG elektrotlarının hazırlanması<ol>
<li>Her hayvan için üç ECoG elektrodu hazırlayın: bir lehimleme demiri kullanarak, altın kaplı bir vidanın vida kapağına küçük bir damla kurşunsuz lehim yerleştirin ve kurşunsuz lehim kullanarak vida kapağının üstüne 4 mm uzunluğunda, 0,2 mm çapında altın tel (yalıtımsız) lehim yerleştirin (Şekil 1A). Altın tel düz olacak şekilde 2 elektrot ve dikeyden 45° açıyla bir elektrot hazırlayın.</li>
		<li>Her hayvan için iki EMG elektrodu hazırlayın: bir adet 0,2 mm çapında altın teli 1,5 cm uzunluğa ve ikincisini 2 cm'ye kesin. Kafatasının eğrisini boyun kaslarına kadar kucaklamak için her iki teli de kavislendirin, konektöre lehimlenecek düz bir uç tutun (Şekil 1B).</li>
		<li>Her hayvan için bir konektör hazırlayın: 6 kanallı bir konektör (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metal pimler) kullanın ve 6 metal pimden 5'ine kurşunsuz lehim ekleyin (bir orta pim atlayarak); Şekil 1C). Çöp veya su sızmasını önlemek için konektörün üstünü bantla örtün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AAV'lerin ve şırınd pompasının hazırlanması<ol>
<li>AAV testini hazırlayın (burada, AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA) ve/veya kontrol AAV (burada, AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) stok AAV karışımını seyrelterek (burada, İstenilen viral titreyi (genellikle 10 12-13 genom kopyası [GC]/mL) ve tedavi edilecek fare sayısı için gerekli hacmi elde etmek için steril salin içeren iyonik olmayan yüzey aktif madde içeren fosfat tamponlu salin çözeltisindeki AAV'ler .%0,001. NOT: Fare başına kortikal alan başına 1 μL enjekte edilen hacim 2 μL hazırlanmasını gerektirir.</li>
		<li>Bir adet 10 μL şırındıcıyı şırınna pompasına sabitlayın ve damıtılmış suyla doldurun.</li>
		<li>Yaklaşık 60 cm uzunluğundaki bir PE50 tüpünü 1 mL şırınga ve 21 G iğne kullanarak damıtılmış su ile doldurun. Daha da önemlisi, doldurduktan sonra 21G iğnesini ve şırıngayı yerinde bırakın. PE50 tüpünü şırınna pompasına bağlayın; PE50 tüpünün bir ucunda 21 G iğne/şırıngayı bırakın ve diğer uc uca 10 μL şırıngaya bağlayın.</li>
		<li>Tüp 10 μL şırıngaya sabitlendikten sonra, diğer ucundaki iğneyi çıkarın ve iğnenin bıraktığı boşluğu suyla doldurmak için 10 μL şırınganın pistonuna itin. NOT: Hava kabarcığı olmadığından ve tüpün tamamen suyla dolu olduğundan emin olun.</li>
		<li>İğnenin çıkarıldığı tüpün ucuna 28 G kanül takın. Suyu tamamen doldurmak için 10 μL şırınna ile kanolaya itin. Canül stereotaksik kola sıkıca sabitlenin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvanların hazırlanması NOT: ~12 haftalık C57BL6/J erkek ve dişi fareler daha önce en az 2 hafta boyunca bireysel kafeslerde barınmaya ve ad libitum yiyecek ve su ile 12-h ışığa ve ahşap bir küpe erişime uyarlanmıştır.<ol>
<li>Fareleri dikkatlice tartın ve anestezi için intraperitoneally ketamin / ksilazin (120/10 mg / kg) karışımı enjekte edin. Derin anestezi için yaklaşık 10 dakika bekleyin.</li>
		<li>Saç düzeltici kullanarak kulakların arkasından başın önüne kadar saçları göz aralarında tıraş edin. NOT: Bıyık kırpma duyusal girişleri ve ECoG aktivitesini35 , 36değiştireceğinden bıyıkları kesmemeye (tıraş sırasında bıyıkları bir parmakla koruyun) çok dikkatli olun.</li>
		<li>Dehidrasyonu önlemek için her göze cömert bir oftalmik merhem damlası ekleyin. İşlem sırasında anestezinin derinliğini arka pençeden bir ayak parmağı sıkıştırarak düzenli olarak doğrulayın. Ayak parmağı sıkışma refleksi ortaya çıkarsa derin anestezi sağlamak için fareye% 0.5-1.5 izofluran sağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Şırındi pompası ile intraortik AAV enjeksiyonu
NOT: Sterilize edilmiş aletlerle ve temiz bir ortamda aşağıdaki adımların tümlerini gerçekleştirin. Sterilize edilmiş aletleri daha fazla yıkamak ve bölüm 1.1'de hazırlanan elektrotların yanı sıra çapa vidalarını (altın kaplı olmayan vidalar) ameliyata başlamadan önce yıkamak için% 70 etanol kullanın.
<ol><li>Farenin başını kulak çubuklarıyla stereotaksik aparat üzerine dikkatlice sabitle. NOT: Başın yanal hareket etmedik den emin olun.</li>
	<li>Boğulmayı önlemek için hayvanın dilini yavaşça ağızdan çekin ve farenin burnunu stereotaksik adaptörle sabitlayın. NOT: İşlem sırasında solunumun sık sık izlenmesi.</li>
	<li>Başın tıraşlı bölgesini % 70 etanol ile sterilize edin ve cildi ekstra ince bir Graefe tokmakları ile tutarak, cildi kulakların tabanından doku makası ile göz hizasına kadar kesin. Cildi germek ve kafatasını ortaya çıkarmak için dört cerrahi kelepçe kullanın (kesiğin her iki tarafında iki tane; bkz. Şekil 1D).</li>
	<li>Kafatası yüzeyini keskin bir makas ucuyla çizin: kemik dikişlerinden kaçınırken periosteumu çıkarın ve iki veya daha fazla yönde üst üste çizgiler oluşturun. Kemik parçalarını çıkarın ve kafatasını% 70 etanol ile kurutun. NOT: Çizilme ve çizgileme, çimentonun kafatasına yapışmasını iyileştirerek kayıt montajının daha sağlam hale yapılmasına yardımcı olacaktır (aşağıya bakın).</li>
	<li>Stereotaksik kola sabitlenmiş olan akül ile bregmanın yerini tanımlayın (yani kafatası koronal ve sagittal dikişler arasındaki kesişim; Şekil 1D) ve lambda (yani, kafatası sagittal dikişi ile sol ve sağ lambdoid dikişi birbirine bağlayan düz bir çizgi arasındaki kesişim; Şekil 1D) ve her birinin stereotaksik koordinatlarına dikkat edin. Bregma ve lambda'nın z koordinatları (dikey eksen) arasındaki fark 0,3 mm'den büyükse, bregma ve lambda'nın z konumu hizalanana kadar stereotaksik adaptörü kullanarak burnun yüksekliğini ayarlayın.</li>
	<li>Kanülün kafatası üzerindeki konumunu bu koordinatlarda bir kalemle işaretleyin (motor korteks): 1,5 mm yanal sağdan orta çizgiye ve 1,5 mm ön bregma. Kafatası yüzeyine dik bir yönde (dikey eksenle hizalanmış) 0,7 mm matkap ucu ile kafatasını makul konumda dikkatlice delin. Delinmiş kafatasını% 10'luk bir providone-iyot çözeltisi ile emprenye edilmiş steril bir pamuk ucu ile yıkayın.</li>
	<li>10 μL şırınna pistonunu 1 μL geri çekerek canülleri 1 μL hava kabarcığı ile yükleyin. Test AAV'yi (burada AAV9-CaMKIIα0.4-CofilinS3D-HA) veya kontrol AAV'yi (burada AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP) daha önce hava kabarcığı ile yüklenen kanüle yükleyin: yavaşça yukarı ve aşağı borulayarak AAV'yi karıştırın, pipet steril bir Petri kabı üzerinde 1.7 μL ve 10 μL şırıngın pistonunu yavaşça çekerek kanülde çözeltinin 1.5 μL'lik kısmını aspire edin. Enjeksiyonun izlenmesine izin vermek için PE50 tüpündeki hava kabarcığı konumunu işaretleyin.</li>
	<li>Kafatasının üst kenarına (yani kafatası yüzeyine) ulaşmak için, canüllerin dikey konumu için, kafatasındaki delik ile hizalayın. Kafatası yüzeyinden, kanülleri yavaşça 1,5 mm düşürün (kafatası yüzeyinin ve motor korteksin V tabakasının 1,5 mm altına ulaşmak için). NOT: Beyin dokusunun gereksiz lezyonunu önlemek için kanülleri çok fazla düşürmemeye çok dikkat edin.</li>
	<li>Şırıng pompasını 40 dakika boyunca 1 μL AAV enjekte etmek için başlatın (doku hasarını en aza indirmek için hız: 0.025 μL/dk). Pe50 tüpündeki enjeksiyonu hava kabarcığı hareketiyle takip edin ve gerekirse ayarlamalar yapın.</li>
	<li>Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, yeterli difüzyon sağlamak ve geri akışı önlemek için çanülleri 5 dakika boyunca yerinde bırakın. Daha sonra, kanülü korteksten çıkarmak için stereotaksik kolu yavaşça ve dikkatlice kaldırın.</li>
</ol>3. ECoG/EMG elektrot implantasyonu
<ol><li>Düz Kelly asaları kullanarak, AAV'nin enjekte edildiği deliğe dikey eksende (deliğin delindiği açı) bir ECoG elektrodını (düz altın tel ile) yavaşça vidalayın. Dura ve serebral korteksin hasar görmesini en aza indirmek için vidanın en az 2,5 mm'ini kafatasının dışında bırakın (yani kafatası yüzeyinden yaklaşık 1,1 mm derinlik için; Şekil 1D).</li>
	<li>Posterior ECoG elektrodunun ve kafatasındaki referans elektrodun konumunu bu koordinatlarda bir kalemle işaretleyin: posterior elektrot (görsel korteks) 1.5 mm yanal sağdan orta çizgiye ve 1.5 mm lambda ön, referans elektrot (somatosensör korteks) 2.6 mm yanal sağ orta çizgiye ve 0.7 mm posterior bregma. Ayrıca, sol yarımküredeki üç bakım vidasının (kafa montajını katılaştırmak için kafatası ve diş çimentosu arasında çapa görevi görerak) belirli bir koordinat olmadan, ancak birbirlerinden ve ECoG elektrotlarından mümkün olduğunca uzak olduğunu işaretleyin.</li>
	<li>Kafatasını diğer elektrotların ve çapa vidalarının işaretli konumunda 0,7 mm matkap ucuyla dikkatlice delin. Her vida için kafatası yüzeyine dik bir yönde delin (yani, arka elektrot için dikey eksen, ancak diğer bölgeler için dikey eksenden bir açı ile). Delinmiş kafatasını% 10'luk bir providone-iyot çözeltisi ile yıkayın ve kanamayı ve kirlenmeyi önlemek için vidaları takmadan önce küçük, yuvarlanmış hassas görev silecekleriyle delikleri tıkayın.</li>
	<li>Düz Kelly kümeslerini kullanarak, sol yarımküredeki bakım vidalarını vidalayın ve sonra sağ yarımküredeki son iki elektrodu vidalayın. Deliklerin delindiği açıyla vidaladığınızla vidaladığınızla ve her vidanın en az 2,5 mm'lik kısmını kafatasının dışında bıraktığından emin olun (Şekil 1D). NOT: Son montajın sağlamlığını ve elektrofizyolojik sinyallerin kalitesini en üst düzeye çıkarmak için, bir sonrakini takarken herhangi bir vidaya dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Vidaların içindeki halka benzeri alanın ortasına birkaç küçük damla diş çimentosu yerleştirin. Dumont #5 önseçimlerini kullanarak kavisli ekstremiteyi tutarak ve cildi ekstra ince Graefe önseçimleriyle kasların üzerine kaldırarak boyun kaslarına bir EMG elektrodunun (adım 1.1.2'de hazırlanmış) kavisli ucunun yaklaşık 1-2 mm'yi yerleştirin. Daha sonra, elektrot kavisli tarafını ve dirseğini diş çimentosunun içine yerleştirin; ikinci EMG elektrot için tekrarlayın. NOT: Uzun EMG elektrodunun düz ucu ön ECoG elektrodu ve daha kısa EMG elektrodu arka ECoG elektrodu ile hizalanmalıdır. İki EMG elektrodunun birbirine veya vidalardan herhangi birine dokunmadığından emin olun.</li>
	<li>Farelerin gözlerini kapatın ve çimento katılaşmasına yardımcı olmak için 3-5 dakika ışık uygulayın. EMG elektrotları sıkıca tutunduktan sonra, taç şeklinde bir kontur oluşturmak için ECoG elektrotlarının tabanını ve çapa vidalarının tabanını diş çimentosu ile örtün. Farelerin gözlerini kapatın ve çimento katılaşmasına yardımcı olmak için 3-5 dakika ışık uygulayın. NOT: ECoG ve EMG elektrot ekstremitelerine (konektöre lehimlenecek altın tel) veya cilde çimento uygulamayın.</li>
	<li>Montajın merkezini önceden karıştırılır akrilik çimento ile doldurun. Çimento katılaşması sırasında, cildi tutan dört cerrahi kelepçeyi çıkarın (ve bunları derhal hassas görev silecekleriyle yıkayın). NOT: ECoG ve EMG elektrot ekstremitelerine (konektöre lehimlenecek altın tel) veya cilde çimento uygulamayın.</li>
	<li>Bir dikiş iğnesi (13 mm 3/8 c) ve sentetik emilebilir monofilament kullanarak kafatasının açıkta kalmaması (ancak cildin çok fazla gerilmesinden kaçınması) için cildi arka ve montajın önüne dikin.</li>
	<li>Konektörü kavisli tokalarla montajın üzerinde tutun ve elektrotların altın telini konektör pimleriyle dikkatlice hizalayın. Lehimleme demiri ile konnektör pimlerine lehim elektrot ekstremiteleri. NOT: Aşırı ısınmayı ve kortikal dokunun zarar görmesini önlemek için hızlı bir şekilde ilerleyin. Her elektrotun ilgili konnektör pimiyle iyi temas ettiğinden ve elektrotların birbirine bağlı olmadığından emin olun.</li>
	<li>Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. Konnektör ve kafa arasındaki boş boşluğu, elektrotlar ve konektör pimleri arasındaki tüm bağlantıları kapatarak daha önce karıştırılmış akrilik çimento ile örtün. NOT: Fareyi başın üstünde konektörle tutarak konektörün içine çimento sızmasını önler (kafa düz eğilmez).</li>
	<li>Fareyi tartın ve bir ısı yastığına (kafa montajının zarar görmesini önlemek için ayrı muhafaza) temiz bir kafese (tercihen mesh edilmemiş bir kapakla donatılmış) yerleştirin. Hayvanı düzenli olarak izleyin ve uyandıktan sonra deri altından 0,1 mg / kg buprenorfin ve hayvan ağrı belirtileri gösterirse 12 saat sonra (örneğin, anormal duruş, şaşı gözler) uygular. NOT: Ameliyat öncesi kiloya göre kilo alımı 1,5 gr'ı geçmemelidir.</li>
</ol>4. Kayıtlar
<ol><li>Karşılıklı tımarın yanı sıra kayıt kablolarının hasar görmesi ve dolaşması sonucu kafa montajının zarar görmesini önlemek için fareleri ayrı ayrı barındırın. NOT: Bu protokol için fareler yiyecek, su ve ahşap bir küp için ad libitum erişimi ile barındırıldı ve günlük izleme yapıldı.</li>
	<li>Kablolama koşullarına uyum sağlamak için fareleri ameliyattan 2 hafta sonra kayıt kablolarına bağlayın.</li>
	<li>ECoG/EMG sinyallerini 24 saat (veya araştırma sorularına bağlı olarak daha uzun/kısa) olarak kaydedin. NOT: ECoG/EMG sinyal kaydı bir kablo, döner konektör (kablonun dönmesine izin vermek için), 36 kanallı giyilebilir kutu ve bilgisayara bağlı bir amplifikatör kullanılarak gerçekleştirildi. Sinyaller 256 Hz'de (veya araştırma sorularına bağlı olarak daha fazla) örneklenir ve ticari yazılımla kaydedilir (Bkz. Malzeme Tablosu). Yeterli viral ifadeyi sağlamak için, deneyler daha önce açıklandığı gibi AAV enjeksiyonundan en az 3 hafta sonrayapılmalıdır29,37.</li>
	<li>Kayıttan sonra, fareleri servikal çıkık (veya immün yetinme protokolüne bağlı olarak diğer yöntemler) ile kurban edin ve immünostaining için beyni hasat edin.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, AAV'ler kullanılarak moleküler hedeflerin manipülasyonu sırasında ECoG ve EMG etkinliğini izlemek için kesin ve basit bir yöntemi açıklar. Yeterli grup arası karşılaştırma için, hayvanları test etmek ve kontrol etmek için cerrahi prosedürlerin (AAV enjeksiyonu ve elektrot implantasyonu) her zaman aynı gün planlanması ve elektrofizyolojik sinyallerinin aynı anda kaydedilmesi şiddetle tavsiye edilir. Test ve kontrol hayvanları arasında benzer viral ifade elde etmek için, aynı viral titrenin enjekte etmesi arzu edilir. Mevcut durumda, benzer viral ifadeyi sağlamak için AAV kontrolünün viral titri test AAV'nin yarısına düşürmüştü. Deneyciler, beyin bölgesi/kortikal tabaka hedeflemesinde düşük hayvan arası değişkenlik sağlamak için stereotaksik koordinatların ölçümlerinde çok dikkatli olmalıdır. Ek olarak, enjeksiyon derinliğinin kafatası yüzeyinden hesaplandığında ve kafatası kalınlığının yaş ve cinsiyete göre değiştiği göz önüne alındığında, yeterli konumlandırma / enjeksiyon derinliği sağlamak için kanülün yerleşimi her zaman protokol sonrası histoloji veya immünhistokimya (örneğin Şekil 2)kullanılarak doğrulanmalı ve gerekirse stereotaksik koordinatlar ayarlanmalıdır. 40 dakikalık AAV enjeksiyonu boyunca, pompa tıkanıklığı gibi olası sorunları hızlı bir şekilde tespit etmek ve düzeltmek için enjeksiyon hızını izlemek çok önemlidir. Optimal elektrofizyolojik sinyaller elde etmek için bazı deneysel adımlar da çok önemlidir. Örneğin, elektrot implantasyonu sırasında aşırı vidalamayın; vidalar, beyin korteksine ve glial skar oluşumuna en az zarar vermek için kafatasından en az 2,5 mm dışarı çıkmalıdır. Daha sonra, i) elektrotların ekstremitelerine çimento uygulamaktan kaçınmak, ii) elektrotların konektöre hızlı bir şekilde lehimlemesini sağlamak ve iii) elektrotlar arasında temas olmadığından emin olmak da son derece önemlidir.
Burada ECoG ve EMG kaydı için sunulan prosedür son derece iyi kurulmuş, basit ve farelerde uyanıklık ve uyku izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır2,11,13,34. Sürekli ECoG ve EMG kayıtları birkaç ardışık gün (ve hatta hafta) boyunca gerçekleştirilebilir ve uyanıklık ve uyku miktarı ve mimari 2,11,12(örneğin, açık ve karanlık dönemler başına farklı durumlarda harcanan süre, her eyaletin bölüm sayısı, Uykunun 24-h dağılımı), uyanıklık ve uyku spektral içeriği34,41 (örneğin, farklı frekans bantlarındaki güç [Şekil 3'ebenzer], ölçeksiz aktivite) ve bireysel dalgaların özellikleri42,43,44 (örneğin, yavaş dalga genliği ve eğim). AAV aracılı moleküler manipülasyonlarla birlikte kullanıldığında, ek bir avantaj transgenik hayvanlarda ortaya çıkabilecek potansiyel gelişimsel telafiden kaçınmaktır. Pratik ile, 40 dakikalık AAV enjeksiyonu da dahil olmak üzere tüm prosedür yaklaşık 90 dakikada yapılabilir. Ameliyat minimal invaziv olduğu için ölüm oranı (çok) düşük olmalıdır.
ECoG/EMG kaydının eşzamanlı kullanımı ve AAV ile hedefli manipülasyon, çeşitli başka avantajlar ve uygulamalar sunmaktadır. Örneğin, stereotaksik hedeflemenin hassasiyeti, yeterince gerçekleştirildiğinde, çok yüksektir ve çoğaltılabilir ve belirli bir beyin bölgesinin (ve/veya hücre tipinin veya bölgedeki bir moleküler elementin) uyku veya diğer fizyolojik süreçlerin düzenlenmesindeki belirli rolünü belirlemek için yararlıdır. Böylece birkaç farklı kortikal alan, mevcut protokolün uyarlamaları kullanılarak kolayca hedeflenebilir. Ayrıca, AAV'ler kullanılarak yapılan hedef manipülasyonları, ECoG kayıt sitelerinden farklı bir kortikal/subkortikal alana yönlendirilebilir. Bu gibi durumlarda, AAV enjeksiyonu için çapak deliği, diş çimentosu (veya kemik cilası) kullanılarak sabitlenmiş küçük bir cam kapakla kaplanabilir. Gelişmiş özgüllük için, AAV yapısı genellikle kesin bir hücre tipinin hedefli enfeksiyonuna izin veren bir promotör içerir14. CamKIIα promotörü, mevcut protokolde özellikle motor korteksin 14,29,45'iniuyarıcı piramit hücrelerini hedeflemek için kullanılmıştır. Bu strateji, motor korteksin uyarıcı nöronlarında cofilin (cofilinS3Dkullanılarak)32,33'ün inaktivasyonunun ve ECoG aktivitesinde duruma özgü değişikliklerin gözlemlenmesine olanak sağlamıştır (Şekil 3). Enfeksiyon/transdüksiyon etkinliğini değerlendirmek için, gelecekteki protokol kullanıcıları sunulan AAV-ECoG protokolünü immünofluoresans ile birlikte boyamadan biriyle birleştirebilir ve hedefin tek etiketlemesini gösteren toplam hücre sayısından çift etiketleme gösteren hücrelerin sayısını hesaplamak için yüksek büyütme görüntüleri kullanabilir (burada, CaMKIIα ifade eden nöronlar). Yeni bir çalışmada, burada açıklanana benzer bir AAV-ECoG yöntemi, bir sinapsin promotörü içeren bir AAV kullanarak motor korteksin tüm nöronlarında kırılgan X mental retardasyon sendromuna bağlı protein 1'i (FXR1) aşırı ifade etmek için kullanıldı ve bu manipülasyonun uyanıklık durumu dağılımı ve spektral içerik üzerindeki etkisini ortaya koydu28. Bu bulgular, AAV'leri kullanarak hedef beyin bölgesindeki belirli bir molekülü manipüle etmenin, spesifik uyanıklık/uyku parametrelerinin düzenlenmesindeki rolleri nasıl ortaya çıkarabileceğini göstermektedir.
Açıklanan protokolün bir sınırlaması, AAV enjeksiyonunu yapmadan önce canül yerleşimi ile meydana gelen küçük beyin dokusu lezyonudur ve buna enflamatuar bir yanıt da eşlik edebilir. Bu, subkortikal alanlarda AAV enjeksiyonu yapılırken özellikle endişe verici olabilir ve her zaman yeterli kontroller kullanılarak ele alınmalıdır. Alternatif olarak, mevcut protokolü, kontrol ve test gruplarında ve dolayısıyla ECoG okumasında benzer seviyeleri sağlamak için reaktif gliozun ve/veya mikroglial aktivasyonun (örneğin, immünofluoresans kullanılarak) ölçülmesi takip edilebilir. İkinci bir sınırlama, bir elektrot ile konektör arasındaki kötü bağlantı riskiyle ilgilidir ve bu da sürekli veya bazen kötü bir elektrofizyolojik sinyale neden olabilir. Katı vidalı, lehimli ve çimentolu elektrotlar bu sorunun görülme sıklığını en aza indirecektir. Üçüncü bir sınırlama, hayvanların kayıt sırasında kafa montajı yoluyla bağlanmasıyla ilgilidir, bu da en azından bir dereceye kadar hareket ve diğer davranışları sınırlayabilir ve bazen kablolama hasarına ve sinyal kaybına neden olabilir. Son olarak, sunulan protokol yetişkin fareler için daha uygundur, genç hayvanların kafatası büyüklüğünün daha önce açıklandığı gibi tasvir edilen kafa montajını kurmada zorluklara neden olabileceği göz önüne alındığında2.
Birleşik ECoG/EMG kaydı ve hassas bir hedefin AAV aracılı manipülasyonu, uykunun sinirbilimi dışındaki araştırma alanları için de geçerlidir. Diğerleri arasında, nöbet hayvan modellerinde epileptik olayları incelemek ve manipüle etmek için kullanılabilir ve hafıza kodlama ve konsolidasyonda yer alan beyin salınımlarını modüle etmek için güçlü bir araçtır46,47. Buna göre, potansiyel uygulamalar kesinlikle nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere psikiyatri ve nörolojide temel araştırma alanlarını kapsamaktadır. Bir molekülün etkin olmayan bir formunu ifade etme kapasitesine ek olarak, AAV'ler aşırı ifade etmek veya küçültmek (örneğin, küçük müdahale eden RNA, CRISPR / Cas9) veya tam vücut KO'sunda bir molekülün ifadesini kurtarmak için kullanılabilir ve kullanılabilir. Daha da önemlisi, mevcut protokolün çift metodolojisi, hem uyku hem de nörodejenerasyon48,49'u anlamak için ilginç modelleri temsil eden sıçanlar ve diurnal kemirgenler gibi diğer memeli türleri için de geçerlidir.

Elektroensefalografik (veya genellikle kemirgenlerde elektrokortikografik [ECoG] ) ve elektromiyografik (EMG) kayıtlar uyku araştırmalarında ve daha geniş anlamda sinirbilim, nöroloji ve psikiyatride yaygın olarak kullanılmaktadır. Birlikte, bu elektrofizyolojik sinyaller, hem insanlarda hem de kemirgenlerde 1 ,2,3,4uyanıklık durumlarının tanımlanmasına ve daha sonra durum süresinin ve spektral bileşimin ölçülmesine izin verir. Bu niceleme, nörodejeneratif hastalıklar ve modeller 5 ,6,7 veya genetik modifikasyon8,9gibi patolojik koşullarda uykunun nasıl değiştirildiğini anlamak için yararlıolmuştur. Örneğin, nöronal iletişime bağlı farklı genlerin nakavtının (KO) hem fare hem de meyve sineği 10 , 11 ,12,13'teuyanıklık ve uyku süresini değiştirdiği gösterilmiştir. Kemirgenlerde tam vücut KO çalışmasından kaynaklanan potansiyel gelişimsel telafi ile mücadele etmek ve genetik manipülasyonun daha iyi kontrol etmesini sağlamak için, gen ekspresyonunun etkili bir yolu adeno ilişkili virüsler (AAVs) kullanmaktır. AAV aracılı bir genetik manipülasyon, belirli bir moleküler hedefi aşağı veya yukarı yönlü olarak kontrol etmek ve farklı türdeki organizatörler kullanarak manipülasyonu belirli bir hücre popülasyonuyla kısıtlamak için kullanılabilir14. AAV'ler ayrıca kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlarda (CRISPR)/Cas9 teknolojisi15,16'dabir teslimat yöntemi olarak da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu metodolojiler, genellikle immünofluoresans kullanarak enfekte bölgenin niceliğine izin veren bir muhabirin ifadesiyle ilişkili olan genetik manipülasyonun daha iyi zamansal ve mekansal kontrolüne izin verir.
AAV'ler ayrıca nörodejeneratifhastalıklar, davranış,biliş ve uyku 20 ,21,22ile ilgili son araştırmalarda yaygın olarak kullanılan optogenetik ve kemogenetik17 , 18,19yoluyla nöronal aktivitenin hücre tipine özgü manipülasyonları için ana vektörü temsileder. Uyku araştırmalarında, bazal ön beyin, hipotalamus ve sublaterodorsal tegmentum gibi belirli beyin bölgelerinin aktivasyonu veya inhibisyonu için optogenetik uygulanması, uyarılma, yavaş dalga uykusu (hızlı olmayan göz hareketi uykusu olarak da bilinir), paradoksal uyku (veya hızlı göz hareketi uykusu) ve katapleksi23, 24,25. Ayrıca, AAV aracılı manipülasyonlar, uyku kaybının olumsuz etkilerine katkıda bulunan önemli uyku düzenleyici devrelerin ve moleküllerin aydınlatilmesine yardımcı oldu26,27,28. Örneğin, uyku yoksunluğuna bağlı hafıza bozukluğuna karıştığı gösterilen bir protein cofilin29,30 'dur. Bu protein, aktisin filamentlerinin fiziksel olarak bağlanarak ve filamentlerin dinamik bir şekilde sökülmesi teşvik ederek yeniden düzenlenmesine katılan filamentli bir aksin kesen proteindir31. AAV aracılı bir yaklaşım kullanılarak cofilin aktivitesinin engellenmesinin, farelerde uyku yoksunluğunun neden olduğu sinaptik plastisite ve hafıza açıklarının yanı sıra omurga kaybını önlediği gösterilmiştir29. Toplu olarak, bu çalışmalar uyku düzenlemesini ve kemirgenlerde uyku yoksunluğunun sonuçlarını anlamak için AAV aracılı manipülasyonların yararlılığını ve alaka düzeyini vurgulamaktadır.
Burada, ECoG ve EMG elektrot implantasyonunu ve kaydını, bir AAV kullanarak vahşi tip (WT) farelerin serebral korteks alanında cofilin fonksiyonunun manipülasyonu ile birleştiren bir protokol açıklanmıştır. Daha doğrusu, fare kofilinin fosfomimetik formunun (cofilinS3D)kodlama sırasını ifade eden ve 32,33, motor kortekse (M1 ve M2) enjekte edilen bir AAV (serotip9). Enfekte hücrelerin senkronize kortikal aktivitesinin kaydedilmesini sağlamak için doğrudan enjeksiyon bölgesine bir ECoG elektrot yerleştirilir. ECoG/EMG kaydı, iyileşme, adaptasyon ve yüksek cofilinS3D ekspresyonunu sağlamak için ameliyattan üç hafta sonra bozulmamış koşullar altında 24 saat boyunca gerçekleştirilir. Kayıt daha sonra, önceki çalışmalarda açıklandığı gibi uyanıklık durumlarının tanımlanması ve ECoG spektral analizi için kullanılır11,34. Bu metodoloji, kortikal kofilin farelerde uyanıklık ve uyku ECoG sinyallerini nasıl modüle ettiğini özellikle ortaya getirebilir. Elektrofizyolojik kayıtların ve AAV aracılı genetik manipülasyonun bu kombinasyonu, özellikle çeşitli moleküler elementlerin belirli beyin fonksiyonlarındaki rollerini araştırmak için geçerlidir ve her iki cinsiyetin ve hatta diğer türlerin WT ve genetiği değiştirilmiş farelerine ilgi çekici kortikal (ve subkortikal) beyin bölgelerine uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery peparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2125R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-channel connector</td>
			<td>ENA AG</td>
			<td>BPHF2-O6S-E-3.2</td>
			<td>Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Distrelec</td>
			<td>300-93-672</td>
			<td>Potential replacement for discontinued connector above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664 | B6</td>
			<td>Animals bred on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold wire 0.2 mm diameter</td>
			<td>Delta scientific</td>
			<td>920-862-41</td>
			<td>Non-insulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#956;L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion syringe Pump CMA 402</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>CMA8003110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection cannula 28 G</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C313l-SPCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>CA2L9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (10 mg/mL)</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>4550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead-free solder</td>
			<td>AIM</td>
			<td>SN100C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating ophthalmic ointment</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>210889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 50 Catheter thin wall</td>
			<td>Plastics one</td>
			<td>C232CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat fillister head self tapping screws</td>
			<td>MORRIS</td>
			<td>FF00CE125</td>
			<td>ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Weller</td>
			<td>WES51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20 mg/mL)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Intracortical AAV injection with syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7 mm drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-cofilinS3D-HA</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV9-CaMKII&#945;0.4-eGFP</td>
			<td>UPenn Viral Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tippped applicators</td>
			<td>Medicom</td>
			<td>806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic arm</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51604U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical clamps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissor</td>
			<td>Magna Stainless</td>
			<td>M4-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">ECoG/EMG electrode implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (0.3 mg/mL)</td>
			<td>CEVA</td>
			<td>57133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic cement</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Graefe forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-iodine 10%</td>
			<td>Triad disposables</td>
			<td>10-8208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2</td>
			<td>3M</td>
			<td>56849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunofluorescence and ECoG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36-Channel EEG Wearable Headbox</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>832-000350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13-7300</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductors Awg PVC Insulation Cable</td>
			<td>Calmont Wire &#38; Cables</td>
			<td>HC-0819075R0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3724</td>
			<td>Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programmable Amplifier</td>
			<td>LaMONT Medical</td>
			<td>815-000002-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Harmonie</td>
			<td>Natus</td>
			<td>HSYS-REC-LT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel connector</td>
			<td>Crist Instrument Company Inc.</td>
			<td>4-TBC-9-S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrocorticographic recording of cerebral cortex areas manipulated using an adeno-associated virus targeting cofilin in mice

Kemirgenlerde elektrokortikografik (ECoG) kayıtların kullanımı uyku araştırmaları ve çok çeşitli nörolojik durumların incelenmesi ile ilgilidir. Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) beyin devrelerinin ve işlevlerinin anlaşılmasını geliştirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Belirli hücre popülasyonlarının ve/veya hassas moleküler bileşenlerin AAV aracılı manipülasyonu, uyku kaybının olumsuz etkilerine katkıda bulunan yeni uyku düzenleyici devreleri / molekülleri ve anahtar proteinleri tanımlamak için son derece yararlı olmuştur. Örneğin, AAV kullanarak filamentli akin kesen protein cofilin aktivitesini inhibe etmek uyku yoksunluğu kaynaklı hafıza bozukluğunu önler. Burada, kortikal kofilinin uyanıklık ve uyku ECoG sinyallerini modüle edip etmediğini incelemek için serebral korteks bölgesindeki cofilin fonksiyonunun manipülasyonunu ECoG aktivitesinin kaydedilmesiyle birleştiren bir protokol açıklanmıştır. AAV enjeksiyonu, yetişkin erkek ve dişi farelerde ECoG ve elektromiyografik (EMG) elektrotların implantasyonu ile aynı cerrahi işlem sırasında gerçekleştirilir. Fareler uyuşturulur ve kafaları tıraş edilir. Cilt temizliği ve kesiden sonra motor korteksin stereotaksik koordinatları belirlenir ve kafatası bu yerde delinir. Aktif olmayan bir cofilin formu olan AAV ekspresyon cofilinS3Dile önceden doldurulmuş bir kanül kortikal dokuya yavaşça yerleştirilmiştir. AAV infüzyondan sonra, altın kaplı vidalar (ECoG elektrotları) kafatasından vidalanır ve boyun kaslarına (EMG elektrotları) yerleştirilen altın tellerle kafatasına çimentolanır. Hayvanların iyileşmesine ve cofilinS3D'ninyeterli ifadesini sağlamasına üç hafta izin verilir. Enfekte bölge ve hücre tipi immünotipimetri kullanılarak doğrulanır ve ECoG uyanıklık durumlarının görsel tanımlaması ve spektral analiz kullanılarak analiz edilir. Özetle, bu kombine metodolojik yaklaşım, nöronal morfolojiyi ve bağlantıyı düzenleyen moleküler bileşenlerin uyanıklık ve uyku sırasında senkronize serebral korteks aktivitesinin düzenlenmesine kesin katkısının araştırılmasına izin verir.

Elektrofizyolojik kayıtlardan sonra, immünofluoresans AAV enjeksiyonunun enfekte ettiği bölgeyi tanımlamak ve cofilinS3D ekspresyonunun doğrulanmasını sağlamak için kullanılır (Şekil 2). İmmünostaining, daha önce açıklanana benzer bir metodoloji kullanılarak yapılabilir29,37,38,39. AAV, bir anti-HA antikoru ve ikincil bir antikor kullanılarak immünofluoresans ile tespit edilen hemagglutinin (HA)-Tag (cofilinS3D-HA) ile kaynaşmış aktif olmayan bir cofilin formunu ifade eder (Alexa Fluor 488). Enfekte olan eksitatör nöronlar (burada, AAV'de bulunan transjenin ekspresyonını kontrol eden kalsiyum/calmodulin bağımlı protein kinaz II alfa [CamKIIα] promotörü ile hedeflenmiştir) anti-HA antikor ile lekelenmiştir. Başarılı bir enfeksiyon, enjeksiyon bölgesini çevreleyen motor korteksteki nöronların lekelenerek endikedir (Şekil 2A,B). Bu temsili örnekte, diğer yarımkürenin serebral korteksinde gözle görülür bir leke yoktu. Bununla birlikte, uyarıcı nöronların uzak beyin bölgelerine yansıtabildiği göz önüne alındığında, kontrallateral yarımkürede lekeleme mutlaka başarısız enjeksiyonun bir göstergesi değildir. Enfekte bölgenin daha yüksek büyütmesi, hücre gövdelerinin ve projeksiyonlarının lekelendiğini göstererek, hedeflenen kortikal alanın sadece belirli hücrelerinin enfekte olduğunu doğruladı (Şekil 2C).
Hücre tipi özgüllüğünü doğrulamak için uyarıcı nöronların belirteçleri ile birlikte boyama (örneğin, veziküler glutamat taşıyıcı 1, CaMKIIα) da yapılabilir. Alternatif olarak, bu hücrelerin farklı promotörler kullanılarak hedef alınması durumunda inhibitör nöronların veya astrositlerin belirteçleri ile birlikte boyama yapılabilir. CofilinS3D-HA ve CaMKIIα'nın birlikte boyanma işlemi, motor kortekste hala anti-HA lekesi gösteren enjeksiyon bölgesine daha arka bir alan için aynı hayvanda da gerçekleştirildi (Şekil 2D). Bölgenin daha yüksek büyütme görüntüsü, cofilinS3D-HA (Alexa Fluor 488, Şekil 2E)ve CaMKIIα'yı (Alexa Fluor 568, Şekil 2F)açıkça ifade eden hücreleri gösterir. CofilinS3D-HA ve CaMKIIα boyamanın süperpozisypozisi, cofilinS3D-HA için boyanmış hücrelerin çoğunun (hepsi olmasa da) CaMKIIα için de pozitif olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 2G). Bu gözlem, uyarıcı nöronlar için enfeksiyonun özgüllüğünü destekler.
Cofilin manipülasyonunun ECoG aktivitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, uyanıklık durumlarının (uyanıklık, yavaş dalga uykusu, paradoksal uyku) görsel bir tanımlamasını gerçekleştirmek için ECoG ve EMG sinyalleri kullanılır. Bu, fare 2'deki uyanıklık durumundaki hızlı değişiklik nedeniyle4'lüçağlarda ve burada tam bir 24 saat kayıt için yapılır. Standart analizler, daha önce farklı veri kümeleri11 , 12 , 13,28,34için yapıldığı gibi uyku mimarisinin hesaplanması ve spektral analiz değişkenlerini içerir. Özellikle, farklı durumların ECoG sinyalinin spektral analizi durum kompozisyonunu ve kalitesini indeksleyecektir. Örneğin, elektrotların farklı derinliklerinden ortaya çıkabilecek farklılıkları gidermek için, spektral analiz verileri belirli bir hayvanın tüm durumlarının toplam gücüne göre ifade edilebilir (Şekil 3A). Daha yüksek frekanslarda ECoG aktivitesinin çok düşük bağıl genliği göz önüne alındığında, uyanıklık, yavaş dalga uykusu ve paradoksal uyku için göreceli güç spektrumu, aktiviteyi düşük ve yüksek frekanslarda daha yeterli görselleştirmek ve aynı anda karşılaştırmak için log-transforme edilmiştir. Bu analiz, cofilin inaktivasyonu koşullarında spektral aktivitedeki duruma özgü farklılıkları gösterir (Şekil 3B). Daha doğrusu, erkek ve dişi fareleri birleştiren bu ön bulgular, cofilin inaktivasyonunu uyanıklık sırasında hızlı frekanslarda (14-30 Hz) ve paradoksal uyku sırasında yavaş frekanslarda (1-4 Hz) spektral gücü önemli ölçüde artırdığına ve yavaş dalga uykusu sırasında ECoG aktivitesini esas olarak etkilenmeden bıraktığına işaret eder. Ek olarak, cofilin inaktivasyonu ECoG aktivitesinde fareler arası değişkenliği arttırır (özellikle Şekil 3B'deuyanıklık için hata çubuklarından fark edilir).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig01.jpg"> Şekil 1: ECoG/EMG montaj bileşenlerinin hazırlanması ve ECoG elektrot yerleşiminin temsili örneği. (A) Bir ECoG elektrodu: kurşunsuz lehim kullanılarak altın kaplı bir vidanın (1,9 mm kafa çapı, 1,14 mm diş ana çapı, 3,6 mm toplam uzunluk) başına 4 mm uzunluğunda, 0,2 mm çapında altın tel (yalıtımsız) kaynaştırılır. (B) EMG elektrotları: kafatasının boyun kasına kadar olan eğrisini kucaklamak için iki altın tel (1,5 ve 2 cm) kavislidir ve diğer ucu konektöre lehimlenmek üzere düz tutulur. (C) 6 kanallı konektör: Konektörün 6 metal piminin 5'ine (ortadaki bir tane atlanarak) kurşunsuz lehim eklenir (5 mm x 8 mm x 8 mm + 3 mm metal pimler). Konnektörün üst kısmı, çöp / su sızmasını önlemek için bantla kaplıdır. (D) Üç bakım vidasının sol yarımkürenin kafatasına ve sağ yarımküredeki üç ECoG elektrotunun (referans elektrot dahil) konumlandırılmasına örnektir. ECoG elektrotlarının hassas stereotaksik koordinatları 2.6 ve 3.2 adımlarında belirtilir ve bregma ve lambdanın (sarı noktalarla gösterilen) konumuna göre hesaplanmıştır. Kısaltmalar: ECoG = elektrokortikografik; EMG = elektromiyografik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig02.jpg"> Şekil 2: AAV ile enfekte olmuş bölgeyi ve hücre tipini tanımlamak için temsili immünostaining. (A) B panelinde sunulan koronal dilimin enjeksiyon bölgesini gösteren şematik gösterim. Pozisyon bregma için 1,1 mm öndür ve kanül (kırmızı ile gösterilmiştir) sağ birincil motor korteksin (M1) V katmanlarına hedeflenmiştir. Franklin ve Paxinos40'tandeğiştirilmiş temsil. (B) Tam beynin bir koronal dilimi için gösterilen nöronlarda cofilinS3D-HA ekspresyonunun tespit etmek için HA'nın immünostainingi bregma için yaklaşık 1.1 mm ön. Enfekte bölge esas olarak sağ birincil ve ikincil motor kortikallerinin (M1 ve M2) V ve VI katmanlarına (infragranular katmanlar) lokalize olur. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kare, C. (C) Enfekte hücrelerin lekelenmesini gösteren enfekte bölgenin daha yüksek büyütmesini ve motor korteksin daha derin katmanlarında cofilinS3D-HA ifadesini doğrulayan alanı temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Sağ yarımkürenin bregma için yaklaşık 0,5 mm ön ve dolayısıyla enjeksiyon bölgesine arka (B ve C panellerinde olduğu gibi aynı fare) bulunan bir koronal dilimi için gösterilen hücre tipi özgüllüğünü değerlendirmek için HA ve CaMKIIα'nın birlikte immünostainingi. Enfekte bölge motor kortikallere (M1 ve esas olarak M2) lokalizedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kare, E, F ve G.'de gösterilen alanı temsil eder(E) Enfekte hücrelerin lekelenmesini gösteren ve cofilinS3D-HA'nın ekspresyonunun doğrulanan enfekte bölgenin daha yüksek büyüttümü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (F) CaMKIIα pozitif hücrelerin lekelenmesini gösteren enfekte bölgenin daha yüksek büyütmesi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (G) Enfekte hücrelerin CaMKIIα pozitif olduğunu doğrulayan cofilinS3D-HA ve CaMKIIα'nın birlikte etiketlenmesini gösteren enfekte bölgenin daha yüksek büyütmesi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; M1 = birincil motor korteks; M2 = ikincil motor korteks; CPu = kaudat putamen (striatum); LV = lateral ventrikül; HA= hemagglutinin; CamKIIα = kalsiyum/calmodulin bağımlı protein kinaz II alfa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61976/61976fig03.jpg"> Şekil 3: Cofilin fonksiyonunun viral manipülasyonundan sonra elde edilen uyanıklık, yavaş dalga uykusu ve paradoksal uyku için temsili güç spektrumu. Erkek (n = grup başına 5) ve dişi (n = grup başına 2) fareler AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA (viral titer 2.58 ×10 13 GC/mL) veya kontrol AAV ile enjekte (AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP 1.25 ×10 13 GC/mL; bu kontrolün gelişmiş sinyalini kontrol etmek için test titresinin yarısı AAV) motor korteksin V tabakasında 24 saat boyunca kaydedilmiştir, ve elektrokortikografik sinyal spektral analize tabi tutuldu (0.5 ile 30 Hz arasındaki spektral gücü 0.25-Hz çözünürlükte hesaplamak için hızlı Fourier Dönüşümü). (A) Tüm devletlerin toplam gücüne göre ifade edilen üç uyanıklık devleti sırasında güç spektrumları. (B) Daha yüksek frekanslardaki grup farklılıklarını daha yeterli şekilde temsil etmek için dönüştürülen göreli güç spektrumu günlüğü. AAV 9 -CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA kullanılarak motor korteksteki cofilin aktivitesinin bastırılması, uyanıklık sırasında beta aralığındaki (14-30 Hz) elektrokortikografik aktiviteyi önemli ölçüde arttırır, ve delta aralığında (1-4 Hz) paradoksal uyku sırasında kontrol enjeksiyonlarına kıyasla (x eksenlerin üzerindeki kırmızı çizgiler Mann-Whitney U-testini frekans bandı güç p < 0.05'te gösterir). Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs GC = genom kopyaları; HA= hemagglutinin; CamKIIα = kalsiyum/calmodulin bağımlı protein kinaz II alfa; eGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61976/61976fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice at JoVE.com

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

Bu makalede, adeno ilişkili virüsler kullanılarak serebral korteksteki moleküler hedeflerin manipülasyonu ve elektrokortikografik kayıtlar kullanılarak uyanıklık ve uyku sırasında bu manipülasyonun etkilerinin izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Farelerde Cofilin Hedef Alan Adeno İlişkili Bir Virüs Kullanılarak Manipüle Edilen Serebral Korteks Alanlarının Elektrokortikografik Kaydı

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Bu protokol, farklı Vigilin durumları sırasında elektrokortikografik aktivitenin düzenlenmesinde belirli bireysel moleküler hedeflerin rolünü tanımlamak için kullanılabilir. Adeno ilişkili virüs kullanmanın yararları arasında, belirli bir beyin bölgesini ve belirli bir hücre tipini tam olarak hedefleme yeteneği vardır. Protokolü gösteren julien Dufort-Gervais olacak, ekibimden bir araştırma görevlisi.Uyuşturulmış 12 haftalık bir farede parmak sıkışma refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, kulakların arkasından kafanın önüne kadar olan saçları göz aralarında tıraş etmek için bir saç düzeltici kullanın. Dehidrasyonu önlemek için her göze cömert bir oftalmik merhem damlası ekleyin ve farenin başını stereotaksik bir aparat üzerine dikkatlice sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın. Boğulmayı önlemek için dili yavaşça ağızdan çekin.Farenin burnunu cihaza sabitleyin ve kafadaki açıkta kalan cildi sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Cildi ekstra ince Graefe tokaları ile tutarak, cildi kulakların tabanından göz hizasına kadar kesmek için doku makası kullanın ve cildi germek ve kafatasını ortaya çıkarmak için kesiğin her iki tarafına iki cerrahi kelepçe yerleştirin. Beyin dikişlerinden kaçınarak, periosteumu çıkarmak ve iki veya daha fazla yönde üst üste çizgiler oluşturmak için kafatası yüzeyini çizmek için bir makas ucu kullanın.Kemik parçalarını çıkarmak ve kafatasını dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Stereotaksik kola sabitlenmiş daha önce hazırlanmış bir cannula ile bregma ve lambda'nın yerini belirleyin ve her birinin stereotaksik koordinatlarını not edin. Kafatasındaki kanamanın orta çizgiye doğru 1,5 milimetre yanal ve bregma için ön 1,5 milimetrelik konumunu işaretlemek için stereotaksik kolu ve kalemi kullanın.0,7 milimetrelik bir matkap ucu kullanarak, kafatası yüzeyine dik ve dikey eksenle hizalanmış işaretli konumdaki kafatasını dikkatlice delin ve kafatasını% 10 betadin povidone iyot çözeltisine batırılmış steril bir pamuk ucuyla yıkayın, ardından kanülü tek bir mikrolitre hava kabarcığı ile yüklemek için 10 mikrolitrelik bir şırınganın pistonunu bir mikrolitre geri çekin. Daha sonra, ilgi çekici AAV karışımını yavaş pipetleme ile karıştırın ve karışımın 1,7 mikrolitresini steril bir Petri kabına ekleyin. Çözeltinin 1,5 mikrolitresini kanolaya yüklemek ve hava kabarcığı konumunu bağlı PE50 tüpüne işaretlemek için bu şırıngayı kullanın.Canülleri kafatasındaki delik ile dikey olarak hizalayın, böylece canül kemiğin üst kenarına ulaşır ve kafatası yüzeyinin Z koordinatını işaretler. Uç kafatası yüzeyinin 1,5 milimetre altına ve motor korteksinin beş katına ulaşana kadar kanülleri yavaşça küçümseyin ve şırınga pompasını dakikada 0,025 mikrolitreden başlatarak 40 dakikadan fazla bir AAV mikrolitresi sunun. Enjeksiyonu izlemek için tüpteki hava kabarcığı kullanın, gerektiğinde herhangi bir ayarlama yapın.Tüm virüs hacmi teslim edildiğinde, yeterli bir difüzyon sağlamak ve kanülleri korteksten çıkarmak için stereotaksik kolu yavaşça ve dikkatlice kaldırmadan önce geri akışı önlemek için kanülü beş dakika boyunca yerinde bırakın. Elektrot implantasyonu için, düz bir altın tel ile bir elektrokortikografik elektrodu yavaşça AAV'nin enjekte edildiği deliğin dikey eksenine vidalamak için düz Kelly forseps kullanın, dura ve serebral korteksteki hasarı en aza indirmek için kafatasının dışında en az 2,5 milimetre vida bırakın. Referans elektrodun orta hatta 2,6 milimetre yanal sağ ve bregma için 0,7 milimetre posterior konumunu ve arka elektrokardiyografik elektrodun orta hatta 1,5 milimetre yanal sağ ve lambda'ya 1,5 milimetre ön ve sol yarımküredeki üç bakım vidasının konumunu belirli koordinatları olmadan işaretlemek için bir kalem kullanın, ama birbirlerinden ve elektrokortikografik elektrotlardan mümkün olduğunca uzak.Diğer elektrotların ve vidaların işaretli konumlarında kafatası yüzeyine dik kafatasını dikkatlice delmek ve delinmiş kafatasını% 10 povidon iyot çözeltisi ile yıkamak için matkabı kullanın. Kanamayı ve kirlenmeyi önlemek için vidaları takmadan önce küçük yuvarlanmış hassas görev silme parçalarıyla delikleri tıkayın ve vidaları deliklerin delindiği açıyla matkap deliklerine yerleştirmek için düz Kelly önlükleri kullanın. Vidaların içindeki halka benzeri alanın ortasına birkaç küçük damla diş çimentosu yerleştirin ve cildi boyun kaslarının üzerine kaldırmak için ekstra ince Graefe tokmakları kullanın.Dumont'un beş numaralı asaletini kullanarak, bir elektromiyografik elektrotunun kavisli ekstremitesini tutun ve kaslara yaklaşık bir ila iki milimetre yerleştirin. Elektrodun kavisli tarafını ve katlama noktasını diş çimentosuna yerleştirin ve ikinci elektromiyografik elektrodu aynı şekilde yerleştirin. Hayvanın gözlerini kapattıktan sonra, çimentoyu katılaştırmak için üç ila beş dakika ışık uygulayın ve elektrokortikografik elektrotların tabanını ve çapa vidalarını taç şeklinde bir kontur oluşturmak için örtmek için ek diş çimentosu kullanın.Üç ila beş dakika daha ışık uyguladıktan sonra, montajın merkezini akrilik çimento ile doldurun ve cerrahi kelepçeleri çıkarın. Montajın önündeki ve arkadaki cildi kapatmak için sentetik emilebilir bir monofilament dikiş kullanın, böylece kafatası açıkta kalmaz ve elektrotların altın tellerini konektör pimleriyle dikkatlice hizalamak için konektörü montajın üzerinde tutmak için kavisli önlükler kullanın, ardından her elektrot ekstremitesini tek bir ilgili konektör pimine hızla lehimlayın. Fareyi çerçeveden çıkardıktan sonra, konektör ve kafa arasındaki boş boşluğu akrilik çimento ile örtün.Tartımdan sonra, fareyi bir ısı yastığının üzerine mesh edilmemiş bir kapakla temiz bir kafese yerleştirin. Ameliyattan iki hafta sonra, fareleri kayıt kablolarına bağlayın ve en az bir hafta sonra, elektrokortikografik ve elektromiyografik sinyalleri 24 saat veya daha fazla kaydedin. Başarılı bir enfeksiyon, enjeksiyon bölgesini çevreleyen motor korteks içindeki nöronların HA lekesi ile doğrulanır ve cofilin S3D HA'nın varlığını gösterir. Uyarıcı nöron işaretçisi CaMKII alfa ile birlikte lekelenme, yüksek büyütme altında net cofilin S3D HA ve CaMKII alfa birlikte ifadesini gösterir.Uyanıklık, yavaş dalga uykusu ve paradoksal uyku için kütüğe dönüştürülmüş göreceli güç spektrumu, cofilin inaktivasyonu altındaki spektral aktivitede duruma özgü farklılıklar göstermektedir. Elektrokortikografik kayıt ve hassas moleküler hedeflerin AAV aracılı manipülasyonunun kombinasyonu, birden fazla beyin bölgesi ve uykuya ek olarak epilepsi veya hafıza üzerine araştırma gibi diğer sinirbilim alt alanları için de geçerlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...